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重庆医学 2014年第18期43卷 2308-2311页

作者：韩小建万玉英危永芳杨章坚张剑锋南昌大学转化医学研究院南昌330031 南昌大学第二附属医院感染管理科南昌330006

目的通过原核细胞表达和纯化9R-GFP-PHD重组蛋白,并利用纯化后的9R-GFP-PHD蛋白来检测与磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)和IP3的结合能力以及细胞膜上PIP2的动态变化。方法通过分子克隆技术将磷脂酶C-δ1的普列克同源域(PHD)、荧光蛋白GFP... 详细信息

目的通过原核细胞表达和纯化9R-GFP-PHD重组蛋白,并利用纯化后的9R-GFP-PHD蛋白来检测与磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)和IP3的结合能力以及细胞膜上PIP2的动态变化。方法通过分子克隆技术将磷脂酶C-δ1的普列克同源域(PHD)、荧光蛋白GFP及细胞穿膜多肽9R融合以构建相应蛋白表达载体。利用原核表达体系BL21大肠埃希菌和镍柱进行重组蛋白的表达和纯化,其中GFP和9R-GFP为9R-GFP-PHD的对照蛋白。获取重组蛋白后,通过同位素实验和液体闪烁计数器,分别检测和比较GFP、9R-GFP和9R-GFP-PHD与[3H]标记的PIP2和IP3的结合能力以及之间的竞争性抑制。另外,利用MDCK细胞检测和比较孵育的GFP、9R-GFP和9R-GFP-PHD后,3种重组蛋白在细胞内的分布情况。通过图片相减处理和荧光实时定量分析MDCK细胞膜上的9R-GFP-PHD在ATP刺激后分布的动态变化,从而间接反映细胞膜上PIP2的水解变化。结果通过原核表达和镍柱纯化体系顺利获得了GFP、9R-GFP和9R-GFP-PHD重组蛋白。体外结合实验证实9R-GFP-PHD与PIP2和IP3均有很强的结合能力,而且IP3能竞争性抑制9R-GFP-PHD与PIP2的结合。在孵育了3种荧光融合蛋白后,荧光共聚焦显微镜观察发现9R-GFP主要分布在细胞质中,而9R-GFP-PHD特异性分布于细胞膜上。荧光实时定量分析显示,ATP刺激通过P2y受体激活磷脂酶C以水解PIP2,从而使MDCK细胞膜上的9R-GFP-PHD减少20%左右。结论本研究中构建的9R-GFP-PHD利用了细胞穿膜多肽、PHD与PIP2和IP3结合特性及GFP的荧光可视和定量分析特性,有效地检测细胞膜上PIP2的动态变化,将为今后进一步研究细胞内钙动员提供新的工具蛋白。

关键词： C型磷脂酶类穿膜多肽普列克同源域磷脂酰肌醇4,5-二磷酸肌醇1,4,5-三磷酸

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水稻磷脂酶C(OsPLC1)胞内定位和水解底物的研究

水稻磷脂酶C(OsPLC1)胞内定位和水解底物的研究

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作者：严沛雯南京农业大学

学位级别：硕士

磷脂信号在植物生长发育和逆境应对方面都具有重要作用,因此磷脂信号通路一直是研究的热点。磷脂酶能够水解细胞膜上的磷脂,并产生一系列的信号分子,因此在磷脂信号通路中起着重要作用。磷脂酶按其水解磷脂的部位不同,可以分为磷脂酶A(p... 详细信息

磷脂信号在植物生长发育和逆境应对方面都具有重要作用,因此磷脂信号通路一直是研究的热点。磷脂酶能够水解细胞膜上的磷脂,并产生一系列的信号分子,因此在磷脂信号通路中起着重要作用。磷脂酶按其水解磷脂的部位不同,可以分为磷脂酶A(phospholipase A,PLA)、磷脂酶 C(phospholipase C,PLC)、磷脂酶 D(phospholipase D,PLD)。其中植物磷脂酶C按其作用底物的不同可分为底物非特异性磷脂酶C(nonspecific phospholipase C,NPC)和磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(phosphoinositide-specific phospholipase C,PI-PLC)。生物信息学的资料显示,水稻中存在4个PI-PLC,但作用机理尚不明确。本论文以水稻OsPLC1基因为研究对象,以实验室已鉴定出的水稻野生型(日本晴)和Tos17单拷贝插入的OsPLC1缺失突变体为材料,初步探究了水稻PI-PLC家族中OsPLC1的胞内定位情况及其对水解底物的情况。具体研究如下:我们构建了OsPLC1自身启动子启动的GFP-OsPLC1表达载体,在烟草中表达ProPLC1::GFP-OsPLC1融合蛋白,发现OsPLC1自身启动子启动的GFP-OsPLC1定位在质膜和靠近质膜的细胞质中,这与实验室之前研究的pSuper::GFP-OsPLC1在烟草中的定位情况一致。随后为了进一步确定OsPLC1的定位情况,我们将两种启动子启动的GFP-OsPLC1永久表达载体通告转基因技术转入野生型中,结果只获得了稳定遗传的pSuper::GFP-OsPLC1的转基因植株。随后用激光共聚焦观察转基因植株中OsPLC1的定位,得出了和烟草中同样的结论,即OsPLC1定位在质膜和靠近质膜的细胞质中。为了进一步验证OsPLC1的定位,我们用两相法分离转基因植株的细胞质膜和胞质,随后用GFP抗体进行蛋白免疫印迹试验,结果表明质膜和胞质中均存在GFP-OsPLC1。且当盐处理15 min后,质膜GFP-OsPLC1明显增多,而胞质GFP-OsPLC1有所减少。因此我们推测正常生长情况下,OsPLC1主要存在于胞质中,而当植株受到盐胁迫后,胞质中的OsPLC1会迅速锚定在质膜,水解底物,从而参与盐胁迫响应。蛋白免疫印迹试验结果还显示,质膜GFP-OsPLC1分子量略大于胞质质膜GFP-OsPLC1,这可能与质膜上的OsPLC1被修饰有关。另外,我们试图通过酵母双杂技术筛选出与OsPLC1互作的蛋白,筛选得到了定位在胞质中的JOKA2,它是否与胞质中的OsPLC 1行使功能有关,还需要进一步的验证。在动物和植物经典研究中,PLC主要水解磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(phosphatidyl-inositol 4,5-bisphosphate,PtdIns(4,5)P2)。但是经研究发现,植物细胞中磷脂酰肌醇4-磷酸(phosphatidylinositol 4-phosphate,PtdIns4P)含量远高于PtdIns(4,5)P2,并被推测它也有作为PLC底物的可能,但缺乏证据。本论文对OsPLC1的两个可能的水解底物PtdIns4P和PtdIns(4,5)P2在体内的水解情况进行了初步研究。我们分别克隆了 PtdIns4P和PtdIns(4,5)P2的特异性结合片段PHFAPP1和PHPLCδ1,构建了Super启动的PHFAPP1-GFP和PHPLCδ1-GFP的永久表达载体,通过转基因技术将这两个永久表达载体分别转入水稻野生型(WT)和突变体(osplc1)中。首先观察两者在水稻中的定位,结果显示PHFAPP1和PHPLCδ1均主要定位在细胞质膜上,提示PtdIns4P和PtdIns(4,5)P2主要分布在膜上,且PtdIns4P在水稻根部呈现极性分布。但是PHPLCδ1在胞质中也存在,这可能是因为细胞中的 PtdIns(4,5)P2含量很低(van Leeuwen et al,2007),而过量的PHPLCδ1-GFP无法与PtdIns(4,5)P2结合,从而游离在细胞质中。随后以PHFAPP1-GFP在野生型和突变体中的转基因阳性植株为材料,利用激光共聚焦显微镜检测75 mMNaC1处理下,水稻主根中PtdIns4P含量的变化。实验结果发现,正常生长条件下,野生型PtdIns4P含量低于突变体,在盐处理后,野生型PtdIns4P含量有明显下降,突变体中PtdIns4P含量呈现略有上升的趋势。随后我们又利用薄层层析和气相色谱技术对150mMNaCl处理前后野生型和突变体PtdIns4P含量进行测定。PtdIns4P含量变化趋势与之前使用探针相一致。因此,我们推测野生型中PtdIns4P含量在盐处理后的降低是由于OsPL

关键词：水稻水稻磷脂酶C1 盐胁迫磷脂酰肌醇4-磷酸磷脂酰肌醇4,5-二磷酸

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