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不同培养条件对小鼠诱导性多能干细胞分化为神经元样细胞的影响

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细胞与分子免疫学杂志 2015年第9期31卷 1216-1219,1223页

作者：陈旭东范文娟袁科理袁磊王晓兰王福青漯河医学高等专科学校河南漯河462002

目的研究小鼠诱导性多能干细胞(i PSC)在不同培养条件诱导下向神经元样细胞分化的能力。方法将小鼠i PSC悬浮培养形成拟胚体,然后随机分为全反式维甲酸(ATRA)组、脑片共培养组和脑组织匀浆上清组,将其诱导分化成神经元样细胞。倒置显微... 详细信息

目的研究小鼠诱导性多能干细胞(i PSC)在不同培养条件诱导下向神经元样细胞分化的能力。方法将小鼠i PSC悬浮培养形成拟胚体,然后随机分为全反式维甲酸(ATRA)组、脑片共培养组和脑组织匀浆上清组,将其诱导分化成神经元样细胞。倒置显微镜下观察细胞形态变化;免疫荧光染色技术对其进行鉴定分析;Western blot法检测巢蛋白(nestin)、微管相关蛋白2(MAP2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果小鼠i PSC在不同培养条件下都能够向神经元样细胞分化,这些神经元样细胞可以被神经细胞标志物nestin、MAP2标记;ATRA组的nestin、MAP2、GFAP蛋白相对表达量明显高于脑片共培养组和脑匀浆上清诱导组,但脑片共培养组和脑匀浆上清诱导组间无显著性差异。结论脑片微环境和脑组织匀浆上清均可诱导小鼠i PS细胞向神经元样细胞分化,但效果不及ATRA组。

关键词：诱导性多能干细胞脑片培养脑组织匀浆神经元样细胞分化

虎杖苷促进骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化治疗脊髓损伤机制

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中华中医药杂志 2020年第5期35卷 2628-2633页

作者：詹吉恒栾继耀罗丹李兴侯永辉侯宇陈树东肖志锋林定坤广州中医药大学第二临床医学院广州510405 广州中医药大学岭南医学研究中心广州510405 广东省中医院骨一科广州510120

目的:探讨虎杖苷(PD)定向诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经分化的潜能及其联合干细胞移植治疗脊髓损伤(SCI)的机制。方法:提取、培养并鉴定小鼠BMSCs细胞,CCK-8检测细胞活性,分组诱导后通过免疫荧光染色,观察PD对BMSCs向神经分化的影... 详细信息

目的:探讨虎杖苷(PD)定向诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经分化的潜能及其联合干细胞移植治疗脊髓损伤(SCI)的机制。方法:提取、培养并鉴定小鼠BMSCs细胞,CCK-8检测细胞活性,分组诱导后通过免疫荧光染色,观察PD对BMSCs向神经分化的影响。建立SCI动物模型,随机分组后干预,检测脊髓伤区神经元标志物蛋白及mRNA表达水平,组织形态学变化、行为学评分等,评估PD灌胃联合细胞移植治疗SCI小鼠的疗效。结果:与标准诱导组比较,PD联合诱导能提高BMSCs向神经元样细胞分化的效率,PD联合诱导组细胞中神经元标志物MAP-2、NeuN表达水平显著高于标准诱导组(P细胞移植组、细胞移植+PD灌胃组均能有效缓解脊髓伤区病理改变,上调神经元标志物蛋白、mRNA的表达,促进神经丝跨越胶质瘢痕区生长,并改善动物后肢活动功能,该趋势在细胞移植+PD灌胃组中更显著(P神经元样细胞分化,促进轴突修复,改善SCI小鼠后肢运动功能从而发挥治疗作用。

关键词：虎杖苷骨髓间充质干细胞神经分化脊髓损伤轴突修复中医经络再生神经元样细胞机制

Functional switching of ATM:sensor of DNA damage in proliferating cells and mediator of Akt survival signal in post-mitotic human neuron-like cells

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Chinese Journal of Cancer 2012年第8期31卷 364-372页

作者： Yan Li Hua Xiong Da-Qing Yang The Hormel Institute University of MinnesotaAustinMN 55912USA

Ataxia-telangiectasia(A-T) is an autosomal recessive disorder characterized by cerebellar ataxia and oculocutaneous telangiectasias.The gene mutated in this disease,ATM(A-T,mutated),encodes a 370-kDa Ser/Thr protein kinase.ATM not only mediates cellular response to DNA damage but also acts as an activator of Akt in response to insulin.However,despite intensive studies,the mechanism underlying the neuronal degeneration symptoms of human A-T is still poorly understood.We found that the topoisomerase inhibitors etoposide and camptothecin readily induced apoptosis in undifferentiated proliferating SH-SY5Y cells but could not induce apoptosis in neuronally differentiated SH-SY5Y cells.In addition,etoposide induced p53 phosphorylation and H2AX foci formation in proliferating SH-SY5Y cells but failed to do so in differentiated SH-SY5Y cells.Moreover,while inhibition of ATM in undifferentiated SH-SY5Y cells partially protected them from etoposide-induced apoptosis,the same treatment had no effect on cell viability in differentiated SH-SY5Y cells.These results suggest that DNA damage or defective response to DNA damage is not the cause of neuronal cell death in human A-T.In contrast,we discovered that Akt phosphorylation was inhibited when ATM activity was suppressed in differentiated SH-SY5Y cells.Furthermore,inhibition of ATM induced apoptosis following serum starvation in neuronally differentiated SH-SY5Y cells but could not trigger apoptosis under the same conditions in undifferentiated proliferating SH-SY5Y cells.These results demonstrate that ATM mediates the Akt signaling and promotes cell survival in neuron-like human SH-SY5Y cells,suggesting that impaired activation of Akt is the reason for neuronal degeneration in human A-T.

关键词：神经元样细胞 DNA损伤细胞增殖 ATM Akt SH-SY5Y细胞人类有丝分裂

miR-146b促进诱导多能干细胞向神经元样细胞的分化

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中国组织工程研究 2018年第17期22卷 2711-2716页

作者：李强张明伟李建明胡俊林西南医科大学附属中医医院神经外科四川省泸州市646000 自贡市第三人民医院神经外科四川省自贡市643020

背景:如何促进诱导多能干细胞向神经元样细胞分化对于神经损伤修复和神经再生具有重要意义。目的:探讨miR-146b在诱导多能干细胞分化过程中的表达水平,及其对诱导多能干细胞向神经元样细胞分化的影响。方法:小鼠诱导多能干细胞向神经元... 详细信息

背景:如何促进诱导多能干细胞向神经元样细胞分化对于神经损伤修复和神经再生具有重要意义。目的:探讨miR-146b在诱导多能干细胞分化过程中的表达水平,及其对诱导多能干细胞向神经元样细胞分化的影响。方法:小鼠诱导多能干细胞向神经元样细胞分化7 d后,利用实时荧光定量PCR方法检测多能干细胞特异蛋白和miR-146b的表达;通过过表达miR-146b慢病毒感染诱导多能干细胞,再诱导其向神经元样细胞分化,利用细胞免疫荧光染色法和荧光定量PCR检测干细胞特异蛋白和神经外胚层特异蛋白的表达,以及神经细胞标记分子Tuj-1的表达。结果与结论:(1)与未分化小鼠诱导多能干细胞相比,向神经元样细胞分化7 d后,干细胞特异表达蛋白Nanog、Oct4和Sox2表达显著下调,而miR-146b表达显著升高;(2)诱导多能干细胞过表达miR-146b后,Oct4表达显著下降,Nanog和Sox2表达未发生显著变化;同时,在神经分化过程中,过表达miR-146b诱导多能干细胞Nanog、Oct4和Sox2的表达显著下调,神经外胚层特异蛋白Nestin、Sox1和Pax6的表达显著上调;(3)神经分化培养18 d后,miR-146b显著增加了Tuj-1阳性细胞数;(4)结果表明,miR-146b可以促进诱导多能干细胞向神经元样细胞方向分化。

关键词：诱导多功能干细胞微RNAs 神经元细胞分化组织工程 miR-146b 诱导多能干细胞神经元样细胞诱导分化干细胞

神经元样细胞与控释神经营养因子联合移植对脊髓损伤猴后索结构修复和功能恢复的作用

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中国临床康复 2005年第26期9卷 96-99,i0005页

作者：刘晓刚邓宇斌刘祖国朱文标王建云张成中山大学病理生理学教研室广东省广州市510080 中山大学附属眼科中心广东省广州市510080 中山大学附属第一医院骨科广东省广州市510080 中山大学附属第一医院神经内科广东省广州市510080

目的:探讨骨髓间质干细胞源性神经元样细胞与胶质细胞源性神经营养因子控释生物材料联合移植治疗猴急性脊髓损伤过程中,对后索结构修复与功能恢复的影响。方法:实验于2004-03/11在中山大学附属第一医院实验动物中心完成。选择雄性恒河猴... 详细信息

目的:探讨骨髓间质干细胞源性神经元样细胞与胶质细胞源性神经营养因子控释生物材料联合移植治疗猴急性脊髓损伤过程中,对后索结构修复与功能恢复的影响。方法:实验于2004-03/11在中山大学附属第一医院实验动物中心完成。选择雄性恒河猴8只,随机分为2组,每组4只。制作猴脊髓损伤模型后损伤治疗组植入3.0×106个/kg神经元样细胞与含2μg胶质细胞源性神经营养因子的单甲氧基聚乙二醇聚乳酸嵌共聚体用200μL磷酸盐缓冲液制成悬液,损伤对照组给予等体积磷酸盐缓冲液;各组动物分别于术前和治疗后四五个月进行皮质体感诱发电位检测;处死动物前3周将TrueBlue注射到脊髓损伤部位下界下部后索部位,制备石蜡切片应用苏木精-伊红染色观察脊髓损伤处脊髓后角的组织形态学改变。应用甘氨酸银浸镀法染色观察后索结构。结果:8只恒河猴全部进入结果分析。①两组动物皮质体感诱发电位结果:脊髓损伤后,皮质体感诱发电位信号消失,治疗后四五个月与治疗前比较,损伤治疗组潜伏期无明显延长。损伤治疗组波幅降低度明显低于损伤对照组犤(3.78±1.32)μV,(9.85±0.84)μV,t=-11.194,P神经元少见,胶质浸润。③脊髓后索神经纤维密度和积分吸光度值:损伤治疗组后索神经纤维密度明显高于损伤对照组犤(1338±276)个/视野,(574±168)个/视野,t=4.734,P细胞,损伤对照组无此现象。结论:①注射骨髓间充质神经元样细胞与控释胶质细胞源性神经营养因子的恒河猴皮质体感诱发电位的潜伏期基本正常,波幅降低,表明其本体感觉获得了一定程度恢复,同时说明波幅的变化在判断脊髓损伤方面比潜伏期更敏感。②后角神经元明显增多,说明骨髓间充质神经元样细胞与控释胶质细胞源性神经营养因子可以促进脊髓损伤猕猴后索组织结构的修复。

关键词：脊髓神经组织蛋白质类诱发电位生物相容性材料猕猴胶质细胞源性神经营养因子神经元样细胞脊髓损伤组织结构功能恢复

超低频磁场基于ERK信号通路介导促进骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化

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中华神经医学杂志 2016年第2期15卷 109-116页

作者：林产勇石海杉刘巍吴文南方医科大学珠江医院康复理疗科广州510280

目的探讨10Hz超低频磁场（ELF．EMF）对离体培养大鼠骨髓间充质于细胞（BMSCs）向神经元样细胞分化的影响及其作用机制。方法应用全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs，流式细胞仪检测P3代细胞表面标记物。将P3代BMSCs分为ELF—EMF组、ELF．... 详细信息

目的探讨10Hz超低频磁场（ELF．EMF）对离体培养大鼠骨髓间充质于细胞（BMSCs）向神经元样细胞分化的影响及其作用机制。方法应用全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs，流式细胞仪检测P3代细胞表面标记物。将P3代BMSCs分为ELF—EMF组、ELF．EMF＋抑制剂组、抑制剂组及对照组，给予诱导培养基（含2％二甲基亚砜和200ixmol／L丁基羟基茴香醚1诱导培养5h，诱导过程中ELF—EMF组、ELF-EMF＋抑制剂组给予10Hz、500GSELF．EMF干预，ELF—EMF＋抑制剂组、抑制剂组在诱导前预先加入50ixmol／LU0126共培养30min，使用倒置显微镜观察细胞形态学变化。应用免疫荧光染色及Westernblotting检测各组细胞巢蛋白表达，应用Westernblotting检测各组细胞内磷酸化细胞外信号调节激酶1／2（p-ERK1／2）蛋白表达水平。结果P3代BMSCs呈长梭形，漩涡样排列，CD90表达率为97．9％，CD45表达率为4．7％。诱导结束后细胞均逐渐出现典型的神经元样细胞形态学特征。免疫荧光染色及Westernblotting检测结果显示，与对照组、ELF-EMF＋抑制剂组及抑制剂组比较．ELF—EMF组巢蛋白、P-ERK1／2表达水平均明显增高，差异均有统计学意义fP〈0．05）。ELF—EMF＋抑制剂组巢蛋白表达水平与对照组及抑制剂组比较差异均无统计学意义（p0．05）。结论ELF-EMF可通过活化ERK1／2信号转导通路，促进BMSCs向神经元样细胞分化。

关键词：超低频磁场骨髓间充质干细胞神经元样细胞细胞分化细胞外信号调节激酶1/2

靶向Pim-1表达修复受损神经元样细胞的作用及机制

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靶向Pim-1表达修复受损神经元样细胞的作用及机制

作者：李贺中国人民解放军海军军医大学

学位级别：硕士

目的:中枢神经系统神经元内在再生能力不足是导致受损神经元再生和功能恢复失败的主要原因。神经元损伤后多个细胞内信号通路之间协同调节的靶基因可显著促进神经元的存活,增强神经元的内在再生能力,使受损神经元长距离轴突再生、神经... 详细信息

目的:中枢神经系统神经元内在再生能力不足是导致受损神经元再生和功能恢复失败的主要原因。神经元损伤后多个细胞内信号通路之间协同调节的靶基因可显著促进神经元的存活,增强神经元的内在再生能力,使受损神经元长距离轴突再生、神经回路重建和功能恢复变成可能。因而,找准靶点基因提升受损中枢神经元的内在再生能力是治疗中枢神经损伤的关键所在。莫洛尼小鼠白血病病毒前病毒插入位点(provirus integration site for Moloney murine leukemia virus,Pim-1)为原癌基因,可编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是许多细胞因子及生长因子细胞内信号通路的共同下游效应分子,通过磷酸化下游蛋白质丝氨酸/苏氨酸位点,在细胞增殖、存活及凋亡等过程中发挥重要作用。基于Pim-1是多个信号通路共同下游效应分子,且对细胞的增殖及存活具有重要作用,本研究首先观察Pim-1在体外受损中枢神经元样细胞内的表达变化,睫状神经营养因子(CNTF)和神经突起素(Neuritin,Nrn1)调控下游信号通路对Pim-1表达的影响,以及这种影响对受损神经元的作用及相关机制。以Pim-1基因为靶点,用重组慢病毒(recombinant lentivirus)载体过表达Pim-1,或用Pim-1 siliencer特异性干扰Pim-1表达,探讨直接调控Pim-1表达对体外受损神经元样细胞的活性和突起再生的作用,为临床治疗中枢神经元损伤提供新的方法及其实验和理论依据。本研究还基于长链非编码RNA(long non-coding RNA,Lnc RNA)调控神经发育和损伤的相关研究以及Lnc-Pim1与Pim-1基因位点、序列的密切关系,观测Lnc-Pim1在体外中枢神经元样细胞的序列全长、表达定位、损伤后表达变化、与Pim-1相互作用关系,并以Lnc-Pim1基因为靶点,用重组慢病毒载体过表达Lnc-Pim1,或用Lnc-Pim1siliencer特异性干扰Lnc-Pim1表达,探讨调控Lnc-Pim1表达对体外受损神经元样细胞的修复作用,同时还应用CHIRP-MS和RNA-seq技术探究Lnc-Pim1发挥作用的初步分子机制。方法:(1)在体外用20μmol/ml反式视黄酸(RA)将Neuro-2a细胞诱导成为神经元样细胞(N-2a-N);用50μmol/L去铁胺亚磺酸盐(DFO)抑制Neuro-2a细胞增殖;用1mmol/L丙烯酰胺(ACR)损伤N-2a-N细胞突起。N-2a-N细胞分为正常对照组、PBS组、300μg/L CNTF组、500μg/L Nrn1组。用Image J 6.0测量细胞突起长度,用CCK-8法检测细胞活性。免疫荧光细胞化学法检测N-2a-N细胞表型及Pim-1蛋白表达,Real-time PCR和Western blotting检测Pim-1在各组的表达变化。Western blotting检测调节Pim-1活性的相关信号转导分子(Stat-3、p-Stat-3、Erk1/2、p-Erk1/2),细胞存活、凋亡相关分子(Caspase-3、Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2)及轴突再生相关分子GAP-43的表达变化。(2)用RACE法获得N-2a-N细胞内Lnc-Pim1全长序列。用Phylo CSF、CPC和CNCI软件对Lnc-Pim1编码能力进行预测。用FISH法和核质分离技术检测Lnc-Pim1在Neuro-2a细胞、正常N-2a-N细胞以及受损N-2a-N细胞内的亚细胞定位。用Real-time PCR检测不同时间点受损N-2a-N细胞中Lnc-Pim1的表达变化。(3)构建Pim-1、Lnc-Pim1重组慢病毒载体,用Real-time PCR测定病毒的滴度。(4)设计Pim-1、Lnc-Pim1特异性干扰试剂Pim-1 siliencer和Lnc-Pim1 siliencer,采用Real-time PCR检测不同浓度干扰试剂对N-2a-N细胞内Pim-1、Lnc-Pim1表达的影响。(5)用MOI值为40携带杀稻瘟菌素抗性的Pim-1重组慢病毒载体感染Neuro-2a细胞,用80μg/ml的杀稻瘟菌素对重组慢病毒感染的Neuro-2a细胞进行抗性筛选。用1mmol/L ACR损伤N-2a-N细胞,实验分为Ctrl组、ACR组、LV-Blank/ACR组和LV-Pim-1/ACR组,并于损伤24 h后进行检测;用200nmol/ml的阴性对照物(Negtive control,NC)silencer或Pim-1 siliencer转染N-2a-N细胞,实验分为NC silencer组、Pim-1 silencer组,并于转染48 h后检测。倒置相差显微镜下对各组N-2a-N细胞进行拍照,并对细胞突起长度进行测量、统计。用CCK-8检测各组细胞活性,用Real-time PCR及

关键词：神经元样细胞 CNTF Neuritin Pim-1 Lnc-Pim1 损伤再生基因治疗

鼠神经生长因子联合脑源性神经营养因子诱导人脐血间充质干细胞向神经元样细胞分化

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中国组织工程研究 2018年第17期22卷 2692-2698页

作者：陈俊杨自金李红梅徐州医科大学附属连云港医院(连云港市第一人民医院)儿内科江苏省连云港市222002

背景:作者在前期研究中发现鼠神经生长因子具备诱导脐血间充质干细胞向神经元样细胞分化的能力,为进一步探讨提高诱导效率的方法,拟尝试使用多种细胞生长因子进行联合诱导。目的:探讨鼠神经生长因子联合脑源性神经营养因子在体外条件下... 详细信息

背景:作者在前期研究中发现鼠神经生长因子具备诱导脐血间充质干细胞向神经元样细胞分化的能力,为进一步探讨提高诱导效率的方法,拟尝试使用多种细胞生长因子进行联合诱导。目的:探讨鼠神经生长因子联合脑源性神经营养因子在体外条件下对人脐血间充质干细胞向神经元样细胞诱导分化的作用。方法:复苏获赠的原代人脐血间充质干细胞并进行体外扩增培养,取第5代脐血间充质干细胞分为5组,其中前4组为预诱导组,在加入成纤维生长因子和表皮生长因子预诱导24 h后,再用鼠神经生长因子、脑源性神经营养因子及二者联合对脐血间充质干细胞进行诱导,对照组仅使用等量细胞培养基培养;最后一组为非预诱导组,先用细胞培养基培养24 h后,再加入鼠神经生长因子和脑源性神经营养因子进行联合诱导。倒置显微镜下观察诱导后细胞形态变化,并用免疫细胞化学法检测神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白的表达,实时荧光定量PCR技术检测神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白在m RNA水平的相对表达量。结果与结论:(1)脐血间充质干细胞形态为大小不一的长梭形、纺锤形,经诱导后细胞胞体逐渐回缩变圆,并向一侧或多侧发出突起,呈现出神经元样细胞改变;(2)免疫细胞化学及实时荧光定量PCR结果显示各实验组细胞均阳性表达神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白,联合诱导组神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白阳性率及二者m RNA表达量均高于单独诱导组、对照组以及非预诱导组;(3)鼠神经生长因子和脑源性神经营养因子均能诱导脐血间充质干细胞向神经元样细胞分化,二者在诱导过程中具有协同作用,联合使用能够有效提高诱导效率。

关键词：胎血间质干细胞神经生长因子脑源性神经营养因子细胞分化神经元组织工程干细胞脐血间充质干细胞鼠神经生长因子神经元样细胞诱导分化

单唾液酸四己糖神经节苷脂最佳质量浓度诱导人脐带间充质干细胞向神经元样细胞的分化

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中国组织工程研究 2018年第13期22卷 2039-2044页

作者：张鹏赵宗茂李建华刘辉刘永军李敏捷陈明伟申仑何磊邯郸市第一医院河北省邯郸市056000 河北医科大学附属第二医院河北省石家庄市050000

背景:国内外研究证实单唾液酸四己糖神经节苷脂在体外能够诱导人脐带间充质干细胞分化为神经元样细胞,但探索其最合适的诱导剂量等相关研究甚少。目的:探索单唾液酸四己糖神经节苷脂在体外诱导人脐带间充质干细胞分化为神经元样细胞的... 详细信息

背景:国内外研究证实单唾液酸四己糖神经节苷脂在体外能够诱导人脐带间充质干细胞分化为神经元样细胞,但探索其最合适的诱导剂量等相关研究甚少。目的:探索单唾液酸四己糖神经节苷脂在体外诱导人脐带间充质干细胞分化为神经元样细胞的最佳质量浓度。方法:采用胶原酶消化法获取人脐带间充质干细胞,扩增后,取第3代细胞,随机分为5组,当细胞融合至70%-80%时,分别加入质量浓度为50,100,150,200 mg/L单唾液酸四己糖神经节苷脂的诱导液,空白对照组只加入等量L-DMEM培养基。倒置显微镜下观察细胞形态变化。诱导第6小时用免疫细胞化学染色方法检测GFAP、NF-H、MAP-2的表达。结果与结论:从脐带组织中分离出来的人脐带间充质干细胞可以稳定传代,并表达间充质干细胞表面标志,单唾液酸四己糖神经节苷脂可以诱导人脐带间充质干细胞向神经元样细胞分化,并表达成熟神经细胞标志物MAP-2、NF-H,最佳诱导质量浓度为150 mg/L。

关键词：干细胞单唾液酸四己糖神经节苷脂人脐带间充质干细胞诱导分化神经元样细胞