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淫羊藿苷对人牙髓干细胞神经向分化作用的初步研究

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中国现代医学杂志 2023年第15期33卷 46-52页

作者：张欣然李昊天杨文文黎淼刘俊平唐路赵颖首都医科大学宣武医院口腔科北京100053 首都医科大学宣武医院骨科北京100053

目的探讨淫羊藿苷(ICA)对人牙髓干细胞(DPSC)神经向分化的作用。方法分离培养DPSCs后,采用不同浓度ICA(0.01μmol、0.10μmol、1.00μmol、10.00μmol)处理DPSCs。CCK-8法检测ICA对细胞增殖活力的影响,确定其最佳促DPSCs增殖浓度。分别... 详细信息

目的探讨淫羊藿苷(ICA)对人牙髓干细胞(DPSC)神经向分化的作用。方法分离培养DPSCs后,采用不同浓度ICA(0.01μmol、0.10μmol、1.00μmol、10.00μmol)处理DPSCs。CCK-8法检测ICA对细胞增殖活力的影响,确定其最佳促DPSCs增殖浓度。分别进行细胞形态学观察和Nestin细胞免疫荧光检测。Western blotting检测DPSCs神经向分化相关蛋白Nestin、βⅢ-tubulin及NSE的表达。结果不同浓度ICA细胞相对活力值比较,差异有统计学意义(P神经球的直径增加(P神经向分化能力。

关键词：淫羊藿苷牙髓干细胞神经向分化

银杏叶提取物对人脂肪间充质干细胞神经向分化的影响

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神经解剖学杂志 2013年第5期29卷 543-551页

作者：李珊梁战华刘晶大连医科大学附属第一医院神经内科大连116011 大连医科大学附属第一医院再生医学应用研究中心大连116011

目的:为了观察银杏叶提取物(extract of Ginkgo biloba,EGb761)对人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived stem cells,hADSCs)增殖及神经向分化的影响。方法:利用CCK-8法检测不同浓度EGb761作用下hADSCs的增殖情况;并用含有不同浓度EGb761的联合神经诱导因子诱导hADSCs向神经分化。结果:EGb761对hADSCs增殖的影响具有时间差异性,1 d时无明显差异(P>0.05),3 d时显著促进(P0.05);含有不同浓度EGb761的联合诱导因子促进hADSCs发生神经向分化。与阳性对照组相比,各时间点均促进巢蛋白(Nestin)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达(P神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达与阳性对照无差异(P>0.05)。结论:EGb761对hADSCs的增殖有促进作用,3 d时促进作用明显;EGb761显著促进hADSCs的神经向分化,不促进其向胶质样细胞分化。

关键词：银杏叶提取物人脂肪间充质干细胞增殖神经向分化

银杏叶提取物（EGb761）对人脂肪间充质干细胞神经向分化的影响

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银杏叶提取物（EGb761）对人脂肪间充质干细胞神经向分化的影响

作者：李珊大连医科大学

学位级别：硕士

目的：观察银杏叶提取物（EGb761）对人脂肪间充质干细胞（hADSCs）增殖及神经向分化的影响。方法：用CCK-8法检测不同浓度EGb761（40mg/L、80mg/L、120mg/L）作用下hADSCs的增殖情况;含有不同浓度EGb761（40mg/L、80mg/L、120mg/L）... 详细信息

目的：观察银杏叶提取物（EGb761）对人脂肪间充质干细胞（hADSCs）增殖及神经向分化的影响。方法：用CCK-8法检测不同浓度EGb761（40mg/L、80mg/L、120mg/L）作用下hADSCs的增殖情况;含有不同浓度EGb761（40mg/L、80mg/L、120mg/L）的联合神经诱导因子（20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF、20ng/ml BDNF）对hADSCs神经向诱导分化，观察形态学变化，免疫荧光检测Nestin、NSE、GFAP于3d、7d、10d、14d的表达情况，计数阳性细胞率。结果：EGb761对hADSCs增殖的影响具有时间差异性，1d时无明显差异，3d时显著促进，5d时促增殖趋于平缓，7d时细胞有增殖，但增殖幅度减小;含有不同浓度EGb761的联合诱导因子促进hADSCs的形态学发生神经向分化，与阳性对照组相比各时间点均促进Nestin的表达，且有浓度依赖趋势;促进NSE的表达，无明显浓度依赖;GFAP的表达与阳性对照无差异。结论：EGb761对hADSCs的增殖有促进作用，3d时促进作用明显;EGb761显著促进hADSCs的神经向分化，不促进向胶质样细胞分化。

关键词：银杏叶提取物人脂肪间充质干细胞神经向分化

VEGFA对大鼠牙髓干细胞增殖和神经向分化的影响

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VEGFA对大鼠牙髓干细胞增殖和神经向分化的影响

作者：徐婉秋哈尔滨医科大学

学位级别：硕士

背景及目的:神经损伤及退行性疾病常常导致患者的残疾和死亡。目前,该类疾病治疗方法有限,患者预后较差,故寻找一种高效、精准的治疗方法迫在眉睫。牙髓干细胞(DPSCs)克隆形成能力强,可向肌肉、骨、脂肪等方向分化,此外,因其来源于神经... 详细信息

背景及目的:神经损伤及退行性疾病常常导致患者的残疾和死亡。目前,该类疾病治疗方法有限,患者预后较差,故寻找一种高效、精准的治疗方法迫在眉睫。牙髓干细胞(DPSCs)克隆形成能力强,可向肌肉、骨、脂肪等方向分化,此外,因其来源于神经嵴细胞的分化与迁移,故相较于其他间充质干细胞(MSCs)具有更强的神经向分化能力。血管内皮生长因子(VEGF)A不仅可以增加血管的新生与再生能力,还具有营养和保护神经的作用。VEGFA还可以增加MSCs分泌的神经营养因子的表达,调节细胞间微环境,加速损伤后的神经恢复功能。本研究旨在探索VEGFA对大鼠DPSCs增殖和神经向分化能力的影响,为利用DPSCs治疗神经系统疾病提供实验基础。方法:分离并培养原代大鼠DPSCs;通过流式细胞术及多向分化实验对获得的DPSCs进行验证;构建VEGFA过表达的慢病毒载体后转染DPSCs,筛选稳定株并验证转染效率;CCK8法检测VEGFA对DPSCs增殖的影响;经成神经诱导分化培养基诱导7天后,采用实时荧光定量PCR法(q PCR)、蛋白质印迹(WB)和免疫荧光(IF)实验检测神经标志物Nestin、β3-Tubulin和S100β的表达,评价VEGFA对大鼠DPSCs神经向分化的影响。结果:流式细胞术显示被检测细胞CD44和CD55表达阳性率高于95%,CD34和CD45表达阳性率低于2%;茜素红染色法和油红O染色法结果表明细胞具有成骨和成脂的多向分化潜力,进而证明DPSCs已被成功提取及培养。CCK8结果显示实验组(携带VEGFA基因的慢病毒成功转染后的大鼠DPSCs)在3、5、7、9天的增殖能力明显增强。q PCR和WB结果显示,促DPSCs-VEGFA组(携带VEGFA基因的慢病毒成功转染后的大鼠DPSCs,经成神经诱导分化培养基培养7天)的三种神经标志物(Nestin、β3-Tubulin和S100β)的表达较促DPSCs组(未经转染的大鼠DPSCs经成神经诱导分化培养基培养7天)相比显著升高;IF结果显示促DPSCs-VEGFA组中三种神经标志物的荧光强度最强。结论:VEGFA可以促进对大鼠DPSCs的增殖能力;VEGFA能提高大鼠DPSCs体外神经向分化的潜力,增加神经标志物的表达。

关键词：大鼠牙髓干细胞血管内皮生长因子A 增殖神经向分化

比较牙髓干细胞和牙周膜干细胞的神经向分化能力以及对脑缺血模型的治疗效果

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比较牙髓干细胞和牙周膜干细胞的神经向分化能力以及对脑缺血模型...

作者：徐婉婷安徽医科大学

学位级别：硕士

背景:干细胞疗法在临床中风研究领域中被认为是一种有前途的疗法。最近的多项研究报道,自1980年代以来,缺血性中风的发病率呈上升趋势,尤其是在较年轻的群体中。在成年人牙齿中,牙髓干细胞（DPSCs）和牙周膜干细胞（PDLSCs）是比较容易... 详细信息

背景:干细胞疗法在临床中风研究领域中被认为是一种有前途的疗法。最近的多项研究报道,自1980年代以来,缺血性中风的发病率呈上升趋势,尤其是在较年轻的群体中。在成年人牙齿中,牙髓干细胞（DPSCs）和牙周膜干细胞（PDLSCs）是比较容易获得的两种干细胞。但是,目前还没有报道详细叙述在对缺血性中风的治疗方案中,使用DPSCs或PDLSCs治疗是否为最合适的一种方法,也尚未深入研究这两种干细胞对中风的治疗作用和相关机制。方法:本研究通过体外培养获得了DPSCs和PDLSCs,并将两种干细胞进行神经向诱导分化,后通过RT-PCR,免疫荧光,Giemsa染色和western blotting等方法评估了DPSCs和PDLSCs的分化能力。与此同时我们还进行了转染实验,以证实在过表达或敲除信号分子后DPSCs和PDLSCs在分化为神经样细胞过程中的相关机制。随后,我们建立了大鼠脑缺血模型。将使用PKH26标记的DPSCs和PDLSCs通过尾静脉注射的方法移植到大鼠模型体内,以追踪干细胞迁移结果。最后,观察两种细胞的修复效果,并通过TTC染色,免疫荧光和改良神经系统严重程度评分（m NSS）等方法检测并进行比较,以评估神经功能的恢复情况。结果:对多种实验结果进行比较后显示,PDLSCs与DPSCs相比具有更高的神经向分化能力。免疫荧光研究表明,在对两种细胞进行神经向诱导后,PDLSCs中的神经元分化标记Thy-1（主要在细胞质中）的表达高于DPSCs,其他神经细胞特异性基因也显示出相似的趋势,这一点已通过Western blot证实。在此过程中,Notch和Wnt信号通路分别被抑制和激活。最后,我们建立了局灶性脑缺血动物模型来检测PDLSCs和DPSCs对缺血性疾病的修复作用。结果表明,与DPSCs注射组相比,PDLSCs注射组能够看到更加明显的PKH26标记的荧光信号。PDLSCs与DPSCs相比可能能够更有效地促进神经功能的恢复。结论:因此,PDLSCs是一种自体来源的具有理想生物学特性的成人间充质干细胞（MSCs）,并且可能是临床治疗应用的理想候选者。总之,使用PDLSCs治疗中风疾病可增强神经功能的恢复,并为干细胞治疗局灶性脑缺血提供基础。

关键词：牙髓干细胞牙周膜干细胞脑缺血神经向分化

正常及炎症环境下激活肝X受体β促牙髓干细胞神经向分化的研究

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正常及炎症环境下激活肝X受体β促牙髓干细胞神经向分化的研究

作者：申智恩山东大学

学位级别：硕士

背景及目的牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)是已被广泛应用在体外多谱系分化研究的间充质干细胞之一,表达神经谱系标记如巢蛋白(nestin),微管蛋白β3(β-Ⅲ-tubulin,TUJ1)和神经核蛋白等,具有在体外神经向分化后用于干细胞移... 详细信息

背景及目的牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)是已被广泛应用在体外多谱系分化研究的间充质干细胞之一,表达神经谱系标记如巢蛋白(nestin),微管蛋白β3(β-Ⅲ-tubulin,TUJ1)和神经核蛋白等,具有在体外神经向分化后用于干细胞移植治疗神经退行性疾病的潜力。移植治疗的种子细胞被期望具备两方面特点:一方面可改善神经元存活和生长,另一方面调节炎症以修饰干细胞龛,从而促进病理状态下的神经再生。DPSCs在体外神经向分化的效率亟待提高,国内外学者尚未就标准的移植前体外处理方案达成共识。肝X受体(liver X receptors,LXRs)主要功能是调节胆固醇稳态、脂肪生成和炎症,LXRβ在神经组织中富集表达,其参与的代谢活动也影响多巴胺能神经元的存活和生理活动,LXRβ的上调可能提高骨髓间充质干细胞、牙髓干细胞神经谱系标记物基因表达水平。此外,LXRs具有调节炎症和免疫反应的作用,能改善人脂肪干细胞在炎症环境下的存活率。激活LXRβ相关通路在诱导干细胞分化领域的应用研究较少,炎症微环境对干细胞特性产生的附加影响也有待探讨。本研究旨在明确LXRβ的激活是否参与调控炎症环境下DPSCs的体外神经向分化,并筛选出能达到促神经向分化和抗炎作用的最佳效应的激动剂及其剂量,以期为基于DPSCs进行神经再生与抗炎联合治疗提供理论参考。实验方法***β在牙髄组织细胞中的表达与激活制作人牙髓组织切片,免疫荧光染色观察LXRβ在牙髓组织中的表达;分离、培养人牙髓细胞并鉴定其成骨、成脂分化潜能及间充质干细胞相关表面标记物;梯度剂量0.5/1/5/10 μM的LXRs激动剂GW3965和T0901317处理细胞后CCK-8检测细胞活力,并于神经诱导培养3、7、14天后qRT-PCR检测各组LXRβ的激活情况。***β激活水平对DPSCs神经向分化的影响体外培养DPSCs分为普通培养的Control组,神经基础培养的N-A组,神经基础培养基中分别加入0.5/1/5/10 μM梯度剂量GW3965和T0901317的药物处理组。培养3、7、14天后qRT-PCR、Western blot分别检测神经元标记物的基因、蛋白表达水平。***诱导的炎症微环境下LXRβ激活情况及其对DPSCs神经向分化的调控DPSCs 同上分组诱导6天后加入LPS刺激24 h诱导炎症微环境,qRT-PCR检测各组LXRβ基因激活水平和炎症因子、神经元标记物的基因表达水平。***诱导的炎症微环境下内源性敲减LXRβ对DPSCs神经向分化的调控LXRβ敲减慢病毒以最佳感染复数感染LPS刺激处理的DPSCs,72 h后qRT-PCR检测LXRβ基因下调效率及炎症因子、神经元标记物的基因表达水平。结果***β在成人牙髓组织中表达;体外单克隆分离培养的人DPSCs具有多向分化潜能;0.5/1/5/10 μM剂量的GW3965和T0901317对人DPSCs无明显毒性,且能使细胞内LXRβ呈剂量依赖性激活。***3965和T0901317处理能显著上调大部分神经元相关标记物基因和蛋白表达水平,上调趋势与LXRβ激活水平大部分具有一致性;***诱导的炎症条件下,5 μM/10 μM中高剂量的GW3965和T0901317使LXRβ呈剂量依赖性激活,炎症对LXRβ激活水平无显著影响;中高剂量GW3965和T0901317对DPSCs在LPS刺激后炎症因子表达的上调有部分回复作用;炎症条件下LXRβ的激活仍可促进DPSCs神经向分化,10 μM高剂量GW3965和T0901317对炎症导致的神经元标志物表达下调有部分回复作用。***经慢病毒感染后LXRβ表达平均下调80.24%,LPS诱导炎症水平较空载对照组显著升高,神经元标志物表达存在部分降低趋势。结论1.人牙髓组织中表达LXRβ,DPSCs中LXRβ的激活能促进DPSCs在正常和炎症状态下神经向分化,并下调炎症因子水平。2.5 μM、10 μM剂量的T0901317和GW3965经过7天诱导能稳定、高效地激活LXRβ并发挥促进DPSCs神经向分化及炎症抑制的作用。

关键词：人牙髓干细胞肝X受体神经向分化诱导分化炎症反应

梓醇静电纺丝载药支架诱导人体脂肪间充质干细胞神经向分化作用研究

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梓醇静电纺丝载药支架诱导人体脂肪间充质干细胞神经向分化作用研...

作者：郭建辉大连医科大学

学位级别：硕士

目的:制备出负载不同浓度梓醇（catalpol）的静电纺丝载药支架,研究不同浓度梓醇对静电纺丝纤维的微观形貌、直径分布、孔隙率和干湿两种条件下力学性能方面的影响,以及负载的梓醇在不同时间点的释放情况,并观察梓醇静电纺丝载药纤维支... 详细信息

目的:制备出负载不同浓度梓醇（catalpol）的静电纺丝载药支架,研究不同浓度梓醇对静电纺丝纤维的微观形貌、直径分布、孔隙率和干湿两种条件下力学性能方面的影响,以及负载的梓醇在不同时间点的释放情况,并观察梓醇静电纺丝载药纤维支架对脂肪干细胞（adipose-derived stem cells,ASCs）的神经向诱导分化作用。方法:本实验主要分为三大部分:（1）选取已经确定的混纺静电纺丝纤维的各种成分的质量体积分数:聚乳酸羟基乙酸共聚物（PLGA）为15%（w/v）、丝素蛋白（SF）为10%（w/v）、多壁碳纳米管（multi-walled carbon nanotubes,MWCNTs）为0.2%（w/v）,再加入不同质量的梓醇制备成含梓醇质量体积比为1、2、3、4、5mg/ml（w/v）的载药电纺纤维（实验组）。不含有梓醇的静电纺纤维作为对照组。利用扫描电镜观察电纺纤维的表观形貌,运用红外图谱分析梓醇与混合物之间的作用,通过X射线衍射分析梓醇对电纺纤维的化学影响。（2）利用Image J软件计算电纺纤维的直径,比较不同浓度梓醇下纤维直径分布情况;利用Origin软件对电纺纤维的孔隙率进行分析;将材料在力学检测仪上进行检测,评价不同浓度梓醇电纺纤维的杨氏模量、极限应变、屈服强度指标;利用高效液相色谱仪分析载药纤维中梓醇在不同的时间点的释放情况。（3）将脂肪干细胞分别接种到实验组和对照组,并把平板培养的脂肪干细胞作为平板培养组（TCP组）。在3天和5天两个时间点分别进行Hoechst33258细胞核染色和βIII-tubulin、Nissl免疫荧光复合染色,并计数βIII-tubulin、Nissl阳性细胞比例,观察不同实验组间及对照组在不同时间点ASCs的神经向分化情况。在诱导3天时将细胞消化下来,利用Real-time PCR和Western blot检测诱导细胞内的βIII-tubulin基因表达情况。结果:1.成功将不同浓度梓醇通过静电纺丝方法制成混纺载药纤维,纤维表面基本光滑,无串珠和表面颗粒出现;梓醇与聚合物成份只是物理的混合,没有发生化学作用。2.对载药纳米纤维的直径、孔隙率和力学结果研究表明,加入梓醇后纤维直径变细,而孔隙率则增大,并且其力学性能也得到增强,其中4mg/ml浓度组较其它组的综合性能更加优良;3.通过药物释放行为检测,表明混纺梓醇电纺纤维支架能够在一定时间内持续释放梓醇,但出现初始暴释现象;4.不同浓度的梓醇载药电纺纤维支架具有诱导ASCs神经向分化的作用,细胞免疫荧光染色、RT-PCR检测和Western blot检测都表明,梓醇浓度在4mg/ml组时诱导效果最明显。结论:将天然中药成分梓醇作为负载药物,与聚合物混纺,能够成功制备出不同浓度载药电纺纤维,且不影响梓醇药物活性,释放出的梓醇能够诱导脂肪间充质干细胞向神经向分化（βIII-tubulin、Nissl表达阳性）,研究证实利用梓醇负载的纳米纤维支架可构建出一个三维条件下定向诱导干细胞神经向分化的药物释放体系。

关键词：静电纺丝梓醇脂肪间充质干细胞神经向分化

SFRP2在调控人牙髓干细胞神经向分化中的作用研究

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SFRP2在调控人牙髓干细胞神经向分化中的作用研究

作者：胡月吉林大学

学位级别：硕士

各种原因引起的视神经损伤性疾病在临床上较为常见,其中部分疾病会造成视神经进行性、不可逆性损伤,最终导致视力丧失。视神经细胞是一种终末分化细胞,再生能力差,导致损伤的视网膜神经难以修复再生,目前临床尚无有效方法治愈视神经疾... 详细信息

各种原因引起的视神经损伤性疾病在临床上较为常见,其中部分疾病会造成视神经进行性、不可逆性损伤,最终导致视力丧失。视神经细胞是一种终末分化细胞,再生能力差,导致损伤的视网膜神经难以修复再生,目前临床尚无有效方法治愈视神经疾病。近年来,应用干细胞治疗视网膜神经疾病这一方法极具前景,牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)由于其与视神经细胞同样来源于神经嵴,且较神经干细胞更易获得,而有望成为修复重建神经组织病损的种子细胞。目前研究认为,Notch及Wnt/β-catenin信号通路是脊椎动物视网膜神经发育所必需的。作为一种广泛表达于多个物种且在进化过程中高度保守的基因,Notch基因主要参与对细胞分化的抑制信号。Wnt/β-catenin信号的激活贯穿视网膜及视神经发育的整个过程,提示其在神经发育中起重要作用。分泌性卷曲蛋白2(secreted frizzled related protein 2,SFRP2)是一种Wnt信号通路抑制剂,同时也间接地参与了除Wnt信号以外的多个信号通路,如Notch及BMP信号通路等。SFRP2可与金属蛋白酶ADAM10结合,抑制Notch信号通路。已有研究表明SFRP2在神经形成过程中高表达,我们推测其可能通过抑制在干细胞增殖过程中发挥重要作用的Notch及Wnt信号通路,促进神经嵴来源的DPSCs向神经样细胞分化。为了验证上述假设,本课题借助多种细胞生物学和分子生物学手段,通过重组腺病毒载SFRP2基因体外转染人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,h DPSCs),同时利用h DPSCs同视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞共培养法诱导h DPSCs的神经向分化,明确SFRP2在h DPSCs向神经样细胞分化过程中的作用,初步探讨视神经修复再生机制及临床应用前景。方法:从完整拔除的健康第三磨牙内分离牙髓组织,酶消化复合组织块法原代培养h DPSCs。取第3代h DPSCs,MTT法绘制其生长曲线,并通过成脂及成骨诱导检测其多向分化潜能。通过流式细胞术和细胞毒性实验(MTT法)筛选合适的病毒感染复数(multiplicity of infection,MOI)。采用800 particles/cell的Ad-SFRP2转染h DPSCs,RT-PCR检测SFRP2的表达;并将转染Ad-SFRP2的h DPSCs与人RPE细胞共培养诱导其神经向分化,q PCR检测神经相关基因GFAP、Nestin、MAP2、HES1、β-3tublin及ATOH7的表达。结果:倒置显微镜下见体外培养的第3代h DPSCs贴壁生长,形态规则,呈长梭形,核圆,位于中央。甲苯胺蓝染色可见细胞成集落生长,分别进行成脂和成骨诱导,35天油红O染色及21天茜素红染色可见脂滴及钙结节。生长曲线显示第4天细胞由滞留期进入对数生长期,第9天细胞进入平台期。转染Ad-EGFP的h DPSCs在转染后8 h镜下即可见绿色荧光蛋白的表达,转染Ad-SFRP2的h DPSCs在转染后72 h提取总m RNA,RT-PCR检测到SFRP2基因的表达。共培养及Ad-SFRP2转染结果表明,GFAP的表达早期表现为共培养诱导组高于转染组,晚期则表现转染组稍高表达;Nestin早期在共培养诱导组及转染组中表现为一定的上调趋势,晚期表达则呈下调趋势;β-3tublin的表达在共培养诱导组及转染组中呈持续性下调;MAP2在共培养诱导组晚期呈现较高表达;HES1在共培养诱导组早期呈现较高表达,晚期则表达降低,在转染组较非转染组呈下降趋势;ATOH7的表达在各组均无统计学意义。结论:SFRP2可以促进牙髓干细胞的神经向分化,但具体机制有待于进一步实验阐明。

关键词：牙髓干细胞 SFRP2 神经向分化

一种诱导牙髓干细胞神经向分化的有效方法和诱导时间的探索

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口腔材料器械杂志 2023年第1期32卷 32-39页

作者：杨紫菡潘乙怀邹多宏温州医科大学口腔医学院附属口腔医院牙体牙髓病科温州325000 上海交通大学医学院附属第九人民医院上海200011

目的建立一种简单而高效的诱导牙髓干细胞(DPSC)向神经向分化的方法。方法使用酶消化法分离原代DPSC,通过流式细胞术表征表面标志物以及三系诱导分化鉴定其多向分化潜力。添加20 ng/mL bFGF和20 ng/mL EGF的单层培养方法诱导DPSC向神... 详细信息

目的建立一种简单而高效的诱导牙髓干细胞(DPSC)向神经向分化的方法。方法使用酶消化法分离原代DPSC,通过流式细胞术表征表面标志物以及三系诱导分化鉴定其多向分化潜力。添加20 ng/mL bFGF和20 ng/mL EGF的单层培养方法诱导DPSC向神经向分化,通过Western Blot、q-PCR检测神经相关标志物随诱导时间增加发生的改变,通过免疫荧光染色检测表面标志物改变。通过止血钳夹闭的方式构建大鼠坐骨神经损伤模型,胰酶消化收集诱导6d的dDPSC,注射到损伤处,4周后通过HE染色和免疫荧光染色检测神经修复情况。结果获取的DPSC经流式细胞术、三系诱导分化鉴定,符合间充质干细胞特征。Western Blot、q-PCR结果表明Nestin、GFAP随诱导时间增加而上升,在6~9 d趋于稳定。细胞免疫荧光染色结果显示dDPSC的CD73、CD146表达下降,而Nestin、GFAP的表达升高。HE染色显示,PBS组的坐骨神经损伤严重,发生神经变性,而dDPSC组的神经组织结构与对照组类似。NF200/S100β的免疫荧光染色结果显示dDPSC组轴突和髓鞘再生情况优于PBS组。结论酶消化法分离得到的DPSC纯度良好,通过添加20 ng/mL bFGF和20 ng/mL EGF培养的单层培养法培养6 d可以诱导DPSC向神经前体细胞分化,dDPSC对大鼠坐骨神经损伤的恢复有一定的促进作用。

关键词：牙髓干细胞神经向分化单层培养神经修复