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新型基因及药物微泡载体系统的制备研究

新型基因及药物微泡载体系统的制备研究

作者：王红红重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:利用生物素亲和素系统,将阳离子纳米脂质体连接在脂质微泡表面,制备一种新型基因微泡载体。方法:1、将一定摩尔比的二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）与生物素化聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（Bio-PEG-DSPE）置于甘油及PBS混悬液中... 详细信息

目的:利用生物素亲和素系统,将阳离子纳米脂质体连接在脂质微泡表面,制备一种新型基因微泡载体。方法:1、将一定摩尔比的二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）与生物素化聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（Bio-PEG-DSPE）置于甘油及PBS混悬液中,并加入微量异硫氰酸荧光素（FITC）,充分混匀后,采用机械振荡法,制备生物素化脂质微泡（Bio-LMB）。同时,用二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）取代Bio-PEG-DSPE,采用相同方法制备非生物素化脂质微泡（LMB）作为对照。 2、取一定摩尔比的氢化大豆卵磷脂（HSPC）、3β-[N-（N′,N′-二甲基胺乙基）胺基甲酰基]胆固醇（DC-Chol）、Bio-PEG-DSPE溶于适量氯仿,并加入微量罗丹明6G,充分溶解后,采用薄膜分散-膜挤压法,制备生物素化阳离子纳米脂质体（Bio-CNLP）。同时,取相同比例的HSPC与DC-Chol,采用相同方法制备非生物素化阳离子纳米脂质体（CNLP）作为对照。 3、将Bio-LMB与过量的亲和素4℃孵育30 min,静置后抽吸下层过量亲和素,同时加入过量Bio-CNLP,4℃继续孵育30 min。相同方法连接LMB与CNLP作为对照组。 4、取漂浮在上层的乳液,行激光共聚焦显微镜观察实验组与对照组的连接效果。结果:激光共聚焦显微镜下Bio-LMB + Bio-CNLP组可见绿色Bio-LMB壁因连接Bio-CNLP而不光滑,周围可见数量不等的红色小圆形点状Bio-CNLP呈花环状聚集,而LMB + CNLP组LMB壁光滑,周围未见CNLP聚集。结论:采用生物素亲和素连接系统,可将Bio-CNLP牢固连接于Bio-LMB表面,为探索新型基因微泡载体提供一种新思路,有望为肿瘤靶向基因治疗提供一种新方法。第二部分脂质微泡-PLGA纳米微球复合体制备的实验研究目的:采用碳二亚胺法,将PLGA纳米微球连接在脂质微泡表面,制备一种新型药物微泡载体。方法:1、将一定摩尔比的二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、氨基化聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（NH2-PEG-DSPE）置于甘油及PBS溶液的混悬液中,充分混匀后,采用机械振荡法制备表面带氨基脂质微泡（NH2-LMB）。 2、采用双乳化法制备普通乳酸/羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米微球（NP）。 3、取部分NP,采用碳二亚胺法活化其表面的羧基得到活化的PLGA纳米微球（NP-COOR）。 4、分别将过量NP与NP-COOR加入两管等量NH2-LMB中,4℃孵育,12、24、36、48 h后,取上层漂浮的乳液,在光镜下观察连接效果。结果:12、24 h后,在光镜下两管微泡周围都未见纳米微球聚集。36 h后,NP + NH2-LMB组脂质微泡周围未见纳米微球的聚集;NP-COOR + NH2-LMB组部分脂质微泡周围可见少量纳米微球聚集。48 h后,光镜下NP + NH2-LMB组脂质微泡表面光滑,周围未见纳米微球的聚集;NP-COOR + NH2-LMB组脂质微泡表面不光滑,周围布满数量不等的小圆形的纳米微球,呈花环状。结论:采用碳二亚胺法,可将PLGA纳米微球成功连接于脂质微泡表面,为探索一种新型药物微泡载体提供一种新思路,有望为肿瘤靶向药物治疗提供一种新途径。

关键词：脂质微泡阳离子纳米脂质体生物素亲和素系统 PLGA纳米微球碳二亚胺法

诺氟沙星与牛血清白蛋白及卵清蛋白结合物的合成

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上海水产大学学报 2002年第4期11卷 362-366页

作者：周大勇戚晓玉陈舜胜周培根上海水产大学食品学院上海200090

采用碳二亚胺法制备诺氟沙星与牛血清白蛋白(BSA)的结合物,作为诺氟沙星酶联免疫用的免疫原。经紫外光谱法测定,每分子牛血清白蛋白连接的诺氟沙星分子数为16.1个。分别用碳二亚胺法和混合酸酐法制备诺氟沙星与卵清蛋白(OA)的结合物,作... 详细信息

采用碳二亚胺法制备诺氟沙星与牛血清白蛋白(BSA)的结合物,作为诺氟沙星酶联免疫用的免疫原。经紫外光谱法测定,每分子牛血清白蛋白连接的诺氟沙星分子数为16.1个。分别用碳二亚胺法和混合酸酐法制备诺氟沙星与卵清蛋白(OA)的结合物,作为诺氟沙星酶联免疫测定用的包被抗原。经紫外光谱法测定,每分子卵清蛋白连接的诺氟沙星分子数分别为5.8和1.9个。

关键词：结合物诺氟沙星牛血清白蛋白卵清蛋白酶联免疫吸附测定药物残留碳二亚胺法

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己烯雌酚免疫分析技术研究进展

动物医学进展 2006年第4期27卷 51-54页

作者：邴爱英李坤林牛钟相山东农业大学动物科技学院山东泰安271018 山东省滨州畜牧兽医研究所山东滨州256618

己烯雌酚为人工合成的二苯乙烯类雌激素药物,曾经作为促生长剂广泛应用于畜牧业。但国内研究表明,己烯雌酚存在着潜在的致癌性。因此,近年来,其在饲料及动物性食品中的残留检测倍受关注,但己烯雌酚属于小分子化合物,不具备免疫原性。己... 详细信息

己烯雌酚为人工合成的二苯乙烯类雌激素药物,曾经作为促生长剂广泛应用于畜牧业。但国内研究表明,己烯雌酚存在着潜在的致癌性。因此,近年来,其在饲料及动物性食品中的残留检测倍受关注,但己烯雌酚属于小分子化合物,不具备免疫原性。己烯雌激酚人工抗原主要采用混合酸酐反应(氯甲酸异丁酯法)将半抗原己烯雌酚与载体蛋白牛血清蛋白连接制备人工免疫原,并采用碳二亚胺法将半抗原己烯雌酚与载体蛋白卵清蛋白连接制备人工包被原。文章对己烯雌酚的免疫分析技术进行了综述。

关键词：己烯雌酚人工抗原碳二亚胺法氯甲酸异丁酯法

肽的研究——Ⅱ.带保护基的胰岛素A鏈羧端九肽的合成

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化学学报 1963年第3期 190-204页

作者：汪猷黄敬坚張偉君屠傳忠王志勤徐元燿湯永湜陸蕴华金善煒龔嶽亭中国科学院有机化学研究所中国科学院生物化学研究所

本文报告带保护基的胰島素A鏈羧端九肽Ⅰ(N-苄氧羰基亮氨酰-酪氨酰-谷氨酰胺酰-亮氨酰-γ-甲酯-谷氨酰-天冬酰胺酰-酪氨酰-S-苄基半胱氨酰-天冬酰胺甲酯)的合成。Ⅰ是由N-苄氧羰基亮氨酰-酪氨酰-谷氨酰胺酰-亮氨酸(四肽Ⅱ)和由N-苄氧羰... 详细信息

本文报告带保护基的胰島素A鏈羧端九肽Ⅰ(N-苄氧羰基亮氨酰-酪氨酰-谷氨酰胺酰-亮氨酰-γ-甲酯-谷氨酰-天冬酰胺酰-酪氨酰-S-苄基半胱氨酰-天冬酰胺甲酯)的合成。Ⅰ是由N-苄氧羰基亮氨酰-酪氨酰-谷氨酰胺酰-亮氨酸(四肽Ⅱ)和由N-苄氧羰基-γ-甲酯谷氨酰-天冬酰胺酰-酪氨酰-S-苄基牛胱氨酰-天冬酰胺甲酯(五肽Ⅲ)脫N-保护基所得氨端自由的五肽(Ⅲa)經二环己基碳二亚胺法縮合而成。四肽Ⅱ和五肽Ⅲ分別由二种不同方法合成。多肽Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ皆經元素分析、紙层析、紙电泳、酶水解分析証明系純粹,均一的L-型。在合50％的二甲基亚碸的三(羥甲基)甲胺緩冲液中亮氨酸氨肽酶仍能将脫N-保护基的四肽与九肽完全水解为相应的氨基酸。

关键词：明天冬乙酸溶液天冬草保护基毫克分子二甲基甲酸胺甲酞胺混合酸配法酶水解物天冬酸碳二亚胺法胰岛素多肽

洛克沙胂完全抗原的制备及其单克隆抗体的研制

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中国动物检疫 2019年第2期36卷 97-102页

作者：刘红亮王奇奇张改平祁艳华周景明刘燕凯马丽萍王爱萍郑州大学生命科学学院河南郑州450000

本研究以洛克沙胂(ROX)的结构类似物3-氨基-4-羟基苯胂酸(HAPA)为小分子半抗原,采用碳二亚胺法,分别将其与载体蛋白——牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清白蛋白(OVA)偶联,制备免疫抗原HAPA-BSA和检测抗原HAPA-OVA。经紫外光谱扫描及聚丙烯酰... 详细信息

本研究以洛克沙胂(ROX)的结构类似物3-氨基-4-羟基苯胂酸(HAPA)为小分子半抗原,采用碳二亚胺法,分别将其与载体蛋白——牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清白蛋白(OVA)偶联,制备免疫抗原HAPA-BSA和检测抗原HAPA-OVA。经紫外光谱扫描及聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定后,以20μg/只剂量的HAPA-BSA免疫BALB/c小鼠;选择血清效价高、敏感性强的小鼠,取脾脏进行细胞融合,制备杂交瘤细胞株。利用间接ELISA法筛选得到1株可以稳定分泌抗ROX单克隆抗体的细胞株,命名为G12;间接ELISA法测定其细胞上清效价为1:512,间接竞争ELISA测定其半数抑制浓度IC_(50)为3.147 ng/μL。经小鼠体内诱生腹水,辛酸-硫酸铵法纯化获得纯度较高的单克隆抗体,间接ELISA测定其效价为1:102 400,IC_(50)为1.433 ng/μL,且具有良好的特异性。本试验成功合成了ROX人工抗原,并制备了可以分泌高敏感性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,为ROX免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。

关键词：洛克沙胂 3-氨基-4羟基苯胂酸完全抗原碳二亚胺法单克隆抗体

从胰岛素A及B链重合成胰岛素以及A及B链肽段的合成

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科学通报 1964年第11期 943-962页

作者：钮经义邹承鲁汪猷邢其毅

胰岛素是一种蛋白质激素,其基本单位是由一条带有一个含-S-S-键小环的肽链 A经二个-S-S-键和另一条肽链 B 连接而成,并具有一定构象。早在这两条肽链的氨基酸排列次序以及三个-S-S-键的位置尚未弄清楚以前,许多科学工作者曾企图用氧化... 详细信息

胰岛素是一种蛋白质激素,其基本单位是由一条带有一个含-S-S-键小环的肽链 A经二个-S-S-键和另一条肽链 B 连接而成,并具有一定构象。早在这两条肽链的氨基酸排列次序以及三个-S-S-键的位置尚未弄清楚以前,许多科学工作者曾企图用氧化方法使因还原而完全失活的胰岛素重行恢复活力,但都未成功。自从胰岛素的壹级结构阐明后,并没有人很快地去尝试胰岛素的合成,而是在含有两个半胱氨酸基的肽氧化成环规律以及新的 S-保护基的探索方面做了

关键词： Cys Gly OH NH Asp 碳二亚胺法胰岛素多肽人工合成

Ⅳ.胰岛素B链的合成及其与天然A链组合成结晶胰岛素

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化学通报 1966年第5期 20-25页

自从天然胰岛素的A及B链重合成结晶胰岛素成功以后,接着又证明天然胰岛素先经钠-液氨处理,再经过S-磺酸化、还原及重氧化等步骤也有约5％的胰岛素活力恢复。因此,人工合成胰岛素的工作就有可

关键词：胰岛素所得衍生物钮经义多肽生物化学与生物物理学报碳二亚胺法天然

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丹酚酸B人工抗原的合成与免疫原性研究

北京中医药 2014年第6期33卷 470-473页

作者：吴婷婷屈会化赵琰孔慧王雪茜王庆国北京中医药大学基础医学院北京100029

目的制备丹酚酸B（SAB）的人工抗原（SAB-BSA）和包被原（SAB—PLL）并进行鉴定。方法采用碳二亚胺（EDC）法将SAB分别与牛血清白蛋白（BSA）和多聚赖氨酸（PLL）载体偶联合成SAB—BSA和SAB-PLL；采用紫外分光光度（UV）法和薄层色谱（... 详细信息

目的制备丹酚酸B（SAB）的人工抗原（SAB-BSA）和包被原（SAB—PLL）并进行鉴定。方法采用碳二亚胺（EDC）法将SAB分别与牛血清白蛋白（BSA）和多聚赖氨酸（PLL）载体偶联合成SAB—BSA和SAB-PLL；采用紫外分光光度（UV）法和薄层色谱（TLC）法对偶联效果进行鉴定，并通过SAB与BSA的吸光值计算出二者的偶联比；利用获得的SAB—BSA免疫小鼠，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测小鼠抗血清内多克隆抗体效价并以间接竞争酶联免疫吸附法（ic—ELISA）检测小鼠抗血清内多克隆抗体的灵敏度。结果所合成的SAB—BSA为BSA和SAB的结合物，且SAB-BSA中无游离SAB-SAB与BSA偶联成功，SAB-BSA偶联结合比为18：1；SAB-BSA刺激小鼠产生的针对SAB的多克隆抗体，效价为1：2×10^3，该多克隆抗体IC50为17．7μg／mL。结论SAB—BSA和SAB—PLL合成成功，可用于SAB单克隆抗体的制备以及SAB快速检测试剂盒的研制。

关键词：丹酚酸B 人工抗原偶联鉴定碳二亚胺法

脂质微泡与PLGA纳米粒复合体的制备原理分析

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中华临床医师杂志（电子版） 2013年第9期7卷 133-135页

作者：张亚萍冉海涛内江市第一人民医院特检科四川省641000 重庆医科大学附属第二医院超声影像学研究所

目的制备一种连接有PLGA纳米粒的新型脂质超声微泡并分析其制备原理。方法采用碳二亚胺法,并结合静电吸附,使表面带有氨基和正(或负)电荷的脂质微泡与表面带(或不带)有活化羧基的PLGA纳米粒进行缩合偶联反应,通过普通光学显微镜和荧光... 详细信息

目的制备一种连接有PLGA纳米粒的新型脂质超声微泡并分析其制备原理。方法采用碳二亚胺法,并结合静电吸附,使表面带有氨基和正(或负)电荷的脂质微泡与表面带(或不带)有活化羧基的PLGA纳米粒进行缩合偶联反应,通过普通光学显微镜和荧光显微镜观察两者结合情况。结果普通光镜与荧光显微镜下观察,表面带正电荷的脂质微泡与活化羧基的PLGA纳米粒可以成功偶联,PLGA纳米粒结合于脂质微泡表面;而表面带负电荷的脂质微泡与活化羧基的PLGA纳米粒以及表面带正电荷的脂质微泡与未活化羧基的高分子聚合物纳米粒均未见结合。结论化学共价偶联与静电吸附协同作用有利于促成脂质微泡与PLGA纳米粒的有效连接,而两者单用均不能产生连接。

关键词：纳米球膜脂质类碳二亚胺法偶联反应连接