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磁性dna共固定化多酶体系中酶间距对级联活性的影响

磁性DNA共固定化多酶体系中酶间距对级联活性的影响

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作者：褚冠博河北大学

学位级别：硕士

多酶级联反应在催化过程中发挥着重要的作用,广泛应用于生物化工、药品生产以及医疗诊断等诸多领域。为获得较高的级联酶活,本论文围绕双酶间距这一关键影响因素,以葡萄糖氧化酶(GOD)和辣根过氧化物酶(HRP)为模型酶,制备磁性dna支架共... 详细信息

多酶级联反应在催化过程中发挥着重要的作用,广泛应用于生物化工、药品生产以及医疗诊断等诸多领域。为获得较高的级联酶活,本论文围绕双酶间距这一关键影响因素,以葡萄糖氧化酶(GOD)和辣根过氧化物酶(HRP)为模型酶,制备磁性dna支架共固定多酶体系。首先通过在磁性微球表面接枝dna单链固定GOD。随后将碱基互补的HRP-dna复合物与磁球表面的dna单链杂交,组装形成“Y”型dna支架,实现GOD和HRP的定向共固定。“Y”型dna支架使得双酶具有较好的邻近性和共域化,能够产生底物通道效应,提高级联酶活,并且dna支架具有可编辑性,通过改变dna链长可达到调控酶间距的目的。与文献报道的dna组装体(折纸术)共固定化多酶体系相比,本文所设计的“Y”型dna支架具有结构简单,易于制备,成本低廉等优点。本论文主要开展了以下工作:第一,“Y”型dna支架共固定化GOD和HRP。设计两条部分互补的dna链,将GOD与dna链A共价连接,形成GOD-A复合物。HRP与互补dna链B通过酰胺键连接,形成HRP-B复合物。将GOD-A与HRP-B两个酶-dna复合物进行碱基互补配对组装,形成“Y”型dna支架多酶复合体。凝胶电泳实验证明“Y”型dna支架、酶-dna复合物及多酶复合体制备成功;“Y”型dna支架多酶复合体的级联活性为448 U/mg,4℃冰箱储存6天酶活基本无变化,其稳定性优于游离GOD和HRP。第二,基于“Y”型dna支架介导的磁性共固定化GOD和HRP。以环氧基修饰的聚乙酸乙烯酯(PVAC)磁性微球为载体,将上述“Y”型dna支架多酶复合体共价结合于载体表面,构建磁性定向共固定多酶体系。荧光表征结果显示GOD和HRP在微球表面共固定成功;磁性dna支架共固定多酶体系的米氏常数为9.04 mg/m L,酶活为967 U/mg,是游离GOD和HRP级联酶活的3.5倍。磁性dna支架共固定多酶体系中酶分子的空间构象稳定,酶学性能优异。其催化反应最适p H值为4.0,低于游离GOD和HRP级联反应的最适p H值7.0;最适反应温度为45℃,高于游离双酶的最适温度35℃;高温处理7 h酶活基本无变化。与游离GOD和HRP相比,磁性dna支架共固定多酶体系具有更好的适用性和热稳定性。第三,探究酶间距对级联酶活的影响。设计不同长度的“Y”型dna支架,调控GOD与HRP之间的距离,构建不同酶间距的磁性dna支架共固定多酶体系。利用激光共聚焦显微镜观察荧光共振能量转移(FRET)现象,测定荧光共振能量转移效率,根据转移效率计算实际酶间距,实验结果证明不同酶间距的多酶体系被成功构建;测定不同酶间距的磁性dna支架共固定多酶体系级联酶活,结果显示,酶间距为10.0 nm时GOD与HRP的级联酶活为967 U/mg;而酶间距为7.5 nm和16.0 nm的级联酶活均低于酶间距为10.0 nm的级联酶活,表明酶间距是影响级联催化反应活性的关键因素。

关键词：酶间距级联酶活磁性dna共固定化多酶体系底物通道效应荧光共振能量转移

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