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碳酸酐酶1对骨形成作用的研究

中国生物工程杂志 2012年第4期32卷 22-27页

作者：郑亚冰王林常建芳王月俭韩金祥常晓天山东省医学科学院山东省医药生物技术研究中心济南250062 济南军区总医院生殖医学中心济南250031

目的:为了研究碳酸酐酶1(carbonic anhydrase I,CA1)在生物矿化和骨形成过程中的作用。方法:选择HeLa细胞为研究对象,用地塞米松(dexamethasone,DEX)、β-磷酸甘油(β-glycerophosphate,β-GP)和维他命C(ascorbic acid,AA)诱导其钙化,茜素红染色法观察矿化结节的形成,荧光定量PCR检测细胞骨化标志蛋白Runx2/cbfa1的表达。CA1表达水平的变化采用Western blot和荧光定量PCR的方法检测。同时用碳酸酐酶抑制剂乙酰唑胺处理HeLa细胞,观察CA1表达被抑制后对HeLa细胞钙化的影响。结果:HeLa细胞在诱导后形成大量矿化结节,Runx2/cbfa1转录水平明显升高,显示DEX、β-GP和AA可诱导HeLa细胞钙化和骨化,HeLa细胞钙化后CA1表达明显增高。HeLa细胞经乙酰唑胺处理后,CA1的表达量减少,矿化结节形成明显减少,说明抑制CA1表达可以抑制HeLa细胞矿化和骨化过程。结论:CA1在生物矿化和新骨形成过程中起着重要作用。

关键词：生物矿化碳酸酐酶1 成骨诱导

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碳酸酐酶1在关节炎异常钙化机制中的研究

碳酸酐酶1在关节炎异常钙化机制中的研究

作者：郑亚冰济南大学

学位级别：硕士

强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一种慢性进行性自身免疫性疾病。主要侵犯骶髂关节、脊椎关节与附近的肌腱、韧带等软组织。炎症后继发纤维化与钙化。其病变特点表现为起止点（起止点是指肌腱，韧带和关节囊三者连接到骨... 详细信息

强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一种慢性进行性自身免疫性疾病。主要侵犯骶髂关节、脊椎关节与附近的肌腱、韧带等软组织。炎症后继发纤维化与钙化。其病变特点表现为起止点（起止点是指肌腱，韧带和关节囊三者连接到骨的地方）和滑膜关节、软骨结合处形成新骨，使脊椎逐渐失去柔软度，严重时会发展到像“竹节”一样无法弯曲或伸展。人们在研究AS病理机制时早已发现，滑膜的病理变化与该病的严重程度密切相关。具体表现为AS髋关节滑膜的慢性滑膜炎、闭塞性血管炎、软骨硬化与骨形成和骨吸收密切相关，髋关节滑膜的增生及其巨噬细胞（尤其是CD163+亚群和多形核白细胞）炎症性渗入与AS的全身性疾病活动也明显相关。为了深入探究病变滑膜在该病中作用机制，本课题组前期利用蛋白质组学方法，以类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA），骨性关节炎（osteoarthritis，OA）为对照，发现碳酸酐酶1（carbonic anhydrase I, CA1）在AS滑膜中特异性高表达。免疫组织化学法和蛋白免疫印迹均证实CA1在AS滑膜中明显表达，AS滑液中同样检测到高表达的CA1。碳酸酐酶1（carbonic anhydrase I,CA1）可以将二氧化碳水化而产生碳酸氢根，进而与钙离子结合形成碳酸钙，而钙盐结晶是骨化过程的重要步骤。因此，该基因的异常表达可能与AS病变关节异常钙化和新骨形成有关。但是，到目前为止还没有生物学证据直接证明CA1参与细胞和体内的生物矿化过程。目的：以骨肉瘤细胞Saos-2为模型，用成骨诱导培养基（osteogenic medium，OM）诱导细胞钙化，通过诱导细胞钙化，观察CA1与细胞钙化之间的关系。本实验同时构建了CA1转基因高表达小鼠，通过胶原诱导关节炎的方法，观察CA1在体内高表达后对异常钙化和关节炎发生的影响。方法：采用成骨诱导培养基诱导人成骨肉瘤细胞Saos-2钙化，然后用茜素红染色法观察细胞矿化结节的形成，用荧光定量PCR检测核心结合蛋白因子2（runt-related transcription factor-2, Runx2）、成骨细胞特异性转录因子（osterix,OSX）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）、骨钙素（osteocalcin,OCN）和骨唾液酸蛋白（bone sialoprotein, BSP）等细胞骨化标志蛋白的表达。采用Western blot和荧光定量PCR检测细胞钙化前后CA1的表达量的变化。同时用碳酸酐酶抑制剂乙酰唑胺处理Saos-2细胞，观察细胞钙化过程是否被抑制。构建转基因CA1高表达小鼠，采用牛II型胶原（bovine type II collagen，CII）进行皮下注射，构建CIA模型，观察CA1转基因组（CA1-Transgenic mouse，CA1-Tg）和对照组（PADI4-Tg和野生型小鼠）小鼠关节炎的发生率，关节肿胀程度，足垫厚度的变化等。并采用X光片观察骨形成和破坏程度，HE染色法检测关节的病理改变，ELISA检测小鼠血清中炎性因子白细胞介素-1α（interleukin-1α，IL-1α）、IL-1β、IL-17和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的含量。结果：Saos-2细胞在OM诱导后形成大量矿化结节，Runx2、ALP、OCN、OSX和BSP转录水平明显升高，显示OM可诱导Saos-2细胞钙化和骨化。Saos-2细胞钙化后CA1表达明显增高。Saos-2细胞经乙酰唑胺处理后，CA1的表达量减少，矿化结节形成明显减少，骨化标志蛋白的表达也明显下降，说明抑制CA1表达可以抑制Saos-2细胞矿化和骨化过程。胶原诱导CA1-Tg和对照组小鼠后发现，CA1-Tg小鼠关节炎的发病率为60%（6/10），对照组PADI4-Tg和野生型小鼠关节炎的发病率为20%（2/10），BSA对照组（0/10）没有出现任何关节炎症状。CA1-Tg小鼠关节炎炎性指数为5.5±0.84，对照组PADI4-Tg和野生型小鼠关节炎炎性指数均小于2。CA1-Tg小鼠的足垫厚度为3.46±0.107mm，明显高于PADI4-Tg小鼠（2.225±0.08mm）、野生型小鼠（2.075±0.06mm）和BSA处理CA1-Tg小鼠。同时，X射线检测发现CA1-Tg小鼠出现明显的关节红肿和僵直，且存在异常钙化和关节融合现象，组织病理学检测发现在其踝关节，膝关节，骶髂关节和抓关节处出现明显的炎症，滑膜组织增生，并伴有严重的骨侵蚀，CA1-Tg小鼠的血清中炎性因子IL-1α、IL-1β、IL-17和TNF-α的表达量明显高于对照组。结论：用成骨诱导培

关键词：碳酸酐酶1 强直性脊柱炎转基因小鼠生物矿化关节炎

碳酸酐酶1在非小细胞肺癌早期发病中作用机制的研究

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碳酸酐酶1在非小细胞肺癌早期发病中作用机制的研究

作者：李璇天津医科大学

学位级别：硕士

目的:肺癌是呼吸系统中最常见的恶性肿瘤,主要分为小细胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）和非小细胞肺癌（non–small cell lung cancer,NSCLC）两大类。临床上非小细胞肺癌最为多见,约占肺癌发病率的80%～85%,以腺癌和鳞癌这两种... 详细信息

目的:肺癌是呼吸系统中最常见的恶性肿瘤,主要分为小细胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）和非小细胞肺癌（non–small cell lung cancer,NSCLC）两大类。临床上非小细胞肺癌最为多见,约占肺癌发病率的80%～85%,以腺癌和鳞癌这两种病理学亚型为主。近些年肺癌的早期诊断较以往虽有长足的进步,但患者的预后仍不佳。据相关研究统计,只有约15%的肺癌在早期确诊,5年生存率为54%。而超过半数（57%）是在中晚期确诊的,其中1年和5年生存率仅分别为26%和4%。虽然NSCLC的靶向治疗和免疫治疗目前发展迅速,但晚期NSCLC患者的预后仍然较差,存在肿瘤转移、复发和耐药等问题。因此,提高患者的早期诊断率已迫在眉睫,寻找一种可靠的早期肺癌诊断标记物对改善患者的预后至关重要。本课题组前期通过蛋白质组学技术发现碳酸酐酶1（Carbonic anhydrase 1,CA1）是肺癌的差异表达蛋白,CA1表达水平在肺癌患者血清中较健康人群及良性肺部疾病患者升高。因此,本研究为进一步探究CA1在肺癌中的作用机制,检测了CA1在早期NSCLC患者血清中的表达水平,在此基础上,进一步采用细胞模型验证CA1对于肺癌细胞增殖的影响,探讨其作为肿瘤标记物的价值,为患者的临床诊疗提供借鉴。方法:通过收集Ⅰ期初治NSCLC患者临床信息及术前血清样本,共76例,作为实验组;健康体检人群血清样本70例,作为对照组。使用ELISA方法测定肺癌患者及健康人群的血清中CA1的表达量,应用RNA干扰及质粒转染的方法分别对A549、H520、H1299细胞进行处理,构建敲低和过表达CA1的细胞模型,并应用CCK-8法检测不同处理组中细胞的增殖情况;应用实时定量多聚酶链式反应（real time polymerase chain reaction,RT-PCR）和Western Blot的方法检测Wnt/β-catenin信号通路中关键信号分子Wnt3a和β-catenin m RNA和蛋白质的表达水平。。结果:CA1在早期NSCLC患者的血清中表达水平显著高于健康人群。通过sh-RNA抑制CA1表达后,A549、H520和H1299细胞系的增殖速率显著降低,而过表达CA1后,细胞增殖速率明显提高。同时CA1也能够有效调节WNT/β-catenin信号通路中Wnt3a及β-catenin的表达水平。结论:CA1通过Wnt/β-catenin信号通路影响NSCLC的增殖过程;CA1也有望成为NSCLC早期诊断的新型生物分子标记物,为临床诊疗工作提供相应的血清学依据。

关键词：非小细胞肺癌碳酸酐酶1 细胞增殖 Wnt/β-catenin信号通路分子标记物

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高表达碳酸酐酶1参与骨化过程的研究

中华风湿病学杂志 2012年第12期16卷 804-808,I0002页

作者：郑亚冰王林赵丹王月俭安琨韩金祥常晓天山东省千佛山医院医学研究中心中心实验室济南250014 山东省千佛山医院骨科济南250014 山东省医药生物技术研究中心山东省医学科学院研教中心

目的碳酸酐酶1不仅可以催化二氧化碳水化反应，还可以加速碳酸钙的形成，而钙沉淀是新骨形成的重要步骤。本研究以培养细胞为模型探索碳酸酐酶1在骨形成过程中的作用。方法用成骨诱导培养基（OM）诱导骨肉瘤细胞Saos-2钙化，然后用茜素... 详细信息

目的碳酸酐酶1不仅可以催化二氧化碳水化反应，还可以加速碳酸钙的形成，而钙沉淀是新骨形成的重要步骤。本研究以培养细胞为模型探索碳酸酐酶1在骨形成过程中的作用。方法用成骨诱导培养基（OM）诱导骨肉瘤细胞Saos-2钙化，然后用茜素红染色法观察细胞矿化结节的形成，用荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测细胞骨化标志蛋白核心结合蛋白因子2（Runx2）、成骨细胞特异性转录因子（OSX）、碱性磷酸酶（AIJP）、骨钙素和骨涎蛋白（BSP）的表达。用蛋白印迹法和荧光定量PCR检测细胞钙化前后碳酸酐酶1的表达量的变化。用碳酸酐酶抑制剂乙酰唑胺处理Saos-2细胞，观察细胞钙化过程是否被抑制。2组间比较采用t检验，不同时间点的统计学分析采用重复测量的方差分析。结果Saos-2细胞在OM诱导后形成大量矿化结节（0．68±0．03与2．76±0．13，P〈0．01），Runx2、ALP、骨钙素、OSX和BSP转录水平明显升高，显示OM可诱导Saos-2细胞钙化和骨化。Saos-2细胞钙化后碳酸酐酶1表达明显增高（0．25±0．03与0．94±0．06，P〈0．01）。Saos-2细胞经乙酰唑胺处理后，碳酸酐酶1的表达量减少（1．09±0．05与0．55±0．07，P〈0．05），矿化结节形成明显减少（2．76±0．13与2．19±0．07，P〈0．01），骨化标志蛋白的表达也明显下降，说明抑制碳酸酐酶1表达可以抑制Saos-2细胞矿化和骨化过程。结论碳酸酐酶1在新骨形成过程中起着重要作用。

关键词：碳酸酐酶1 骨生成成骨诱导生物矿化

强直性脊柱炎关节滑膜高表达碳酸酐酶_1的研究

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中国矫形外科杂志 2011年第8期19卷 667-670页

作者：张虎贾堂宏李晓光闫新峰赵燕常晓天山东大学济南250014 山东大学附属千佛山医院济南250062 山东大学附属中心医院济南250000 山东省医药技术研究中心

[目的]过度的新骨形成和骨吸收是强直性脊柱炎(AS)的重要病理特征。研究表明,AS病人滑膜的病理变化与该病的病变严重程度密切相关。本研究用蛋白质组学方法比较AS、类风湿性关节炎(RA)、骨关节炎(OA)滑膜组织的蛋白表达谱,筛选AS疾病相... 详细信息

[目的]过度的新骨形成和骨吸收是强直性脊柱炎(AS)的重要病理特征。研究表明,AS病人滑膜的病理变化与该病的病变严重程度密切相关。本研究用蛋白质组学方法比较AS、类风湿性关节炎(RA)、骨关节炎(OA)滑膜组织的蛋白表达谱,筛选AS疾病相关的特异性表达蛋白。[方法]AS滑膜取自髋关节,RA和OA滑膜取自膝关节。提取每个滑膜(每种疾病n=10)的总蛋白,然后按等比例浓度混合分别制备每种疾病的样本池。用双向凝胶电泳分析AS、RA、OA滑膜的蛋白表达谱,用质谱分析方法鉴定AS中特异高表达的蛋白。用免疫组织化学法和蛋白免疫印迹法逐一分析靶蛋白在每个滑膜中的表。[结果]与RA和OA相比,蛋白质组学发现碳酸酐酶1(car-bonic anhydrase I,CA1)在AS滑膜中特异性高表达。免疫组织化学法和蛋白免疫印迹均证实CA1在AS滑膜中明显表达(P=0.01)。[结论]研究证实,CA1可以促进钙沉淀和骨吸收。AS关节滑膜组织中高表达CA1可能会通过刺激新骨形成和骨吸收而参与AS病理过程。

关键词：强直性脊柱炎碳酸酐酶1 钙化骨吸收

碳酸酐酶1沉默对肺癌A549细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响

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中国临床药理学与治疗学 2020年第1期25卷 55-60页

作者：张康何斌军胡汶斌韩晓亮绍兴文理学院附属医院心胸外科浙江绍兴312000 绍兴市人民医院心胸外科浙江绍兴312000

目的:探讨沉默碳酸酐酶1(CA1)对人肺癌A549细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响。方法:采用脂质体转染法将CA1特异性siRNA(si-CA1组)及阴性对照(si-NC组)转染肺癌A549细胞,同时以转染空脂质体的A549细胞为空白对照组(Blank组)。采用实时... 详细信息

目的:探讨沉默碳酸酐酶1(CA1)对人肺癌A549细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响。方法:采用脂质体转染法将CA1特异性siRNA(si-CA1组)及阴性对照(si-NC组)转染肺癌A549细胞,同时以转染空脂质体的A549细胞为空白对照组(Blank组)。采用实时荧光定量PCR(qPCR)和蛋白印迹法(Western blot)检测CA1 mRNA和蛋白表达水平,细胞计数试剂盒法(CCK-8)、流式细胞术、Transwell实验分别检测A549细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移能力。结果:qPCR和Western blot检测结果显示,转入CA1 siRNA的A549细胞中CA1 mRNA和蛋白的表达水平均明显下调(P1后si-CA1组A549细胞在24、48和72 h时光密度(OD)值明显低于si-NC组(P1组A549细胞凋亡率明显高于si-NC组(P1组侵袭和迁移细胞数均明显少于si-NC组(P0.05)。结论:沉默CA1能够抑制肺癌A549细胞增殖、侵袭和迁移,并促进细胞凋亡。

关键词：碳酸酐酶1 人肺癌A549细胞增殖凋亡侵袭迁移

CA1在牙囊干细胞体外成骨诱导过程中的作用机制研究

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CA1在牙囊干细胞体外成骨诱导过程中的作用机制研究

作者：葛盈盈青岛大学

学位级别：硕士

研究目的唇裂伴或不伴腭裂(Cleft lip with or without cleft palate,CL/P)是最常见的先天性畸形之一,对语言、听力、外貌和心理的负面影响会导致患者与社会融合的长期不良后果。CL/P患者需要长期的序列治疗,其中牙槽嵴裂的植骨修复是... 详细信息

研究目的唇裂伴或不伴腭裂(Cleft lip with or without cleft palate,CL/P)是最常见的先天性畸形之一,对语言、听力、外貌和心理的负面影响会导致患者与社会融合的长期不良后果。CL/P患者需要长期的序列治疗,其中牙槽嵴裂的植骨修复是唇腭裂序列治疗中的重点和难点之一。本研究拟采用慢病毒转染、RNA干扰等科学方法调节牙囊干细胞(Dental follicle stem cells,DFSCs)体外成骨过程中碳酸酐酶1(Carbonic anhydrase1,CA1)的表达水平,以探究CA1在DFSCs体外成骨诱导过程中发挥的作用及其机制,为临床应用骨组织工程进行牙槽嵴裂植骨提供新的思路与实验基础。研究方法1.使用酶消化法从人牙囊组织中分离出DFSCs并通过流式细胞术证明其表达间充质来源细胞的表面标志物。通过茜素红染色和油红O染色鉴定其骨向和脂向细胞的分化潜能。2.使用si-CA1对体外成骨诱导过程中的DFSCs进行RNA干扰,分别检测siCA1组,阴性对照组,空白对照组中成骨标志基因的表达。采用蛋白印迹法(Western blot,WB)和实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q RTPCR)检测转染后CA1、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、骨形态发生蛋白2(Bone morphogenetic protein 2,BMP2)、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2)在m RNA和蛋白质水平上的表达变化。3.构建过表达CA1基因的慢病毒载体LV-CA1,对体外成骨诱导过程中的DFSCs进行转染,分别检测LV-CA1组,阴性对照组,空白对照组中成骨标志基因的表达。采用q RT-PCR和WB检测转染后CA1、ALP、RUNX2、BMP2在m RNA和蛋白质水平上的表达变化。茜素红染色对其进行成骨效果进行评估。实验结果1.使用酶消化法从人牙囊组织中成功获得DFSCs,细胞呈现出显著骨向和脂向细胞的分化潜能。流式细胞术分析示细胞高表达CD29、CD73和CD90,不表达CD45,符合间充质来源细胞的表型特征。2.与阴性对照组和空白对照组相比,si-CA1组细胞中CA1的m RNA与蛋白质表达明显降低(P<0.05)。成骨标志基因ALP、RUNX2、BMP2的m RNA与蛋白质的表达随之不同程度地降低(P<0.05)。3.与阴性对照组和空白对照组相比,LV-CA1组细胞中CA1的m RNA与蛋白质表达显著升高(P<0.05)。成骨标志基因ALP、RUNX2、BMP2的m RNA与蛋白质的表达随之不同程度地升高(P<0.05)。其中除CA1外BMP2(43.01%)与ALP(36.69%)升高程度较为显著(P<0.05)。在28天的成骨诱导培养中,3组细胞中CA1的表达水平呈现出诱导初期3d稍高,7d转而降低再逐渐升高的趋势;其中21d时最高。茜素红染色结果提示LV-CA1组在同一时间点较阴性对照组与空白对照组产生更多钙化结节,矿化程度更高(P<0.05),成骨效果更好。结论本研究在体外成功原代培养了人DFSCs。在应用DFSCs进行的体外成骨诱导过程中,通过升高或降低CA1表达可以调控ALP、RUNX2、BMP2的表达,并且前者与对照组相比能获得更好的成骨效果。在成骨诱导过程中CA1的表达水平在诱导3d以及21d升高,尤其是有钙化结节形成的的成骨后期。这些结果揭示了CA1可以通过BMP信号通路中的成骨标志基因(ALP、RUNX2、BMP2)影响成骨分化过程,同时也能促进DFSCs的体外成骨。本研究为进一步应用CA1与DFSCs结合骨组织工程技术以修复牙槽嵴裂提供了实验依据。

关键词：碳酸酐酶1 牙囊干细胞骨组织工程成骨牙槽嵴裂