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量子点-磁珠传感体系的构建及其对肺癌标志物miRNA的检测

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量子点-磁珠传感体系的构建及其对肺癌标志物miRNA的检测

作者：谭国梁南京邮电大学

学位级别：硕士

量子点(Quantum Dot,QD)是一种半导体纳米材料,它具有许多特殊的光学性质,包括:高量子产率、高摩尔消光系数、宽范围的吸收谱、窄而且对称的荧光光谱、大的斯托克斯位移和高的光化学稳定性。量子点的这些特性使它们在诊断和生物成像等... 详细信息

量子点(Quantum Dot,QD)是一种半导体纳米材料,它具有许多特殊的光学性质,包括:高量子产率、高摩尔消光系数、宽范围的吸收谱、窄而且对称的荧光光谱、大的斯托克斯位移和高的光化学稳定性。量子点的这些特性使它们在诊断和生物成像等领域展现出广泛的应用前景。肺癌是一种恶性肿瘤,致死率非常高。发展有效的肺癌标志物检测技术具有重要的科学意义和应用价值。作为一类新型的肺癌生物标志物,微小核糖核酸(micro RNA或mi RNA)已经吸引了研究人员的广泛关注。mi RNA是一类由185个核苷酸构成的非编码单链RNA。mi RNA的异常表达在肿瘤中普遍存在,且具有组织特异性,因而可以作为肿瘤检测的标志物。研究表明,mi RNA涉及到肺癌的多个阶段,包括肿瘤发展、癌细胞侵袭和转移等,因此mi RNA可以用作肺癌检测的生物标志物。在肿瘤的早期,血清中的肿瘤mi RNA标志物的浓度是非常低的,因此需要设计检测灵敏度足够高的传感器来检测微量的mi RNA。另一方面,某种特定的肿瘤不是由单一的mi RNA所调控,通常是多个高度相关的mi RNA同时调控,而单一mi RNA的检测特异性和灵敏度仍不够高,因此联合检测多种mi RNA是进行肿瘤早期检测的一种可行思路。本文通过构建量子点-磁珠(QD-MB)生物传感体系用于实现对肺癌标志物mi RNA的高灵敏、高特异性的多元检测。***-MB生物传感器的构建及其对肺癌mi RNA标志物的检测。首先,利用生物素化的单链DNA分别与链酶亲和素功能化的量子点与磁珠构建mi RNA检测的探针:QD-DNA探针和MB-DNA探针;在含有QD-DNA和MB-DNA探针的缓冲液中加入目标肺癌标志物mi RNA后,两种探针分别与mi RNA发生碱基互补配对,形成一个“QD-DNA-mi RNA-DNA-MB”的三明治结构;接着用磁分离技术使未被MB-DNA探针捕获的QD-DNA探针与已经形成三明治结构的QD-DNA探针分离,通过检测上清液中残留的QD的荧光强度,发现随着目标mi RNA浓度的增大,量子点的荧光强度逐渐降低,通过对比未加入mi RNA靶分子前的荧光强度,可实现对mi RNA的定量检测。在工作中,我们构建QD-DNA-200b和QD-DNA-21两种不同的QD-DNA探针,并构建了对应的MB-DNA-200b、MB-DNA-21两种不同的MB-DNA探针,分别用于检测两种不同的肺癌标志物:mi RNA-200b和mi RNA-21。在Tris-HCl缓冲液中,mi RNA-200b的检测限达到0.73 fM,检测线性范围是10 fM-10 p M,mi RNA-21检测限达到1.16 fM,检测线性范围是10 fM-100 p M。为研究传感器的抗干扰能力,我们进一步利用QD-MB生物传感器对血清中的mi RNA进行了检测。在1%血清中,mi RNA-200b的检测限达到6.09 fM,检测线性范围是10 fM-10 p M;mi RNA-21检测限是3.90 fM,检测线性范围是10fM-100 p M。另外,通过对单碱基错配mi RNA和随机序列mi RNA的检测表明QD-MB传感器具有较好的检测特异性。本传感器可以实现两种肺癌标志物mi RNA-200b和mi RNA-21的同时检测,具有较高的检测灵敏度和较宽的检测范围,而且具有良好的特异性和抗干扰能力,为肺癌的早期诊断提供了技术支持。2.基于双链特异性核酸内切酶(Duplex-specific nuclease,DSN)的QD-MB核酸传感器的构建及其检测应用。DSN能够高选择性地识别并切割完全匹配的DNA双链或者RNA/DNA杂交双链中的DNA,而对单链DNA、RNA或者双链RNA没有作用。基于DSN的特异性剪切能力,我们设计了基于DSN信号放大的QD-MB荧光传感体系。首先,我们以mi RNA-21为靶分子构建了基于DSN放大的QD-MB核酸传感器。加入目标mi RNA-21与MB-DNA探针形成DNA-RNA双链,双链中的DNA可被DSN特异性切割,导致mi RNA-21被释放出来后可以继续与DNA探针杂交,引起DSN酶的对DNA探针的循环剪切,剪切完毕后与QD-DNA探针杂交,磁分离后检测上清液量子点的荧光信号。研究发现,随着加入mi RNA-21浓度的增大,量子点的荧光强度逐渐增大。该传感器的检测范围为1 p M-10 nM,达到4个数量级,检测限达到120 fM。

关键词：量子点磁珠肺癌 miRNA DSN

金属螯合磁珠纯化组氨酸标签蛋白及其抗菌研究

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金属螯合磁珠纯化组氨酸标签蛋白及其抗菌研究

作者：曾凯武汉理工大学

学位级别：硕士

细菌生物膜会导致细菌耐药性和对人体免疫系统的耐受力,从而引起难以清除的感染问题。这一问题可以通过使用水解生物膜的酶来解决。其中分散蛋白B(Dispersin B,DspB)就是一种备受关注的水解生物膜的酶。虽然不少抗菌修饰策略已经被用于... 详细信息

细菌生物膜会导致细菌耐药性和对人体免疫系统的耐受力,从而引起难以清除的感染问题。这一问题可以通过使用水解生物膜的酶来解决。其中分散蛋白B(Dispersin B,DspB)就是一种备受关注的水解生物膜的酶。虽然不少抗菌修饰策略已经被用于植入物的表面改性,在短期内可以达到很好的抗菌效果,但是远期抗菌问题仍然很严峻。因为植入物在体内长期停留后,其表面的抗菌成分可能会脱落或被人体降解,所以仍然面临细菌生物膜感染的问题。因为磁珠具有良好的磁响应性和高载药率,而且可以在外部磁场的作用下实现靶向,所以在生物医学领域已经有了很好的应用。因此,我们提出使用磁珠固定化具有水解生物膜功能的酶,应用于植入物表面生物膜的水解。首先开发了5种不同的金属螯合磁珠,然后用于纯化DspB,并使用磁珠进行固定化。最后将共价固定的DspB用于抑制或水解生物膜。具体如下:(1)金属螯合磁珠的制备和应用。本论文制备金属螯合磁珠的方法有别于多数金属螯合磁珠层层向外合成的策略。我们用液液反应先合成带有硅烷偶联剂的IDA、ECH-IDA、TED、Asp、CM-Asp五种配体,然后再通过固液反应将配体修饰到已合成的FeO@Si O表面,获得了可以螯合金属离子的FeO-Si O-IDA、FeO-Si O-TED、FeO-Si O-APTES-ECH-IDA、FeO@Si O@Asp和FeO@Si O@CM-Asp磁珠。SDS-PAGE图像结果显示,5种金属螯合磁珠对组氨酸标签蛋白都有很高的选择性,能一步实现目标蛋白的纯化和固定化,其选择性是基于Ni对组氨酸标签的选择性。还发现,FeO@Si O@Asp和FeO@Si O@CM-Asp分别螯合Zn、Cu、Ni后,洗脱DspB的总量、酶活力回收率和纯化倍数均符合Zn磁珠对DspB的吸附符合准二级动力学模型和Langmuir等温模型,说明吸附过程以化学吸附为主,是单分子层吸附。而且?G都是负值,均小于-32k J/mol,说明金属螯合磁珠吸附DspB的过程是自发的。值得注意的是,螯合三种金属离子后,均是FeO@Si O@Asp的K比FeO@Si O@CM-Asp大。这说明前者具有更高的亲和力和结合稳定性。这些结果说明制备的金属螯合磁珠具有纯化和固定酶的潜力。(2)金属螯合磁珠一步纯化和固定化DspB。利用制备的FeO-Si O-IDA-Ni、FeO-Si O-TED-Ni和FeO-Si O-APTES-ECH-IDA-Ni实现了DspB的一步纯化和固定化。结果显示,游离DspB最适p H在p H 5.0,磁珠固定化DspB的最适p H在p H 5.5。在4储存21天后,固定化的DspB分别保留了初始活性的54%、40%和77%,而游离的DspB仅保留了初始活性的37%。在重复使用6次后,固定化DspB分别保留了62%、54%和39%的初始酶活。和游离的DspB相比,金属螯合磁珠固定化DspB的K均变小。这些说明固定化DspB拥有良好的储存稳定性、操作稳定性和底物亲和力,而且具有抗菌的潜力。(3)DspB的共价固定化与抗菌研究。使用FeO@Si O-GA和FeO@Si O@PDA实现了DspB的固定化。FTIR光谱在1613 cm、1509 cm和1453 cm处出现了与苯环的C=C和醛亚胺(-CH=N-)有关的特征吸收峰。而且固定化DspB后,磁珠的Zeta电位均降低。FeO@Si O-GA和FeO@Si O@PDA固定化DspB的最适p H从游离DspB的5.0分别移动到了5.8和6.0。此外,研究发现低浓度和高浓度的固定化DspB都有水解***和***生物膜的能力。而且,游离和固定化DspB,以及FeO@Si O-GA和FeO@Si O@PDA对***生物膜的形成有明显的抑制效果,且存在浓度依赖关系。这些结果表明已实现了DspB的共价固定化,而且具备应用于体内的潜力。通过以上研究,我们制备了5种不同的可用于一步纯化和固定化DspB等组氨酸标签蛋白的磁珠和2种不同的用于共价固定化抗菌酶的磁珠。然后测试了游离和固定化DspB的酶活力和体外抗菌活性,为解决植入物感染问题提供了参考。

关键词：磁珠亲和纯化固定化细菌生物膜水解

基于SELEX技术筛选前白蛋白的核酸适配体及磁珠适配体传感器检测细菌内毒素的应用

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基于SELEX技术筛选前白蛋白的核酸适配体及磁珠适配体传感器检测...

作者：左明艳中国科学技术大学

学位级别：硕士

核酸适配体是一种可以与特定靶标分子特异性结合的单链DNA分子或者单链RNA分子,可以与核酸适配体结合的靶标分子范围非常的广,小到无机粒子、有机分子、蛋白分子,大到细胞、组织都可以是核酸适配体的靶标。核酸适配体具有高特异性,高亲... 详细信息

核酸适配体是一种可以与特定靶标分子特异性结合的单链DNA分子或者单链RNA分子,可以与核酸适配体结合的靶标分子范围非常的广,小到无机粒子、有机分子、蛋白分子,大到细胞、组织都可以是核酸适配体的靶标。核酸适配体具有高特异性,高亲和力,合成成本低,合成纯度高,性能稳定,运输和储存成本低等优势,因此核酸适配体已经广泛的应用于生命科学研究、药物筛选、靶点鉴定、环境监测等各个领域。核酸适配体的制备过程被称为“配体指数富集系统进化”技术,即SELEX技术。前白蛋白是由肝细胞合成的一种血清蛋白质,正常人血清中前白蛋白的含量是200-400mg/L,在肝硬化患者体内含量异常,是肝硬化患者肝脏病变检测的敏感指标。本文的工作围绕着磁珠-SELEX技术筛选前白蛋白的核酸适配体展丌,实验包括初始寡核苷酸随机文库设计,磁珠-SELEX法筛选、Q-PCR扩增、单链的分离和制备以及12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测亲和力等实验环节,但是该筛选工作并没有得到正向筛选结果。细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁外膜的主要组成成分,又被称为脂多糖(LPS),是检测革兰氏阴性菌病原体感染的标志物。本文通过两条能够与内毒素高亲和力相互作用的核酸适配体,成功的构建了细菌内毒素与其两条核酸适配体相互作用形成的三明治夹心结构复合物,并在此基础上制备出可用于检测细菌内毒素的磁珠适配体传感器。通过激光共聚焦显微镜(LSCM)观察磁珠表面三明治夹心结构复合物中核酸适配体B9末端修饰的羟基荧光素在488nm激发光和525nm发射光的荧光发光,从而确定细菌内毒素与其两条核酸适配体B2和B9能够形成三明治夹心结构复合物。磁珠适配体传感器在BSA蛋白、蔗糖、葡萄糖、tRNA共存的溶液中的检测细菌内毒素,其检测灵敏度可以达到10-8mg/mL。在10-8-100mg/mL的浓度范围内随着溶液中细菌内毒素浓度的增加,磁珠适配体传感器检测细菌内毒素捕捉到的荧光信号也随之增强。结合有细菌内毒素的磁珠适配体传感器在加热到95℃的条件下可以实现多次再生以及再生后重复使用。本实验中,经过七次再生后的磁珠适配体传感器用于检测溶液中的细菌内毒素的性能稳定,其相对标准偏差仅为5.5%。磁珠适配体传感器检测溶液中的细菌内毒素操作简单,基于流式细胞仪96孔板检测时,可以同时处理数十至上百个样品而不增加更多的时间成本和经济成本。同时,用流式细胞仪96孔板自动进样检测可以在30min左右的时间快速的获得96个样品的检测结果。磁珠适配体传感器检测时的样品消耗量少,检测结果重复稳定性好,受到杂质和细菌内毒素共存物的影响可以忽略不计。这种基于流式细胞仪检测的磁珠适配体传感器,为自动化和高通量检测溶液中的细菌内毒素的含量提供了可能。

关键词： SELEX技术核酸适配体磁珠前白蛋白生物传感器细菌内毒素流式细胞仪

基于毛细管的磁珠微流控DNA富集提取系统的研究

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基于毛细管的磁珠微流控DNA富集提取系统的研究

作者：沈玉勤浙江大学

学位级别：硕士

新一代分析技术总的发展方向是更加微型化、自动化、快速化和集成化,而近几年出现的微流控分析(Microfluidic analysis)正是为实现这一目标服务的主要领域之一。微流控分析在其发展过程中结合了越来越多的技术,而这些技术又推动了微流... 详细信息

新一代分析技术总的发展方向是更加微型化、自动化、快速化和集成化,而近几年出现的微流控分析(Microfluidic analysis)正是为实现这一目标服务的主要领域之一。微流控分析在其发展过程中结合了越来越多的技术,而这些技术又推动了微流控分析领域的不断发展。比如磁场和磁性粒子与微流控系统的结合,虽然时间并不长,但已在分离分选、控制、捕获、传输和混合上得到很多应用,遍及生物、医药、化学、物理、药物等各个领域。在微流控芯片上使用磁珠提取DNA已经有了很多的报道,集成化程度也很高,但是芯片系统加工比较繁琐。本工作的主要内容是建立基于毛细管的微流控磁珠DNA提取系统。第一章介绍了在微流控领域利用磁性物质和磁场进行微流控操作的进展领域结合产生的功能及其主要运用。第二章中介绍了基于毛细管的微流控磁珠DNA提取系统。系统基于毛细管构建,结构简单,不需采用昂贵的微加工设备和复杂的微加工技术。系统采用重力驱动液流,操作方便。系统被应用于全血中DNA的提取。

关键词：微流控系统 DNA提取毛细管磁珠

食品中常见病原菌快速检测系统研究——裸磁珠制备及TaqMan实时荧光PCR快速检测芽胞杆菌Ⅰ群大细胞群

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食品中常见病原菌快速检测系统研究——裸磁珠制备及TaqMan实时荧...

作者：沈圣四川大学

学位级别：硕士

目的为建立以磁分离技术为核心的分离系统，摸索制备具有非特异吸附性能的裸磁珠及其包被的条件，为下一阶段免疫磁珠的制备奠定基础。同时建立以蜡样芽胞杆菌为代表的芽胞杆菌Ⅰ群大细胞群细菌的TaqMan实时荧光PCR快速检测方法，并对... 详细信息

目的为建立以磁分离技术为核心的分离系统，摸索制备具有非特异吸附性能的裸磁珠及其包被的条件，为下一阶段免疫磁珠的制备奠定基础。同时建立以蜡样芽胞杆菌为代表的芽胞杆菌Ⅰ群大细胞群细菌的TaqMan实时荧光PCR快速检测方法，并对该方法进行了初步的优化、评价及应用。方法本研究分为两部分内容： 1裸磁珠的制备及包被 1．1磁珠的制备 Fe和Fe分别与OH离子反应生成Fe(OH)和Fe(OH)，Fe(OH)和Fe(OH)不稳定，分别降解生成FeO和FeO，即最后生成了FeO。用蒸馏水洗涤磁珠至中性，并用磁分离架进行分离。 1．2磁珠的包被以1％的醋酸溶解壳聚糖，将壳聚糖包被于制备好的裸磁珠表面后，进而再包被上作为交联剂的戊二醛。 2 TaqMan实时荧光PCR快速检测芽胞杆菌Ⅰ群大细胞群细菌方法的建立通过比较大量芽胞杆菌Ⅰ群大细胞群细菌的特异性基因，最终选择ITS基因作为检测的目的片段。从GenBank中下载ITS基因序列并进行同源性比较，选择保守区段进行引物和探针的设计。对比CTAB法和硅胶模型基因组DNA提取法两种DNA提取方法，选取实时荧光PCR快速检测方法建立初期，合适的DNA标准制备方法。同时，通过优化引物浓度、退火温度、探针浓度、Mg浓度、dNTPs浓度、Taq酶浓度以及缓冲液浓度，以建立起TaqMan实时荧光PCR快速检测芽胞杆菌Ⅰ群大细胞群细菌的方法。最后，检验该方法的灵敏度和特异性，并对模拟样品进行了检测。结果 1磁珠的制备和包被成功制备出裸磁珠，经透射电镜观察，裸磁珠直径达到纳米级，制备的磁珠在溶液中悬浮性较好，在磁场的作用下可较好的分离该磁性微粒。壳聚糖溶解于1％醋酸后用于包被制备的磁珠，包被磁珠体积增大，可用于连接抗体，为后续免疫磁珠的制备奠定了基础。 2选取16S-23S rDNA基因间区序列作为目的基因设计引物和探针如下：上游引物：5′-GAGTCCATTTAGGCCCACCATAC-3′下游引物：5′-AGCTTGGCGACTGGAGGACGC-3′TaqMan探针：5′-FAM-CAAGGCAGGCGCTCTCCCAGCTGAG-TAMRA-3′ 经过优化，成功建立了以蜡样芽胞杆菌为代表的芽胞杆菌Ⅰ群大细胞群TaqMan实时荧光PCR的快速检测方法，优化后的反应体系如下表所示。并通过比较，最终选取硅胶模型基因组DNA提取法，成功制备了该检测方法的DNA初标准。同时该方法的评测结果显示，该方法的检测灵敏度达到172fg，菌液灵敏度达到22cfu／反应体系;且该方法特异性较好，可同时检测包括蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、蕈状芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌在内的4种芽胞杆菌Ⅰ群大细胞群细菌。结论本研究为建立常见食源性病原菌快速检测系统，在分离手段上成功制备了纳米级的裸磁珠和包被磁珠，为下一步免疫磁珠的建立奠定了良好的基础。同时，成功建立了芽胞杆菌Ⅰ群大细胞群TaqMan实时荧光PCR快速检测方法，为芽胞杆菌Ⅰ群大细胞群细菌引起的食物中毒检测提供了又一灵敏、特异的方法。

关键词：快速检测食源性疾病食源性病原菌磁珠芽胞杆菌I群大细胞群蜡样芽胞杆菌实时荧光PCR TaqMan探针

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耳穴磁珠贴压干预脑卒中患者便秘的临床研究

耳穴磁珠贴压干预脑卒中患者便秘的临床研究

作者：吕丽敏福建中医药大学

学位级别：硕士

目的观察耳穴磁珠贴压干预脑卒中便秘患者的临床疗效,以寻求一种客观有效、易于操作的中医护理方法,为脑卒中便秘患者提供新的护理方法。方法根据纳入标准和排除标准选取2011年3月～2011年11月福建省人民医院脑病科脑卒中并有便秘的住... 详细信息

目的观察耳穴磁珠贴压干预脑卒中便秘患者的临床疗效,以寻求一种客观有效、易于操作的中医护理方法,为脑卒中便秘患者提供新的护理方法。方法根据纳入标准和排除标准选取2011年3月～2011年11月福建省人民医院脑病科脑卒中并有便秘的住院患者共65例,随机分为干预组32例和对照组33例。对照组采取常规治疗和护理,干预组在常规治疗和护理的基础上予以耳穴磁珠贴压,每次每穴按压4min,4次/天,双耳交替贴压,连续干预2周。观察2组患者干预前后首次排便时间、肠鸣音次数、血清一氧化氮(NO)、便秘临床症状评分等指标,进行对比分析以综合评估疗效,收集的数据采用SPSS 17.0统计软件分析。结果1.65例患者中,60例参与完成整个研究过程,脱落病例5例。2.一般资料：2组患者在年龄、性别、病程、卒中类型、便秘辨证分型诸方面比较差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。3.首次排便时间：2组患者首次排便时间分别为干预组(20.11±7.67)h和对照组(26.06±10.98)h,两组比较差异有统计学意义(P0.05),具有可比性;2组干预后血清NO的改善比较差异有统计学意义(P0.05),具有可比性;2组干预后肠鸣音次数比较差异有统计学意义(P0.05),具有可比性;2组干预后排便性状评分比较差异无统计学意义(P>0.05),其余各单项便秘临床症状评分比较差异均有统计学意义(P磁珠贴压疗法配合常规护理和治疗方法干预脑卒中便秘患者,对便秘具有一定的改善作用,能缩短首次排便时间,改善血清NO和恢复肠鸣音次数,改善便秘的临床症状,对脑卒中便秘患者的干预疗效优于常规的治疗和护理方法,且具有一定的持续效应,副作用少,提示耳穴磁珠贴压疗法是改善脑卒中后便秘的一种简单、有效的护理方法。

关键词：耳穴贴压磁珠脑卒中便秘

基于适配子功能化磁珠快速检测人巨细胞病毒PP65抗原的实验研究

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基于适配子功能化磁珠快速检测人巨细胞病毒PP65抗原的实验研究

作者：夏宇第三军医大学

学位级别：硕士

背景：人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus，HCMV）即人疱疹病毒5型，属疱疹病毒科乙组疱疹亚科。HCMV以人为唯一宿主，在人群中广泛传播，人群感染率在50%以上，但大多数感染者无临床症状，病毒长期潜伏于宿主细胞，呈隐性感染。HCM... 详细信息

背景：人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus，HCMV）即人疱疹病毒5型，属疱疹病毒科乙组疱疹亚科。HCMV以人为唯一宿主，在人群中广泛传播，人群感染率在50%以上，但大多数感染者无临床症状，病毒长期潜伏于宿主细胞，呈隐性感染。HCMV易引起孕妇活动性感染从而造成胎儿先天感染，导致妊娠失败及新生儿发育迟缓等;在免疫系统发育不全及免疫功能受损或抑制等特定人群中，潜伏病毒被激活、增殖从而发生严重活动性感染，具有较高的发病率和死亡率。目前尚无有效的预防疫苗，感染治疗仅仅依靠有限的几种抗病毒药物，近年来，HCMV耐药病毒株的感染问题日益突出。因此，建立可靠的早期诊断方法是有效防治病毒感染的关键环节。现有研究表明,HCMV的一些包壳蛋白在病毒的整个生命周期中发挥重要作用，包括病毒的侵入，基因表达，免疫逃逸，病毒的组装和排出，对其进行准确的检测可实现巨细胞病毒感染的早期检测和指导临床合理用药。其中，PP65蛋白是HCMV包壳蛋白和细胞外病毒颗粒的重要组成部分。目前，HCMV PP65抗原已作为HCMV活动性感染和新发感染的首选实验室诊断指标广泛应用于临床。临床上常用免疫荧光检测技术（Immunofluorescence assay，IFA）检测HCMV PP65抗原，该方法以血液白细胞为载体，对白细胞的数目和形态要求较高，仅适合血液样本，不适合骨髓干细胞移植、免疫抑制和免疫缺陷等粒细胞过少患者的血标本，以及脑脊液、尿液、羊水等其它体液样本，临床检测应用范围局限;其检测过程涉及白细胞的分离和多个抗体的孵育，操作繁琐，耗时长，成本高。适配子（Aptamer）是利用SELEX技术从人工合成的大容量单链寡核苷酸文库中，经体外筛选获得的单链寡核苷酸。寡核苷酸适配子不仅可卷曲折叠形成特定的二级或三级空间结构，能高特异识别、高亲和结合靶分子，而且ssDNA适配子具有靶分子范围广，易于体外合成与修饰，性质稳定、易于保存，人工合成的适配子纯度高，批间差异小，成本低等特点。因此，适配子是一种能取代抗体的理想候选生物识别分子，已广泛用于疾病诊断、新药筛选、药物靶向运输等诸多领域。磁珠是一种微米级的磁性颗粒，具有超顺磁性、良好的生物相容性、较高的分散性和稳定性等特点，其表面可修饰不同的活性功能基团制备成功能化磁珠。适配子功能化磁珠综合了适配子靶向识别和结合能力与磁珠独特的理化特性，可用于复杂样品中微量靶分子的识别与富集，还可作为可溶性微量物质检测的固相载体，应用于微量物质的分离、生物测试分析、样品前处理、药物的磁控靶向输送等方面。本研究针对HCMV PP65抗原临床检测面临的问题，将适配子与磁珠结合制备适配子功能化磁珠，建立一种适配子功能化磁珠夹心免疫荧光检测HCMV PP65抗原的新方法，实现尿液、血液等样本中游离HCMV PP65抗原的特异、灵敏、快速检测，拓宽HCMV PP65抗原检测的临床适用范围，对HCMV活动性感染的早期诊断具有重要临床应用价值。目的：以HCMV PP65抗原为靶分子，采用SELEX技术筛选其高亲和力、高特异性结合的寡核苷酸适配子，制备适配子功能化磁珠，构建一种适配子功能化磁珠夹心免疫荧光检测HCMV PP65抗原的新方法。方法： 1．适配子的筛选：构建由两端固定序列和中间35个核苷酸随机序列组成的链长为78个核苷酸，库容量约为1015-1016的随机ssDNA文库，以HCMV PP65蛋白为靶标，采用SELEX技术进行8轮筛选，前3轮筛选以空白孔作为反向筛选，后5轮以重组HCMVPP65抗原所带GST标签蛋白作为反向筛选，去除非特异结合的ssDNA序列，确保获得高特异性的饱和ssDNA文库。 2．适配子的结构分析与活性鉴定：将筛选获得的ssDNA文库进行克隆、测序。利用DNAMAN软件分析预测适配子序列的二级结构，并采用酶联免疫法检测适配子与HCMV PP65蛋白结合的亲和性。 3．适配子功能化磁珠的制备与条件优化：选取亲和力最高的适配子进行修饰标记，经EDC共价偶联于磁珠表面，制备适配子功能化磁珠。并探讨适配子与磁珠的偶联比例、最适EDC浓度和最佳偶联时间，优化适配子功能化磁珠制备条件。 4．适配子功能化磁珠夹心免疫荧光检测方法的构建与检测条件优化：利用适配子功能化磁珠特异捕获与富集液相中的HCMV PP65抗原，以FITC标记的HCMV PP65单克隆抗体进行示踪，荧光显微镜观察检测结果，初步构建“适配子功能化磁珠-抗原-荧光单抗”夹心免疫荧光检测新方法。同时，观察适配子与PP65抗原、PP65抗原与荧光标记单抗的不同孵育时间对检测结果的影响，并建立适宜的检测条件。 5．临床标本检测及与PCR的方法学比较：收集40例临床疑似HCMV活动性感染患儿尿液样本，尿液上清和尿液沉渣裂解液中游离的PP65抗

关键词：人巨细胞病毒 PP65 抗原 SELEX 适配子磁珠

自我管理微信小程序磁珠版对乳腺癌创伤后应激障碍的干预效果评估

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自我管理微信小程序磁珠版对乳腺癌创伤后应激障碍的干预效果评估

作者：张冬妮北京中医药大学

学位级别：硕士

目的:乳腺癌为世界范围内女性最高发的恶性肿瘤,其发病率在中国呈逐年升高的趋势。手术的创伤、治疗引起的各种身体不适副作用、对死亡的恐惧、肿瘤的复发转移等等,都易使患者对生活产生悲观情绪,引发精神疾病,也被称之为创伤后应激障碍... 详细信息

目的:乳腺癌为世界范围内女性最高发的恶性肿瘤,其发病率在中国呈逐年升高的趋势。手术的创伤、治疗引起的各种身体不适副作用、对死亡的恐惧、肿瘤的复发转移等等,都易使患者对生活产生悲观情绪,引发精神疾病,也被称之为创伤后应激障碍（post-traumatic stress disorder,PTSD）,影响患者的生存和生活质量。但是大多数患者的PTSD都未被及时治疗。目前西医针对PTSD的治疗主要是一些精神类药物。而我们传统的中医有很多疗法,如中药、针灸推拿、耳穴、五音疗法、食疗、八段锦、太极拳等。其中很多疗法具有疗效确切、操作简单、无痛无创、可以自行操作的特点,对于中国人来说更易接受。我们希望将中医的治疗方法综合归纳,制作一个能让乳腺癌患者自我调理PTSD的微信小程序,使足不出户自我治疗成为现实。本研究旨在:①探究自我管理微信小程序的疗效是否优于传统门诊综合治疗;②探究增加了磁珠耳穴治疗的磁珠版小程序疗效是否优于无磁珠耳穴治疗的旧版小程序。方法:本研究采用前瞻性随机对照临床试验,将176例符合纳入标准的乳腺癌PTSD患者按照随机原则以1:1:1:1的比例,分为小程序有磁珠组、小程序无磁珠组、门诊有磁珠组、门诊无磁珠组,每组44例,每组患者均接受西医规范治疗及中药辨证治疗。小程序有磁珠组按照微信小程序的指引,进行为期12周的症状中医综合自我管理,并按照小程序中的教程,自行磁珠耳穴治疗;小程序无磁珠组进行为期12周的症状中医综合自我管理,不进行磁珠耳穴治疗。使用小程序进行干预的患者微信群中,每2周会有专家团队进行线上沟通交流。门诊有磁珠组,进行为期12周的中医综合治疗（治疗内容与微信小程序相同,但是由门诊医生引导进行）,并由医生进行磁珠耳穴治疗;门诊无磁珠组于门诊医生引导下,进行为期12周的中医综合治疗,且不进行磁珠耳穴治疗。门诊组每2周前往门诊一次接受治疗。观察分析干预前后四组患者的PTSD自评量表（PCL-C）、焦虑自评量表（SAS）、抑郁自评量表（SDS）、抑郁量表（HAMD）、症状自评量表（SCL-90）、失眠严重指数（ISI）评分的变化。并进行卫生经济学评估。采用SPSS 23.0软件进行统计学分析,得出结论。本研究微信小程序设计部分借助现代信息化技术,基于微信平台,有专业软件技术人员设计。小程序包括五个模块:①PTSD相关知识介绍②PTSD相关自评量表③症状管理路线④PTSD相关知识链接⑤磁珠耳穴贴压教程。结果:1.基线比较:四组患者的一般资料和干预前PTSD自评量表（PCL-C）、焦虑自评量表（SAS）、抑郁自评量表（SDS）、抑郁量表（HAMD）、症状自评量表（SCL-90）、失眠严重指数（ISI）评分无显著性差异（P＞0.05）。2.同组干预前后疗效比较:干预后,四组患者的PTSD自评量表（PCL-C）、焦虑自评量表（SAS）、抑郁自评量表（SDS）、抑郁量表（HAMD）、症状自评量表（SCL-90）、失眠严重指数（ISI）评分均有改善。与干预前相比,差异具有统计学意义（P＜0.05）。3.组间干预前后疗效比较:①小程序有磁珠组各个量表干预前后的差值均数皆大于小程序无磁珠组,差异具有统计学意义（P＜0.05）。②小程序有磁珠组各个量表干预前后的差值均数皆大于门诊有磁珠组,其中PCL-C、SAS、SDS、HAMD、SCL-90的差异具有统计学意义（P＜0.05）;ISI的差异不具有统计学意义（P＞0.05）。③小程序无磁珠组各个量表干预前后的差值均数皆大于门诊无磁珠组,其中SDS、HAMD、SCL-90的差异具有统计学意义（P＜0.05）;PCL-C、SAS、ISI的差异不具有统计学意义（P＞0.05）。④门诊有磁珠组各个量表干预前后的差值均数皆大于门诊无磁珠组,其中SDS、HAMD、SCL-90、ISI的差异具有统计学意义（P＜0.05）;PCL-C、SAS的差异不具有统计学意义（P＞0.05）。4.四组患者在干预过程中均未出现不良反应。5.相较于门诊中医综合治疗干预,使用自我管理微信小程序干预节约了治疗的额外支出（包括挂号费、路费等）,并减免了患者前往医院就诊挂号、路途、候诊等精力体力的消耗。结论:1.在中医理论指导下,中医心理治疗、中医康复锻炼、传统音乐疗法、中医食疗、磁珠耳穴贴压治疗相结合的中医综合治疗可以明显改善乳腺癌患者PTSD和焦虑抑郁等不良情绪。并能明显改善乳腺癌PTSD患者的睡眠状况。2.乳腺癌PTSD患者使用自我管理微信小程序进行干预的效果优于在门诊医生引导下进行干预。应该在临床工作中推广使用。3.采用磁珠耳穴贴压对改善乳腺癌PTSD患者的不良情绪有协同增效的作用。4.使用自我管理微信小程干预的卫生经济学效益优于门诊中医综合治疗。

关键词：磁珠耳穴 PTSD 乳腺癌微信小程序中医综合治疗

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HCV磁珠快速检测试剂盒的研制

HCV磁珠快速检测试剂盒的研制

作者：孙少清苏州大学

学位级别：硕士

目的:本课题采用基因重组技术将Avi-tag标签设计进HCV-Ag(Hepatitis c virus-antigen,HCV-Ag),使得 HCV-Ag 能在体外被 BirA 酶催化成生物素化 HCV-Ag。以生物素化HCV-Ag为主要原料,建立基于磁珠、吖啶酯等的HCV快速检测试剂盒。新检测... 详细信息

目的:本课题采用基因重组技术将Avi-tag标签设计进HCV-Ag(Hepatitis c virus-antigen,HCV-Ag),使得 HCV-Ag 能在体外被 BirA 酶催化成生物素化 HCV-Ag。以生物素化HCV-Ag为主要原料,建立基于磁珠、吖啶酯等的HCV快速检测试剂盒。新检测试剂盒在性能上须完全符合国家标准,检测时间能缩短至15 min以内,以期拓展现有免疫检测的适用范围。方法:第一部分:从蛋白质数据库中检索选取在中国广泛流行的丙型肝炎病毒亚型的蛋白质序列,并在其中加入15个氨基酸的Avi-tag标签序列,使得重组抗原具备在体外被生物素化的特点。将蛋白质序列转化为DNA序列,并制备含目的DNA序列的pET28a+质粒。将含目的基因序列的质粒转入大肠杆菌,采用含卡那霉素的培养平皿筛选阳性菌株,通过SDS-PAGE电泳以及Western方法对融合蛋白菌株的表达蛋白进行分析和鉴定,以获得表达HCV-Ag的工程菌。对HCV-Ag工程菌扩大培养的表达纯化过程进行优化,包括异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的浓度/时间,Ni柱纯化的咪唑洗脱浓度等已获得高产量、高活性的目的蛋白。在体外借助BirA酶将目的蛋白生物素化,得到生物素化HCV-Ag。最后将BirA酶法获得的生物素化HCV-Ag与化学法生物素化HCV-Ag进行的比对,评估该方法获得生物素化HCV-Ag的优劣。第二部分:将生物素化的HCV-Ag包被于磁珠表面,用以检测人血清中的HCV抗体,加入吖啶酯标记的兔抗人抗体作为二抗,经过反应洗涤后加入碱性的预激发液和激发液促进吖啶酯发出光粒子,通过特定设备接收光粒子的强度,根据检测值计算出血清中HCV抗体的浓度,以此建立HCV抗体检测试剂盒。首先通过信噪比法筛选出最佳的磁珠快速检测法的反应时间,然后采用HCV检测试剂盒的行业方法分别对试剂盒的灵敏度、重现性、稳定性等进行评估。为进一步确认试剂盒的准确性与灵敏度,分别采用国家血清盘以及162份临床血清样本对研发的试剂盒进行符合性及相关性比对。结果:成功获得HCV-Ag工程菌,得出工程菌扩大培养的最佳IPTG诱导参数为1 mM/L浓度/4 h培养,得出Ni柱纯化的最佳的咪唑洗脱浓度为200 mM/L。在体外借助BirA酶成功将HCV-Ag生物素化,酶法获得的生物素化HCV-Ag能显著降低磁珠快速检测法的本底值。成功构建含生物素化HCV-Ag、磁珠、吖啶酯等的HCV快速检测试剂盒,实现HCV抗体检测时间缩短至15 min以内。HCV快速检测试剂盒在灵敏度、准确性等方面符合国家血清盘的检测标准,并在与时间分辨免疫法的162份血样对比测试中一致性Kappa值为0.949显示非常高的一致性。结论:自制生物素化HCV-Ag达到抗原设计的具体要求,以HCV-Ag为主要原料制备的磁珠快速检测试剂盒完全符合国家质量标准,可以用于临床HCV抗体的快速鉴别。

关键词：丙型肝炎病毒 HCV 磁珠吖啶酯 Avi-tag