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金属-有机杂化和印迹聚合整体柱制备及其磷酸化丝氨酸微萃取应用

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金属-有机杂化和印迹聚合整体柱制备及其磷酸化丝氨酸微萃取应用

作者：周胜兰湖北大学

学位级别：硕士

蛋白质磷酸化是生物体内重要的翻译后修饰过程,对真核生物细胞的增长、分化、信号传递等过程有重要的调控作用,也与生物体激素的调节、病变的产生、环境的适应等息息相关,它与生命活动过程紧密联系。作为蛋白质磷酸化中最普遍存在的过程... 详细信息

蛋白质磷酸化是生物体内重要的翻译后修饰过程,对真核生物细胞的增长、分化、信号传递等过程有重要的调控作用,也与生物体激素的调节、病变的产生、环境的适应等息息相关,它与生命活动过程紧密联系。作为蛋白质磷酸化中最普遍存在的过程,丝氨酸的磷酸化对诱导蛋白质结构构象的变化有重要作用,能促使酶的活化或失活,也可通过介导相互作用影响蛋白质的识别从而改变细胞的功能。了解磷酸化丝氨酸(P-Ser)对生物体的作用机制,对于病变的研究、药物的开发等具有指导意义。生物样品中游离P-Ser的研究前题是定性定量分析,然而生物体内生理环境复杂,蛋白质、氨基酸种类繁多,干扰低含量游离态P-Ser的分析检测。因此,建立生物样品中高选择性、高灵敏度的P-Ser定量分析具有重要意义和挑战性。本文利用分子印迹技术(MIT)分子识别的选择性和金属-有机杂化聚合物(MOPH)的大吸附容量特点,分别制备了P-Ser分子印迹整体柱和MOPH修饰的整体柱,应用于P-Ser的固相微萃取(SPME),建立了生物样品中游离P-Ser的SPME-LC-MS/MS定量分析方法,并应用于生物样品中P-Ser分离检测。主要内容包括如下两个部分:(1)在优化的合成条件下,以P-Ser为模板,丙烯酰胺为功能单体,甲醇和水为溶剂,在移液枪枪头,以水相合成法制备了P-Ser印迹聚合物整体柱。探究使P-Ser在常见有机溶剂中与交联剂(乙二醇二甲基丙烯酸酯)互溶的方法,通过四丁基氢氧化铵(TBAOH)的加入增加P-Ser在有机溶剂中的溶解性。考察了甲醇和水的用量对聚合效果的影响,用红外光谱、扫描电镜、热重分析、氮吸附解吸方法对材料的物理形貌和化学结构进行了表征,研究了材料的吸附机理,考察了该整体柱的选择性,在研究并优化了P-Ser的衍生方法的基础上,优化了萃取条件,建立了猪肝样品中P-Ser的SPME-HPLC-MS/MS分离检测方法,考察了方法的适用性并用于实际样品分析。该方法检出限(LOD,S/N=3)为2.5 ng g,日内日间RSD在0.48-4.4%范围内,回收率在95.5-100.4%范围内,结果满意。(2)在优化的合成条件下,在移液枪的枪头尖端制备了金属-有机杂化聚合物(MOPH)整体柱。通过层层自组装方法在聚合物孔表面合成Zr(Ⅳ)-2-氨基对苯二甲酸配位聚合物(Zr ATP)作为SPME介质,实现P-Ser的分离富集和HPLC-MS/MS分析。在聚合物整体柱中,以甲基丙烯酸(MAA)为功能单体与Zr ATP中金属离子作用,实现化学自组装。用红外光谱、扫描电镜、氮吸附、zeta电势和XPS光谱分析对材料的物理形貌和化学结构进行表征,探究了材料的吸附机理,优化了萃取条件,对SPME-LC-MS/MS方法进行考察,应用于猪肝样品中P-Ser的灵敏检测。该方法LOD(S/N=3)为2.2 ng g,日内日间RSD在2.8-5.7%范围内,回收率在93.6-104.0%范围内,实验结果良好。

关键词：磷酸化丝氨酸分子印迹整体柱金属-有机杂化聚合物固相微萃取 LC-MS/MS

含氟磷酸化丝氨酸/苏氨酸模拟物的合成及应用

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含氟磷酸化丝氨酸/苏氨酸模拟物的合成及应用

作者：康捷清华大学

学位级别：硕士

丝氨酸/苏氨酸磷酸化是重要的翻译后修饰过程,调控着蛋白质的活性并影响许多信号传导通路。磷酸化蛋白质和多肽对于研究磷酸化生物过程以及蛋白-蛋白相互作用等都具有重要的意义。但由于磷酸酯酶的存在,磷酸化在生物体系中并不稳定,给... 详细信息

丝氨酸/苏氨酸磷酸化是重要的翻译后修饰过程,调控着蛋白质的活性并影响许多信号传导通路。磷酸化蛋白质和多肽对于研究磷酸化生物过程以及蛋白-蛋白相互作用等都具有重要的意义。但由于磷酸酯酶的存在,磷酸化在生物体系中并不稳定,给研究带来了很大的挑战。因此发展非水解的磷酸化氨基酸模拟物十分有必要。使用亚甲基、二氟亚甲基代替氧原子的磷酸化模拟物由于与天然磷酸化氨基酸结构相似、且不会水解,应用较为广泛。其中,二氟亚甲基膦酸基的物理化学性质则更接近天然磷酸基,因此效果也更好。之前报道的含二氟亚甲基的磷酸化丝氨酸/苏氨酸模拟物的合成路线存在着价格昂贵或者路线冗长等问题,因此我们发展了一种新的具有立体选择性的合成策略,能高效合成含二氟亚甲基的磷酸化丝氨酸/苏氨酸模拟物(Phosphono-difluoromethyl-alanine/Phosphono-difluoromethyl-aminobutyrate,Pfa/Pfab),并利用前者模拟物,合成了能抵抗磷酸酯酶水解的14-3-3ζ蛋白的多肽抑制剂。在含二氟亚甲基的磷酸化丝氨酸模拟物的合成中,我们以廉价易得的丝氨酸衍生物Boc-Ser-OH为原料,将其转化为碘代烯烃后用二氟烷基膦酸酯取代,再通过不对称氢化还原得到所需构型的目标产物Boc-Pfa(Et)-OtBu,并进一步衍生,用于多肽固相合成。我们还选择了14-3-3ζ蛋白一种底物为模型肽,合成了含二氟亚甲基的磷酸化丝氨酸模拟物的多肽抑制剂。在含二氟亚甲基的磷酸化苏氨酸模拟物的合成中,我们以廉价易得的苏氨酸衍生物H-Thr-OMe·HCl为原料,在成功得到E型的卤代烯烃后用二氟烷基膦酸酯取代,然后用不对称氢化成功地一步构造了两个手性中心,得到与天然苏氨酸相同构型的产物Ac-Pfab(Et)-OMe(理论推测构型),并进一步衍生,得到Fmoc-Pfab-OH。总的来说,本论文成功地合成了含二氟亚甲基的磷酸化丝氨酸/苏氨酸模拟物,并将前者用于固相多肽合成,对于磷酸化蛋白质和多肽的研究具有重要意义。

关键词：磷酸化丝氨酸磷酸化苏氨酸非水解的模拟物 14-3-3ζ 不对称氢化

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蛋白质在羟基磷灰石界面吸附的研究

高分子学报 2017年第5期27卷 811-819页

作者：胡锦华李滟波周鹏江南大学食品科学与技术国家重点实验室江南大学食品学院无锡214122 江苏省食品安全与质量控制协同创新中心无锡214122

考察了酪蛋白酸钠(sodium caseinate,SC)和乳清分离蛋白(whey protein isolate,WPI)在表面性质不同的3种羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)颗粒上的界面吸附,分析了蛋白质的分子构型和HA颗粒的表面性质等因素对蛋白质在HA界面吸附的影响,... 详细信息

考察了酪蛋白酸钠(sodium caseinate,SC)和乳清分离蛋白(whey protein isolate,WPI)在表面性质不同的3种羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)颗粒上的界面吸附,分析了蛋白质的分子构型和HA颗粒的表面性质等因素对蛋白质在HA界面吸附的影响,重点讨论了SC和WPI肽链上磷酸化丝氨酸基团(phosphorylated serine residues,Ser-P)的数量和分布对吸附差异的影响.通过傅里叶变换红外光谱和表面电位分析发现SC和WPI无法被比表面积较小的HA颗粒有效吸附,但是在有效吸附面积较高的球状纳米HA和棒状微米HA上能够被吸附.Ser-P的存在使得SC在HA界面的吸附量更高、吸附能力更强.Ser-P数量和分布的不同则导致了SC中不同的蛋白组分在HA界面的竞争性吸附:β-酪蛋白在2μmHA界面始终存在优先吸附性;当纳米HA的浓度低于15 mg/mL时,纳米HA界面会优先吸附αs-酪蛋白.

关键词：磷酸化丝氨酸羟基磷灰石界面吸附酪蛋白酸钠乳清分离蛋白

补中益气汤含药血清对A549/DDP中p-Akt和P-gp表达的影响

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中国实验方剂学杂志 2013年第17期19卷 229-234页

作者：易佳丽井欢王莹刘亚莉刘春英辽宁中医药大学辽宁沈阳110847

目的:研究补中益气汤含药血清逆转人肺腺癌顺铂耐药细胞株(A549/DDP)耐顺铂(DDP)作用及其对磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(p-Akt)和P-糖蛋白(P-gp)表达的影响。方法:采用血清药理学方法制备含药血清,随机对照法将24只SD大鼠分为空白对照... 详细信息

目的:研究补中益气汤含药血清逆转人肺腺癌顺铂耐药细胞株(A549/DDP)耐顺铂(DDP)作用及其对磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(p-Akt)和P-糖蛋白(P-gp)表达的影响。方法:采用血清药理学方法制备含药血清,随机对照法将24只SD大鼠分为空白对照组(给生理盐水10 mL·kg-1),补中益气汤高、中、低剂量组(11.34,5.67,2.84 g·kg-1,10 mL·kg-1),每日ig给药1次,连续7 d后提取血清。将A549/DDP分为空白血清组,补中益气汤高、中、低剂量含药血清组,阻滞剂组,高剂量含药血清联合阻滞剂(LY294002)组,MTT法检测各组细胞对DDP的IC50,并计算耐药逆转倍数。免疫细胞化学法检测各组细胞中p-Akt和P-gp蛋白的表达;逆转录-多聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测各组细胞中Akt和P-gp的mRNA表达。结果:与空白血清组比较,补中益气汤中剂量以上的含药血清可明显降低A549/DDP对DDP的IC50(P<0.05),并呈浓度依赖效应,与阻滞剂联合效果最佳(P<0.05);与A549/DDP空白血清组相比,补中益气汤中、高剂量含药血清组,阻滞剂组和高剂量联合阻滞剂组的p-Akt和P-gp的表达显著下降(P<0.01,P<0.05),其中以高剂量联合阻滞剂组下降最多(P<0.01);与A549/DDP空白血清组相比,中、高剂量含药血清组,阻滞剂组和高剂量联合阻滞剂组的P-gp的mRNA表达量都显著减少(P<0.01,P<0.05),中、高剂量含药血清组,高剂量联合阻滞剂组的p-Akt的mRNA表达量也显著减少(P<0.05)。结论:补中益气汤含药血清可逆转A549/DDP细胞的顺铂耐药,与LY294002联合应用效果更佳,其逆转机制可能与减少细胞内p-Akt和P-gp的表达,增强A549/DDP对DDP的敏感性有关。

关键词： A549 DDP细胞株磷酸化丝氨酸苏氨酸蛋白激酶 P-糖蛋白补中益气汤多药耐药

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Stratifin蛋白在肿瘤中的研究进展

检验医学与临床 2023年第7期20卷 969-973页

作者：陈梦蝶万秀贤朱霞安仲武(综述) 何学明(审校) 徐州医科大学附属连云港东方医院呼吸内科江苏连云港222042 徐州医科大学附属连云港东方医院转化医学中心江苏连云港222042

14-3-3蛋白是一种相对分子质量为(28~30)×103的酸性糖蛋白,在所有真核细胞中普遍表达且进化上相对保守。14-3-3蛋白家族由7种亚型(β、γ、ε、η、ζ、σ、τ/θ)组成,在调控细胞增殖、分化、衰老、凋亡、迁移、侵袭、细胞内信号转导... 详细信息

14-3-3蛋白是一种相对分子质量为(28~30)×103的酸性糖蛋白,在所有真核细胞中普遍表达且进化上相对保守。14-3-3蛋白家族由7种亚型(β、γ、ε、η、ζ、σ、τ/θ)组成,在调控细胞增殖、分化、衰老、凋亡、迁移、侵袭、细胞内信号转导、细胞周期进程、炎症等过程中发挥作用。Stratifin蛋白(14-3-3σ)是14-3-3蛋白家族中较为独特的一种亚型,它是一种同型二聚体蛋白,内含两亲性结合槽,可以与磷酸化的蛋白质氨基酸位点结合,从而调控蛋白质功能。该文就14-3-3σ状态的变化,对肿瘤的周期调控,在肿瘤发生、发展中细胞行为和代谢改变的调控,与结合蛋白的相互作用和未来临床治疗的研究方向进行综述。

关键词： Stratifin蛋白磷酸化丝氨酸磷酸化苏氨酸结合蛋白

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PTEN与P-AKT在胃癌中的表达及意义

蚌埠医学院学报 2014年第3期39卷 291-294页

作者：张立功贾建光金鑫谢波承泽农钱军蚌埠医学院第一附属医院肿瘤外科安徽蚌埠233004 蚌埠医学院第一附属医院病理科安徽蚌埠233004

目的:检测人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)与磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B(P-AKT)在胃癌和癌旁组织中的表达,探讨它们在胃癌发生、发展中的作用。方法:应用免疫组织化学EliVision法,检测68例胃癌及其癌旁组织中PTE... 详细信息

目的:检测人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)与磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B(P-AKT)在胃癌和癌旁组织中的表达,探讨它们在胃癌发生、发展中的作用。方法:应用免疫组织化学EliVision法,检测68例胃癌及其癌旁组织中PTEN和P-AKT蛋白表达水平,同时对68例胃癌和癌旁组织采用反转录-聚合酶链反应检测其中PTEN mRNA的表达。结果:PTEN蛋白在胃癌组织中表达低于癌旁组织(P0.05),但在分化程度、肿瘤大小、临床分期和淋巴结转移表达差异均有统计意义(P0.05),但在分化程度、临床分期和淋巴结转移间表达差异均有统计学意义(P<0.05)。胃癌组织PTEN mRNA的半定量表达明显低于癌旁组织PTEN mRNA的半定量表达(P<0.01)。结论:PTEN基因在胃癌组织中低表达,癌旁组织蛋白表达也明显高于胃癌组织,P-AKT蛋白在胃癌组织中的表达高于癌旁组织,两者在胃癌中的表达呈负相关。

关键词：胃肿瘤人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因磷酸化丝氨酸苏氨酸蛋白激酶B 免疫组织化学

大肠癌中pAkt、VEGF和MVD的检测及其临床意义

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诊断病理学杂志 2009年第5期16卷 337-339页

作者：谢明杨翅梁红陈凯解放军第422医院病理科广东湛江524000

目的检测大肠癌组织磷酸化丝氨酸/苏氨酸激酶(pAkt)、血管内皮生长因子(VEGF)的表达和微血管密度(MVD)及其临床意义。方法应用免疫组化SP法检测76例大肠癌的pAkt、VEGF和MVD。结果大肠癌pAkt和VEGF的阳性表达率分别为73.7%(56/76)和85.5... 详细信息

目的检测大肠癌组织磷酸化丝氨酸/苏氨酸激酶(pAkt)、血管内皮生长因子(VEGF)的表达和微血管密度(MVD)及其临床意义。方法应用免疫组化SP法检测76例大肠癌的pAkt、VEGF和MVD。结果大肠癌pAkt和VEGF的阳性表达率分别为73.7%(56/76)和85.5%(65/76)。pAkt的阳性表达与肿瘤浸润深度、临床分期和淋巴结转移(P<0.05)及其MVD(P<0.01)显著相关。pAkt阳性组的MVD明显高于阴性组。VEGF的阳性表达与大肠癌的临床分期显著相关(P<0.05)。pAkt蛋白表达与VEGF蛋白表达密切相关(P<0.05)。结论pAkt和VEGF与大肠癌发生、发展和转移密切相关,提示阻断pI3K/Akt信号传导通路将对大肠癌的治疗提供新的靶点。

关键词：大肠肿瘤磷酸化丝氨酸苏氨酸激酶血管内皮生长因子微血管密度

抑癌基因PTEN与pAkt在肝细胞肝癌中表达及其意义

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中国医师杂志 2005年第12期7卷 1585-1588页

作者：刘恩宇易继林宋炜李兴睿周旭陈晚平华中科技大学同济医学院附属同济医院普外科山东省兖矿集团总院肝胆外科

目的研究肝细胞癌(HCC)中抑癌基因第10号染色体上缺失与张力蛋白同源的磷酸酯酶基因(PTEN)与磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B(pAkt)表达及其意义。方法采用免疫组化S-P法检测65例HCC及癌旁组织中PTEN与pAkt表达并分析两者与肝癌患者年龄... 详细信息

目的研究肝细胞癌(HCC)中抑癌基因第10号染色体上缺失与张力蛋白同源的磷酸酯酶基因(PTEN)与磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B(pAkt)表达及其意义。方法采用免疫组化S-P法检测65例HCC及癌旁组织中PTEN与pAkt表达并分析两者与肝癌患者年龄、临床分期、病理类型及侵袭转移性之间关系。结果HCC中PTEN蛋白阳性率明显低于癌旁肝组织,且随HCC恶性程度、侵袭转移性升高而显著下降(P<0.05);pAkt在HCC中表达率明显高于癌旁肝组织,且其表达率随HCC恶性程度、侵袭转移性升高而增加(P<0.05);肝癌及癌旁组织中,PTEN与pAkt表达均呈负相关(P<0.01)。结论PTEN与pAkt表达与肝癌组织恶性程度相关,联合检测PTEN与pAkt在癌组织中表达情况,可作为肿瘤预后评估指标之一。

关键词：抑癌基因肝细胞肝癌基因表达染色体磷酸酯酶基因磷酸化丝氨酸苏氨酸蛋白激酶B