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肠道病毒71型VP1蛋白毒力候选位点的筛选及其对病毒复制能力的影响

肠道病毒71型VP1蛋白毒力候选位点的筛选及其对病毒复制能力的影响

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作者：庄志超山东大学

学位级别：硕士

手足口病是由多种肠道病毒引起的病毒性传染病,主要感染五岁及以下婴幼儿,可导致患者出现发热以及手足口周的疱疹等临床症状,严重时可出现无菌性脑膜炎以及神经源性肺水肿等一系列神经系统的并发症,甚至可以导致患者死亡。目前手足口病... 详细信息

手足口病是由多种肠道病毒引起的病毒性传染病,主要感染五岁及以下婴幼儿,可导致患者出现发热以及手足口周的疱疹等临床症状,严重时可出现无菌性脑膜炎以及神经源性肺水肿等一系列神经系统的并发症,甚至可以导致患者死亡。目前手足口病在全球尤其是亚太地区广泛流行,已成为重要的公共卫生焦点问题。肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)属于小RNA病毒科肠道病毒属,是导致手足口病的主要病原体之一,也是目前最主要的导致手足口病重症或死亡的病原体,已成为目前全球范围内最主要的婴幼儿中枢神经毒性病原。目前,EV71导致患者神经系统病变的致病机制尚不明确,有研究显示在病毒基因组多个区域存在有影响病毒神经毒力的位点。本研究通过对手足口病患者以及密切接触者的标本进行病毒分离鉴定和序列分析,捕捉到EV71在自然传播过程中的变异,在VP1上筛选出2个毒力候选位点,利用反向遗传技术构建并拯救VP1置换的重组病毒SDLY107-VP1株,研究VP1蛋白毒力候选位点在EV71致病机制中的作用。目的:1.从手足口病患者以及密切接触者标本中分离EV71,并进行序列分析,捕捉EV71在自然传播过程中的变异,筛选毒力候选位点;2.将两株EV71不同毒力表型株的VP1区进行置换,构建并拯救出重组病毒;3.比较亲本株与重组病毒之间在复制能力、致细胞损伤以及自噬等方面的差异,探究VP1区的毒力候选位点在EV71致病机制中的作用。方法:1.将采集自2015年山东省济宁市手足口病患者及密切接触者的标本处理后使用RD细胞进行病毒分离,并使用PCR特异性鉴定引物进行鉴定;2.使用基于EV71病毒基因组设计的全序列扩增引物对新分离到的病毒进行全序列扩增并测序,对获得的病毒基因组全序列使用DNAstar7.1和MEGA6软件进行序列分析;3.设计引物并通过融合PCR的方法获得弱毒株VP1片段,并将其置换到强毒株SDLY107株中,构建并拯救重组病毒SDLY107-VP1株,通过观察细胞病变、PCR扩增以及间接免疫荧光实验对重组病毒进行鉴定,使用50%终点法以及空斑试验对病毒滴度进行测定;4.使用SH-SY5Y细胞、U87细胞以及Vero细胞对重组病毒及其亲本病毒的复制能力、致细胞损伤作用以及致细胞自噬能力进行研究。结果:1.从手足口病患者及其密切接触者粪便标本中分离到两株EV71病毒,命名为SDJN2015-01株以及SDJN2015-01.1株,序列以及遗传进化分析显示,两株病毒同属于EV71 C4a亚型,是我国近年来流行的优势亚型;2.两株病毒存在6个氨基酸突变,其中VP1蛋白上存在2个氨基酸位点的差异,分别为K98E(全编码区为K663E)和A133T(A698T);2C蛋白上存在4个氨基酸的差异,分别为 D48N(D1159N)、V126I(V1237I)、I238V(I1349V)和 N314Y(N1425Y);3.成功拯救出重组病毒SDLY107-VP1株,并对其滴度进行测定;4.重组病毒SDLY107-VP1株在U87细胞以及Vero细胞上的复制能力、致细胞损伤作用以及引起细胞自噬的能力与SDLY107株和SDJN2015-01株没有明显的区别,但在神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞上,重组病毒SDLY107-VP1株失去了引起细胞病变的能力,病毒在细胞能复制能力大大降低,没有导致SH-SY5Y细胞明显的细胞损伤,同时也没有引起SH-SY5Y细胞明显的细胞自噬发生,这与强毒株SDLY107株明显不同,与弱毒株SDJN2015-01株的表现类似。结论:1.从2015年山东省济宁市手足口病患儿及密切接触者中成功分离到EV71,新分离到的EV71毒株属于C4a亚型,与我国近年来流行的优势型相一致。2.成功构建并拯救出重组病毒SDLY107-VP1株,并发现EV71病毒VP1蛋白区域存在影响病毒神经毒力的氨基酸位点,其中第146位(缬氨酸→异亮氨酸)、第147位(缬氨酸→丙氨酸)氨基酸位点的突变影响了病毒对神经细胞的感染能力和致细胞损伤能力,突变病毒在神经细胞上的增殖能力和诱导细胞自噬的水平明显改变。

关键词：肠道病毒71型遗传进化分析 VP1蛋白神经毒力位点细胞自噬

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