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整合素连接激酶基因敲降和黑色素瘤分化相关基因过表达慢病毒载体构建和鉴定

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浙江大学学报（医学版） 2014年第2期43卷 193-199页

作者：杨幼萍丁燕王继荣曾玲晖林红霞朱杨丽吴宏卫王若燕张建民应荣彪浙江省台州市肿瘤医院浙江温岭310075 台州市中心医院浙江台州318000 浙江大学城市学院医学院浙江杭州310015

目的：建立整合素相关激酶（ ILK）基因敲降和黑色素瘤分化相关基因（ mda7）过表达慢病毒包装表达系统。方法：针对人ILK基因序列，设计基因敲降靶点序列（A、B、C），通过限制性内切酶HpaⅠ和XhoⅠ双酶切、T4 DNA连接酶连接，将ILK插... 详细信息

目的：建立整合素相关激酶（ ILK）基因敲降和黑色素瘤分化相关基因（ mda7）过表达慢病毒包装表达系统。方法：针对人ILK基因序列，设计基因敲降靶点序列（A、B、C），通过限制性内切酶HpaⅠ和XhoⅠ双酶切、T4 DNA连接酶连接，将ILK插入慢病毒载体pSicoR-eGFP，构建siILK-pSicoR-eGFP重组质粒；根据人mda7基因序列，设计引物扩增mda7全长，并插入慢病毒载体pLVX-Puro，构建mda7-pLVX-Puro重组质粒。经双酶切及测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒四质粒系统共转染人胚肾细胞系293 T细胞，进行慢病毒包装并测定病毒滴度、观察感染效率。各组病毒载体转染PC-3细胞后，用定量PCR和蛋白质印迹法检测ILK基因和mda7 mRNA转录水平及蛋白表达水平。通过MTT法和Transwell实验考察ILK和mda7对PC-3细胞增殖和迁移的影响。结果：成功构建ILK基因敲降及mda7过表达的慢病毒载体，四质粒系统共转染293 T细胞后可见大量绿色荧光染色阳性细胞。浓缩病毒后293 T细胞的感染效率在90％以上，并能高效率感染PC-3前列腺癌细胞。 ILK-A-pSicoR-eGFP和ILK-B-pSicoR-eGFP组ILK干扰效果最佳（P＜0．05），mda7的表达水平远高于对照组（P＜0．05），且持续稳定表达至少1个月。 ILK和mda7对PC-3细胞的增殖在96 h内有明显抑制作用，并对其迁移亦有显著抑制（均P＜0．05）。结论：成功构建并鉴定人ILK 基因敲降和mda7过表达慢病毒载体，可为探讨ILK和mda7基因在肿瘤细胞中的生物学功能提供良好工具，也为探索安全、高效的肿瘤治疗途径奠定实验基础。

关键词：整合素类磷酸转移酶类前列腺肿瘤白细胞介素类基因,肿瘤抑制慢病毒属遗传学遗传载体基因表达

间变性大细胞淋巴瘤组织间变性淋巴瘤激酶及survivin蛋白表达及其临床意义

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中华病理学杂志 2006年第4期35卷 213-217页

作者：李金范李甘地刘卫平王影程继荣陈宇杨红汤合莲白燕琼林德广杜丽惠彭凤翔杨永红赵春四川大学华西医院病理科成都610041 四川省肿瘤医院病理科四川省达州市中心医院病理科四川大学华西口腔医院病理科四川省人民医院病理科湖北省襄樊市第一医院病理科四川省简阳市人民医院病理科四川省南充市中心医院病理科四川省内江市第二人民医院病理科四川省武警总队医院病理科四川省绵阳市中心医院病理科成都市第一医院病理科

目的研究间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)中间变性淋巴瘤激酶(ALK)蛋白及survivin蛋白的表达特点及其临床意义。方法应用免疫组织化学LSAB法检测ALK蛋白及survivin蛋白的表达。结果ALK蛋白在81例ALCL中有51例(63%)阳性,30例(37%)阴性。ALK阳... 详细信息

目的研究间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)中间变性淋巴瘤激酶(ALK)蛋白及survivin蛋白的表达特点及其临床意义。方法应用免疫组织化学LSAB法检测ALK蛋白及survivin蛋白的表达。结果ALK蛋白在81例ALCL中有51例(63%)阳性,30例(37%)阴性。ALK阳性患者预后优于阴性患者(P0·05)。预后:Survivin高表达患者较低表达者差(P0·05)。Cox比例风险回归分析表明ALK的表达、体质性症状及survivin的不同表达状况对存活的影响有统计学意义(P<0·05),其中ALK的表达对生存的影响最大,survivin表达的影响最小。结论survivin蛋白在ALCL中的表达与ALK蛋白的表达不相关,是一个独立的指标,可有助于判断ALK阳性ALCL病例的预后。

关键词：淋巴瘤,非霍奇金磷酸转移酶类蛋白质survivin 免疫组织化学

通心络对IL-1β介导的小型猪冠状动脉内膜增殖及5-HT诱发的冠状动脉痉挛的抑制作用

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中国中西医结合杂志 2008年第7期28卷 627-631页

作者：关启刚曾定尹孙喜琢周旭晨程颖苗志林何学志韩凤桐张利中国医科大学附属第一医院心内科沈阳110001 大连市中心医院心内科

目的在体观察通心络抑制猪冠状动脉痉挛的作用及可能机制。方法选取16头小型雄性家猪,麻醉后进行左侧开胸手术,选择心脏左前降支及回旋支近端管腔外径大小近似的两处节段进行仔细分离,在血管外膜包裹吸附白细胞介素-1β(IL-1β,2.5μg)... 详细信息

目的在体观察通心络抑制猪冠状动脉痉挛的作用及可能机制。方法选取16头小型雄性家猪,麻醉后进行左侧开胸手术,选择心脏左前降支及回旋支近端管腔外径大小近似的两处节段进行仔细分离,在血管外膜包裹吸附白细胞介素-1β(IL-1β,2.5μg)的纸巾,构建冠状动脉痉挛模型,2周后采用冠状动脉造影观察经导管冠脉内给予5-羟色胺(5-HT,10μg/kg)诱发冠状动脉痉挛情况。将成功诱发冠状动脉痉挛的12头小型猪随机分成两组,对照组6只(12个血管段),单纯喂养专用饲料;通心络组6只(12个血管段),喂养专用饲料和通心络〔1g/(kg.d)〕,连续喂养4周后停药1周,进行第2次造影并以同样方法进行诱发痉挛实验。造影结束后处死动物,截取包裹IL-1β的血管段,进行病理学检查,并采用RT-PCR方法测定各组手术处理血管段(Ras hom ologue,Rho)激酶mRNA表达,采用Western blot方法测定其底物肌球蛋白结合亚基磷酸化(myosin-binding subunit phosphorylation,MBS-P)的表达。结果冠状动脉造影显示,12头小型猪冠状动脉局部血管发生不同程度的管腔狭窄(20%～30%),5-HT能诱发其痉挛。第2次造影显示,对照组11血管段5-HT诱发痉挛阳性,1血管段5-HT诱发痉挛阴性。通心络组2血管段5-HT诱发痉挛阳性,10血管段5-HT诱发痉挛阴性。病理学检查,两组均可见不同程度的巨噬细胞聚集现象,通心络组与对照组比较管腔狭窄程度及内膜增殖明显减轻。对照组Rho激酶mRNA的表达及肌球蛋白磷酸酶(MLCP)的MBP-S水平明显上调,通心络组Rho激酶mRNA表达〔(71.5±2.4)%〕被抑制,与对照组〔(98.2±7.7)%〕比较差异有统计学意义(P<0.05),通心络组MBS-P的灰度值(16633±1390)明显降低,与对照组(25818±4745)比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论通心络具有明显抑制IL-1β介导的冠状动脉内膜增殖及5-HT诱发的冠状动脉痉挛的作用;抑制IL-1β包裹血管段细胞内Rho激酶mRNA表达,减少MBS-P表达可能是其作用机制之一。

关键词：通心络白细胞介素-1β 冠状动脉痉挛磷酸转移酶类小型猪

鞘氨醇激酶1对肿瘤坏死因子α诱导的气道黏蛋白5AC的调节作用

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中华医学杂志 2011年第6期91卷 391-395页

作者：余红梅李琪尤列·皮尔曼维克多·科罗索夫周向东重庆医科大学附属第二医院呼吸内科 400010 俄罗斯医学科学院远东呼吸生理与病理中心

目的探讨鞘氨醇激酶1（SphK1）对肿瘤坏死因子α（TNF—α）诱导的气道黏蛋白（MUC）5AC的调节机制。方法培养正常人气道上皮细胞HBE16，给予SphK1特异性抑制剂N，N-二甲基鞘氨醇（DMS）处理及转染SphK1的小干扰RNA（siRNA）后，再各施... 详细信息

目的探讨鞘氨醇激酶1（SphK1）对肿瘤坏死因子α（TNF—α）诱导的气道黏蛋白（MUC）5AC的调节机制。方法培养正常人气道上皮细胞HBE16，给予SphK1特异性抑制剂N，N-二甲基鞘氨醇（DMS）处理及转染SphK1的小干扰RNA（siRNA）后，再各施以TNF-α刺激，四甲基偶氮唑盐法检测各组细胞增殖活力，Westernblot法检测各组SphK1、环氧化酶2（COX-2）、磷酸化P38（P—P38）、磷酸化细胞外信号调节激酶（p-ERK）和IKBα蛋白相对含量，酶联免疫分析法检测各组MUC5AC、前列腺素E2（PGE2）和环单磷酸腺苷（cAMP）的相对含量，荧光素酶报告基因系统测定cAMP反应结合蛋白（CREB）和核因子-κB（NF-κB）的相对活性，RT-PCR检测各组SphK1和SphK1 mRNA的表达水平，免疫荧光法检测胞内MUC5AC含量。结果与对照组相比，TNF．d组的SphK1 mRNA和蛋白水平显著升高（均P〈0．01），COX-2、PGE2、cAMP、P—P38和p-ERK的含量明显增加（均P〈0．01），IkBα含量明显降低（P〈0．01），CREB和NF—KB的活性明显增强（均P〈0．01），MUC5AC mRNA和蛋白含量亦显著高于对照组（均P〈0．01）；与TNF-α组相比，给予DMS处理后COX-2、PGE2、cAMP、P—P38和p-ERK的含量明显降低（均P〈0．01），IkBα含量显著增加（P〈0．01），CREB和NF-κB的活性明显减弱（均P〈0．01），MUC5AC mRNA和蛋白含量也显著降低（均P〈0．01），转染SphK1 siRNA后上述指标出现同DMS处理一致的变化（均P〈0．01）。结论SphK1参与调节了TNF-α所诱导的MUC5AC高表达过程中的主要信号因子及转录因子的表达，可能是MUC5AC合成及分泌过程中的重要调节因子。

关键词：鞘氨醇磷酸转移酶类肿瘤坏死因子α 黏蛋白类转录因子

NADPH氧化酶与Rho/Rho-激酶激活在外膜介导的血管重塑中的作用

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中华心血管病杂志 2003年第8期31卷 613-616页

作者：牟华明祝之明祝善俊王利娟王海燕第三军医大学大坪医院高血压内分泌科重庆市高血压病研究所重庆400042

目的　探讨NADPH氧化酶与Rho/Rho 激酶在外膜介导的血管重塑中的作用。方法在体去除兔颈动脉外膜 ,于术后即刻、1周及 2周取出颈动脉。用图像分析系统测定内膜及中层面积 ;应用多道生理仪测血管反应性 ;原位杂交及RT PCR检测mRNA表达。... 详细信息

目的　探讨NADPH氧化酶与Rho/Rho 激酶在外膜介导的血管重塑中的作用。方法在体去除兔颈动脉外膜 ,于术后即刻、1周及 2周取出颈动脉。用图像分析系统测定内膜及中层面积 ;应用多道生理仪测血管反应性 ;原位杂交及RT PCR检测mRNA表达。结果　 (1)血管外膜去除后内膜增生 ,2周时内膜增生较 1周时更为明显。对照侧无内膜增生。 (2 )与对照侧比较 ,去外膜侧血管在术后即刻、1周对去甲肾上腺素的收缩反应减弱 (P <0 0 5)。 (3 )与对照侧比较 ,去外膜侧NADPH氧化酶P2 2PhoxmRNA表达在 1周时增高 (P <0 0 5)。 (4)与对照侧比较 ,去外膜侧Rho 激酶mRNA表达在 2周时增高 (P <0 0 5)。结论　外膜去除后血管内膜增生 ,血管舒缩功能改变 ,其发生机制与NADPH氧化酶及Rho

关键词： NADPH氧化酶 Rho/Rho-激酶血管重塑磷酸转移酶类 Rho因子

利用BN大鼠致敏模型研究HPT蛋白的致敏性

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中国食品卫生杂志 2009年第1期21卷 1-3页

作者：贾旭东王伟杨晓光李宁中国疾病预防控制中心营养与食品安全所北京100021

目的用BN大鼠致敏模型对HPT(潮霉素B磷酸转移酶)蛋白的致敏性进行研究。方法40只BN大鼠随机分为4组,每组10只,分别经口灌胃给予卵清蛋白(OVA)(阳性对照组)、HPT蛋白(HPT蛋白组)、马铃薯酸性磷酸酶(PAP)(阴性对照组)及蒸馏水(溶剂对照),... 详细信息

目的用BN大鼠致敏模型对HPT(潮霉素B磷酸转移酶)蛋白的致敏性进行研究。方法40只BN大鼠随机分为4组,每组10只,分别经口灌胃给予卵清蛋白(OVA)(阳性对照组)、HPT蛋白(HPT蛋白组)、马铃薯酸性磷酸酶(PAP)(阴性对照组)及蒸馏水(溶剂对照),剂量均为1 mg/ml,每只动物1 ml,每日1次,连续28 d。于灌胃后第7天,取血分离血浆进行组胺测定。于第14天和第28天取血分离血清测定IgE水平。于试验结束后第10天分别对各组动物进行大剂量(5 mg/ml OVA、HPT、PAP或蒸馏水,2 ml/只)激发后测定各组大鼠的血压。结果血清学实验结果表明HPT蛋白没有激发任何IgE反应,而OVA激发了明显的IgE反应;HPT组的组胺水平与阴性对照组或溶剂对照组相比差异无统计学意义,而阳性对照组组胺水平升高,与HPT蛋白组相比差异有统计学意义(P<0.05)。OVA导致3只大鼠血压暂时降低,而HPT对大鼠血压没有影响。结论在该实验条件下,经口灌胃给予BN大鼠HPT蛋白,没有发现致敏性。

关键词：大鼠,近交BN 模型,动物磷酸转移酶类食物过敏

蛋白激酶C-ζ介导血管紧张素Ⅱ激活的CCDPK对大鼠心肌成纤维细胞增殖的影响(英文)

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Acta Pharmacologica Sinica 2000年第2期21卷 80-84页

作者：丁波黄韶玲张世勤李云霞 China Guang Zhou 510182 Guang Zhou Medical College 湖南医科大学分子药理研究室湖南医科大学分子药理研究室长沙 410078 中国长沙 410078 中国 Now in Guangzhou Research Institute of Snake Venom

目的:探讨血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)和表皮生长因子(EGF)是否经不同的蛋白激酶C(PKC)亚基介导而激活CCDPK产生促培养新生大鼠心肌成纤维细胞增殖。方法:Western Bloting和[~3H]thymidine参入法。结果:PDBU对Ang Ⅱ诱导的CCDPK活性和DNA合成... 详细信息

目的:探讨血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)和表皮生长因子(EGF)是否经不同的蛋白激酶C(PKC)亚基介导而激活CCDPK产生促培养新生大鼠心肌成纤维细胞增殖。方法:Western Bloting和[~3H]thymidine参入法。结果:PDBU对Ang Ⅱ诱导的CCDPK活性和DNA合成速率无显著影响。而EGF诱导的CCDPK活性下降了65％,DNA合成速率下降了38％。PD 98059对Ang Ⅱ和EGF诱导的CCDPK活性分别下降了70％和72％。结论:PKC-ζ介导了Ang Ⅱ对CCDPK的激活及心肌成纤维细胞的增殖效应。

关键词：心脏成纤维细胞培养的细胞 Ca2+-钙调节蛋白依赖性蛋白激酶血管紧张素Ⅱ 细胞分裂 PD 98059 表皮生长因子-尿抑胃素磷酸转移酶类佛波醇12,13-二丁酸盐

G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1的SHD结构域对成骨细胞内局部黏附激酶活性的影响

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中华创伤骨科杂志 2011年第11期13卷 1072-1076页

作者：于留钱张宁胡志毅殷国勇南京医科大学第一附属医院骨科 210029

目的探讨G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1（GIT1）的SHD结构域对成骨细胞内局部黏附激酶（FAK）活性的影响，并分析其机制。方法取1～2dSD大鼠颅盖骨进行成骨细胞原代培养，传至第3代。体外构建野生型GIT1和删除了SHD结构域的GIT1的质粒并... 详细信息

目的探讨G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1（GIT1）的SHD结构域对成骨细胞内局部黏附激酶（FAK）活性的影响，并分析其机制。方法取1～2dSD大鼠颅盖骨进行成骨细胞原代培养，传至第3代。体外构建野生型GIT1和删除了SHD结构域的GIT1的质粒并组成慢病毒。血小板衍生生长因子（PDGF）刺激成骨细胞后，采用免疫共沉淀法检测GIT1、删除了SHD结构域的GIT1与FAK的相互关系，采用免疫荧光法检测GIT1和FAK在成骨细胞内的位置、删除了SHD结构域的GIT1对成骨细胞内FAK位置和活性的影响。结果PDGF刺激成骨细胞后，GIT1与FAK的相互结合明显增加，且随着时间的增加，结合量逐渐增加（F=293．105，P=0．000）。免疫荧光染色结果表明：PDGF刺激后，成骨细胞局部黏附内活性形式的FAK（FAK酪氨酸397磷酸化）明显增加。PDGF刺激成骨细胞后，删除了SHD结构域的GIT1与FAK的结合明显被抑制，且随着时间的增加，二者的相互关系无明显变化（F=0．322，P=0．737）；删除了SHD结构域的GITI抑制成骨细胞局部黏附内FAK酪氨酸397的磷酸化，同时降低FAK在局部黏附内的表达。结论删除了SHD结构域的GIT1通过降低与FAK的相互结合，从而抑制成骨细胞局部黏附内FAK酪氨酸397的磷酸化，影响成骨细胞的功能。

关键词：受体,G-蛋白偶联成骨细胞载体蛋白质类磷酸转移酶类

微生物来源的Aurora-B激酶抑制剂的分离、结构鉴定和抗肿瘤活性研究

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中国医药生物技术 2011年第2期6卷 116-120页

作者：牛玉强姜威余利岩王彦昶李妍司书毅中国医学科学院医药生物技术研究所北京100050

目的从微生物代谢产物中分离和纯化Aurora-B激酶抑制剂并检测其抗肿瘤活性。方法以野生型酵母菌Y300和ipl1-321温度敏感型突变株为模式菌跟踪活性组分;从阳性放线菌I07A-01038发酵产物中分离纯化活性化合物并进行结构鉴定;体外酶学实验... 详细信息

目的从微生物代谢产物中分离和纯化Aurora-B激酶抑制剂并检测其抗肿瘤活性。方法以野生型酵母菌Y300和ipl1-321温度敏感型突变株为模式菌跟踪活性组分;从阳性放线菌I07A-01038发酵产物中分离纯化活性化合物并进行结构鉴定;体外酶学实验验证阳性化合物对Aurora-B激酶的抑制活性;MTT法检测阳性化合物对肿瘤细胞增殖的抑制活性;AnnexinV-FITC/PI双染法检测活性化合物对肿瘤细胞早期凋亡的诱导作用。结果从阳性放线菌I07A-01038发酵产物中得到活性化合物酒渣碱甲酯(flazinmethylester),酒渣碱甲酯对ipl1-321突变株具有特异性抑制作用,其在野生型酵母菌株Y300和突变株ipl1-321的IC50分别为48μmol/L和24μmol/L;体外酶学实验证实其对Aurora-B激酶具有抑制作用,其IC50为10μmol/L(ATP=50μmol/L);酒渣碱甲酯对HepG2、A549、Hela肿瘤细胞均具有杀伤活性,IC50分别为13、11和10μmol/L。并能够诱导Hela细胞发生早期凋亡。结论得到一个微生物来源的具有抗肿瘤活性的Aurora-B激酶抑制剂—酒渣碱甲酯。

关键词：磷酸转移酶类细胞抑制剂细胞增殖细胞凋亡