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解淀粉芽孢杆菌YP6中碱性磷酸酯酶AP3的酶学性质及其溶磷作用

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微生物学通报 2018年第7期45卷 1408-1415页

作者：江威吴秋兰窦欣管政兵蔡宇杰廖祥儒江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

【背景】微生物溶磷机制多种多样,利用其解磷能力可有效促进植物生长。【目的】探究溶磷菌解淀粉芽孢杆菌YP6的溶磷机制,提高磷资源的利用率。【方法】在大肠杆菌BL21(DE3)中克隆并表达YP6中磷酸酯酶AP3基因,研究AP3的酶学性质并验证AP... 详细信息

【背景】微生物溶磷机制多种多样,利用其解磷能力可有效促进植物生长。【目的】探究溶磷菌解淀粉芽孢杆菌YP6的溶磷机制,提高磷资源的利用率。【方法】在大肠杆菌BL21(DE3)中克隆并表达YP6中磷酸酯酶AP3基因,研究AP3的酶学性质并验证AP3的溶磷作用。【结果】AP3为碱性磷酸酯酶,最适反应pH为10.3,最适反应温度为40°C,AP3对pNPP亲和性较高,V_m为4 033.4μmol/(min·mg),K_m为12.2 mmol/L。用纯酶AP3处理24 h后,磷矿粉中的有效磷显著增加。接种菌株YP6发酵7 d后,也使土样中有效磷明显增长。【结论】揭示了碱性磷酸酯酶AP3的溶磷能力,丰富了溶磷微生物库及对微生物溶磷机制的认识。

关键词：解淀粉芽孢杆菌解磷酶碱性磷酸酯酶

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小菜蛾碱性磷酸酯酶受体表达与分子模拟

中国农业科学 2016年第23期49卷 4555-4565页

作者：张霄胡晓丹仲建锋武爱华徐重新刘媛张存政谢雅晶刘贤金江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所/江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地/农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室

【目的】利用原核表达小菜蛾(Plutella xyllostella)中肠膜结合碱性磷酸酯酶(membrane-bound alkaline phosphatase,mALP)并经Ligand blot验证其具有与Cry1Ac毒素结合的能力;通过同源建模和分子对接研究Cry1Ac-mALP的结合模式,预测毒素和受体结合区域及关键氨基酸位点(热点残基),为了解毒素-受体互作机制及分子改造增强Cry毒素活性的研究打下基础。【方法】针对小菜蛾mALP全长设计引物,并以小菜蛾c DNA为模板扩增mALP基因,双酶切后用T4连接酶连接至pET-26b原核表达载体,将构建的pET-26b-mALP载体转化Trans1-T1克隆感受态,挑取克隆并提取质粒后进行PCR、双酶切和测序验证,将验证无误的重组质粒转化E.coliBL21(DE3)表达感受态细胞,进行诱导表达。将诱导表达后的mALP转至PVDF膜上,通过Western blot和Ligand blot分别验证mALP是否成功表达以及是否具有与Cry1Ac毒素结合的能力。对mALP进行同源建模、分子动力学模拟以及模型评价,获得的mALP最佳三维结构与Cry1Ac毒素利用Patch DOCK和Fire Dock程序进行分子对接试验,对确定的最佳毒素-受体复合物进行结合区域和结合氨基酸位点分析,并通过计算机辅助的丙氨酸突变扫描试验确定毒素和受体参与的关键氨基酸残基。【结果】扩增出小菜蛾mALP基因并克隆至pET-26b原核表达载体,转化E.coli BL21(DE3)表达感受态后挑取阳性克隆提取质粒后进行PCR、双酶切和测序均显示构建正确。通过原核表达和Western blot验证成功表达了mALP蛋白,并经Ligand blot试验证实了原核表达的mALP具有和Cry1Ac毒素结合的能力。利用同源建模成功获得了mALP的三维结构,通过Patch DOCK和Fire Dock分子对接程序,获得毒素和受体的对接复合物,通过溶剂可及表面积变化计算和Ligplot分析,确定毒素结构域Ⅱ和结构域Ⅲ均参与了受体结合,并且毒素和受体均以疏水结合和氢键结合模式参与结合,最后通过热点残基预测发现Cry1Ac毒素和mALP中分别有3个氨基酸残基(376ASN、443SER和486SER)和4个氨基酸残基(452ARG、499THR、502TYR和513TYR)是参与互作的关键氨基酸位点。【结论】经原核表达的小菜蛾mALP同样具有与Cry1Ac毒素结合的能力,并利用分子模拟技术预测了小菜蛾mALP三维结构及与Cry1Ac毒素结合模式。

关键词：碱性磷酸酯酶原核表达配体印迹同源建模分子对接热点残基预测

磷酸苯酯-碱性磷酸酯酶伏安酶联免疫分析新体系的研究

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分析试验室 2002年第1期21卷 13-15页

作者：孙伟焦奎刘光源青岛化工学院应用化学系青岛266042

研究了以磷酸苯酯为底物微分脉冲伏安法测定碱性磷酸酯酶 (ALP)的方法。磷酸苯酯在ALP的催化作用下水解生成苯酚 ,苯酚在玻碳电极上 0 .70V(vs.Ag/AgCl)左右产生氧化电流 ,氧化电流随着酶浓度的增大而增大 ,借助此氧化电流可以测定ALP ... 详细信息

研究了以磷酸苯酯为底物微分脉冲伏安法测定碱性磷酸酯酶 (ALP)的方法。磷酸苯酯在ALP的催化作用下水解生成苯酚 ,苯酚在玻碳电极上 0 .70V(vs.Ag/AgCl)左右产生氧化电流 ,氧化电流随着酶浓度的增大而增大 ,借助此氧化电流可以测定ALP ,并进而可用于以ALP为标记酶的酶免疫分析。对酶催化反应条件和酶催化反应产物的测定条件进行了详细的研究 ,测定游离ALP的线性范围是 0 .0 6U/L～ 1 .0× 1 0 3U/L ,检出限为 0 .0

关键词：磷酸苯酯碱性磷酸酯酶苯酚酶联免疫分析微分脉冲伏安法测定临床检验血液常规检查

以2-磷酸抗坏血酸酯为底物检测碱性磷酸酯酶的微分脉冲伏安法

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分析测试学报 2002年第5期21卷 13-15页

作者：孙伟焦奎刘光源王海玉青岛科技大学应用化学系山东青岛266042

提出以2_磷酸抗坏血酸酯为碱性磷酸酯酶(ALP)底物微分脉冲伏安法测定ALP的方法 ;2_磷酸抗坏血酸酯在ALP的催化作用下发生水解反应生成抗坏血酸 ,抗坏血酸在玻碳电极上 +0.40V(vsAg/AgCl)被氧化而产生一个灵敏的氧化峰 ,氧化峰电流随着... 详细信息

提出以2_磷酸抗坏血酸酯为碱性磷酸酯酶(ALP)底物微分脉冲伏安法测定ALP的方法 ;2_磷酸抗坏血酸酯在ALP的催化作用下发生水解反应生成抗坏血酸 ,抗坏血酸在玻碳电极上 +0.40V(vsAg/AgCl)被氧化而产生一个灵敏的氧化峰 ,氧化峰电流随着酶浓度的增大而增大 ,借助此氧化峰电流可以测定ALP ,进而可用于以ALP为标记酶的酶免疫分析 ;用微分脉冲伏安法对酶催化反应条件和酶催化反应产物的测定条件进行了详细的研究 ,建立了以2_磷酸抗坏血酸酯为底物的伏安酶联免疫分析新体系 ,测定游离ALP的线性范围是0.4～2.0×103 U/L,检测限为0.3U/L,对游离的IgG_ALP的测定最大稀释比为1∶200000。

关键词：底物碱性磷酸酯酶 2-磷酸抗坏血酸酯抗坏血酸微分脉冲伏安法酶联免疫分析法酶活性

5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐共振散射光谱法检测碱性磷酸酯酶

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广西师范大学学报（自然科学版） 2012年第2期30卷 99-105页

作者：梁爱惠刘高伞蒋治良广西师范大学环境与资源学院珍稀濒危动植物生态与环境保护省部共建教育部重点实验室广西桂林541004

在pH8.0的Tris-HCl缓冲溶液及32mg/L PEG20000的存在下,碱性磷酸酯酶(ALP)催化底物5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐(BCIP)水解生成不溶性的蓝色BCIP二聚体微粒,该微粒在710nm波长处产生一个共振散射峰。在选定条件下,随着ALP活性增大,710nm波... 详细信息

在pH8.0的Tris-HCl缓冲溶液及32mg/L PEG20000的存在下,碱性磷酸酯酶(ALP)催化底物5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐(BCIP)水解生成不溶性的蓝色BCIP二聚体微粒,该微粒在710nm波长处产生一个共振散射峰。在选定条件下,随着ALP活性增大,710nm波长处的共振散射峰强度线性增大,碱性磷酸酯酶浓度在0.078～1.25U/L与共振散射强度增大值ΔI呈良好线性关系,其回归方程为:ΔI=512.6C+17.8,检出限为9.6×10-3U/L。该法用于合成样品中碱性磷酸酯酶的测定,结果满意。

关键词： 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐碱性磷酸酯酶共振散射光谱法

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A蛋白碱性磷酸酯酶的标记及酶联测试

植物检疫 2000年第2期14卷 78-80页

作者：魏梅生李桂芬李明福陈燕芳农业部植物检疫实验所北京100029

以戊二醛为交联剂 ,采用两步法将A蛋白用碱性磷酸酯酶标记 ,获得的酶标记物可稀释 1/ 2 0 0 0。酶联对香石竹斑驳病毒、马铃薯X病毒、南方菜豆花叶病毒、烟草环斑病毒的提纯制剂及病汁液检测 ,分别达到 2 0ng和稀释 10 -2 ～ 10 -5 。... 详细信息

以戊二醛为交联剂 ,采用两步法将A蛋白用碱性磷酸酯酶标记 ,获得的酶标记物可稀释 1/ 2 0 0 0。酶联对香石竹斑驳病毒、马铃薯X病毒、南方菜豆花叶病毒、烟草环斑病毒的提纯制剂及病汁液检测 ,分别达到 2 0ng和稀释 10 -2 ～ 10 -5 。而阴性对照维持在较低的水平。

关键词： A蛋白碱性磷酸酯酶标记酶联检测植物病毒

低碱性磷酸酯酶症患儿乳牙牙周膜干细胞生物学行为的实验研究

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低碱性磷酸酯酶症患儿乳牙牙周膜干细胞生物学行为的实验研究

作者：冀堃第四军医大学

学位级别：硕士

低碱性磷酸酯酶症(Hypophospatasia,HPP)是一类涉及骨骼及牙齿发育缺陷的遗传性疾病,是由于肝/骨/肾碱性磷酸酯酶基因(ALPL)突变导致编码的非组织特异性碱性磷酸酶(TNAP)蛋白活性降低造成的。该疾病的临床表型高度变化,轻者仅表现为牙... 详细信息

低碱性磷酸酯酶症(Hypophospatasia,HPP)是一类涉及骨骼及牙齿发育缺陷的遗传性疾病,是由于肝/骨/肾碱性磷酸酯酶基因(ALPL)突变导致编码的非组织特异性碱性磷酸酶(TNAP)蛋白活性降低造成的。该疾病的临床表型高度变化,轻者仅表现为牙根发育不良导致的乳牙过早脱落,严重情况下可出现严重骨骼异常及高钙血症引发围产期死亡。按照临床表现可分成围产期型(致死性和良性)、婴幼儿型、儿童型、成人型和牙齿型。发育相关间充质干细胞及其微环境是维持骨骼及牙齿正常发育和修复再生的重要基础,因此通过研究发育相关干细胞的生物学特性,探索HPP导致牙根发育不良的致病机理,对该疾病的治疗十分必要。牙周膜干细胞能够维持牙周膜功能的稳定,发挥生理性细胞更新和组织损伤修复的作用,具有自我更新和多向分化的能力。本实验首先通过临床及实验室检查,结合患儿脱落乳牙的病理学检查及电镜分析,对1例乳牙早脱的患儿进行初步的临床和病理诊断,确定该患儿的临床表型及牙齿发育异常表现;进而分离培养乳牙牙周膜干细胞,并对其进行来源鉴定和生物学特性的分析;继而通过对患儿及正常儿童乳牙牙周膜干细胞进行生物学特性的比较,探讨低活性的TNAP对乳牙牙周膜干细胞分化的影响,为深入阐明低碱性磷酸酯酶症的致病机制提供一定实验依据和研究基础。本课题的研究内容及结果如下: 第一部分HPP患儿的临床、实验室和病理学检查及分析本课题研究对象为1例乳牙过早脱落的患儿,为明确诊断和临床分型,我们对患儿进行了详细的临床及实验室检查,并对患儿脱落的乳牙进行病理学和扫描电镜检查,观察和分析乳牙组织结构及发育情况。临床和实验室检查结果发现患儿主要表现为乳牙过早脱落,恒牙发育及萌出迟缓,牙周组织发育缺陷而骨骼发育无明显异常;多次实验室检查均发现血清碱性磷酸酶活性低于正常参考值,患儿尿磷酸乙醇胺的检测也为弱阳性;病理学检查和扫描电镜观察发现,患儿乳牙牙本质矿化程度低,牙本质小管较正常乳牙粗大;牙骨质层较薄且厚度不均匀,表面凹凸不平,部分牙根表面无牙骨质覆盖。根据患儿的临床、实验室、病理学检查结果,该患儿初步诊断为牙齿型低碱性磷酸酯酶症。第二部分正常人乳牙牙周膜干细胞生物学行为的实验研究本实验首次从正常人乳牙牙周膜中分离培养出干细胞,并通过免疫细胞化学方法和流式细胞仪对其来源进行鉴定,进而从增殖能力和多向分化能力等方面对乳牙牙周膜干细胞的生物学特性进行研究。实验结果显示:分离培养获得的人乳牙牙周膜干细胞在形态上与恒牙牙周膜干细胞相似,均为长梭形成纤维细胞样;免疫细胞化学和流式细胞仪分子表型鉴定显示乳牙牙周膜干细胞阳性表达间充质来源的表面标志STRO-1, CD146, CD29和CD90,而造血系来源的标志物CD34为阴性;细胞周期,MTT和克隆形成率的检测结果显示,人乳牙牙周膜干细胞的增殖能力强于恒牙牙周膜干细胞;人乳牙牙周膜干细胞在体外诱导条件下可以向成骨,成脂方向分化;同时RT-PCR检测发现,矿化诱导后细胞成骨相关基因(ALP,OCN和Col I)的表达上调,而成脂诱导后细胞成脂相关基因(PPAR-γ和C/EBPα)的表达上调。以上结果说明乳牙牙周膜中确实存在间充质来源的干细胞,并且具有很强的增殖能力和多向分化的能力,尤其是具备比恒牙牙周膜干细胞更强的增殖能力,是一种理想的种子细胞。第三部分HPP患儿乳牙牙周膜干细胞生物学行为的实验研究本实验首先分离培养HPP患儿和健康儿童乳牙牙周膜干细胞,进而比较两者在增殖和分化能力方面的差异,探索低活性的TNAP对牙周膜干细胞生物学行为的影响。细胞周期,MTT和克隆形成实验结果发现,HPP患儿的乳牙牙周膜干细胞在增殖能力上明显较正常细胞弱。两组细胞矿化诱导后HPP患儿细胞形成的矿化结节数量明显少于正常组。ALP活性分析显示,各个时间观察点患儿乳牙牙周膜干细胞的ALP活性都明显低于同一时间点正常组细胞的ALP活性。Real-time PCR结果显示,HPP患儿细胞RUNX2基因表达低于正常组,而其它相关功能基因ALP,OCN和CP23基因表达量均为患儿组高于正常组。体内移植实验发现,正常乳牙牙周膜干细胞与牙本质片复合植入裸鼠体内可形成牙周膜纤维样的结构;而患者细胞仅形成环绕牙本质片的不规则纤维。以上结果说明HPP患儿乳牙牙周膜干细胞的增殖能力和成骨能力明显低于正常细胞,低活性的TNAP影响乳牙牙周膜干细胞的生理功能及分化。

关键词：低碱性磷酸酯酶症碱性磷酸酯酶乳牙牙周膜干细胞

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锌(Ⅱ)配合物的碱性磷酸酯酶活性

化学研究与应用 1993年第3期5卷 76-78页

作者：郭德威樊春梅刘剑南开大学化学系天津300071

本文模拟的对象为碱性磷酸酯酶(EC3.1,3.1,AP)。它是一种以Zn(Ⅱ)为辅基的金属酶。Zn(Ⅱ)通过同3个组氨酸残基的咪唑氮配位而与酶蛋白相联,并以此构成AP的活性中心。AP广泛分布于动物和某些微生物中,它对生物体磷酸单酯和核苷酸的代谢... 详细信息

本文模拟的对象为碱性磷酸酯酶(EC3.1,3.1,AP)。它是一种以Zn(Ⅱ)为辅基的金属酶。Zn(Ⅱ)通过同3个组氨酸残基的咪唑氮配位而与酶蛋白相联,并以此构成AP的活性中心。AP广泛分布于动物和某些微生物中,它对生物体磷酸单酯和核苷酸的代谢、磷酸和能量的利用都有重要作用。 5种作为天然AP的模型化合物的合成及其表征,均见文献。

关键词：碱性磷酸酯酶酶转换率锌络合物

Cry1Ac 抗性棉铃虫碱性磷酸酯酶基因表达及多肽增效作用的研究

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Cry1Ac 抗性棉铃虫碱性磷酸酯酶基因表达及多肽增效作用的研究

作者：陈文波中国农业科学院

学位级别：硕士

棉铃虫（Helicoverpa armigera）是棉花上的主要害虫之一，为了控制棉铃虫的为害，我国在1997年开始种植Bt棉花。Bt棉花在有效控制棉铃虫发生为害的同时，由于Bt基因在植株体内持续表达，棉铃虫在整个生长周期都会受到来自Bt杀虫蛋白的... 详细信息

棉铃虫（Helicoverpa armigera）是棉花上的主要害虫之一，为了控制棉铃虫的为害，我国在1997年开始种植Bt棉花。Bt棉花在有效控制棉铃虫发生为害的同时，由于Bt基因在植株体内持续表达，棉铃虫在整个生长周期都会受到来自Bt杀虫蛋白的选择压力，促使其对转基因棉花发生抗性演化。目前尽管在田间还未发现棉铃虫高水品抗性种群，但已在实验室筛选出了多个棉铃虫高抗品系，这表明棉铃虫对Bt作物仍存在潜在的抗性演化风险。为了有效的延缓Bt抗性的产生，国内外对Bt的作用机理做了大量的研究。目前，钙粘蛋白（cadherin）、氨肽酶N（aminopeptidase N,APN）和碱性磷酸酯酶（alkaline phosphatase,ALP）已被识别为是Cry1A毒素在鳞翅目昆虫体内的受体。Cry毒素和受体的特异性结合能力的改变被认为是抗性产生的最主要原因，因此中肠受体蛋白表达量及酶活力等均与抗性的产生有关。为了有效的发挥Cry毒素的杀虫效果，延缓Bt抗性的演化，国内外对Cry毒素的的增效作用也做了深入的研究。有研究报道了原核表达的钙粘蛋白及氨肽酶N受体的毒素结合区片段显著增强了Cry1A毒素的效果。关于碱性磷酸酯酶片段对Cry1A的毒性影响的研究至今没有报道。本文研究内容及结果如下：（1）采用real-time qPCR技术比较了室内敏感品系96S与四个抗性品系中肠ALP基因的mRNA的表达情况,发现在各个抗性品系中ALP的mRNA表达量显著下降，中肠上皮细胞上的刷状缘膜囊泡中ALP酶活力同样显著下降。同时发现，随着对Cry1Ac的抗性倍数的增加，ALP的表达量及酶活都呈现下降趋势。（2） PCR扩增了ALP基因915bp的一段，我们预测其编码305个氨基酸，分子量为34.630kDa，等电点为6.92;经原核表达后，通过SDS-PAGE电泳及对表达纯化产物进行Western blot分析，表明表达产物分子量约为37kDa，与预测的理论值相符合，对表达纯化产物进行Western blot分析，进一步验证了碱性磷酸酯酶多肽片段得到了表达，且发现其可自身寡聚化为二聚体。（3）利用表达纯化的ALP片段与亚致死剂量的活化Cry1Ac毒素对敏感品系棉铃虫进行生物测定，发现ALP多肽片段显著增加了Cry1Ac的毒性。对ALP多肽片段进行功能分析发现，原核表达纯化的ALP片段Ligand blot分析表明，活化Cry1Ac毒素能够结合到约37kDa的蛋白条带上，说明该多肽片段可以结合活化Cry1Ac毒素。通过Western blot分析了ALP多肽片段与BBMV的结合情况，发现ALP多肽片段并不能与BBMV结合且对Cry1Ac毒素寡聚体的形成无明显促进作用。综上所述，ALP表达量的降低与抗性有关，且随着对Cry1Ac的抗性倍数的增加，ALP的表达量及酶活力都呈现下降趋势，这表明，ALP在抗性演化中有着重要的地位，是抗性产生的一个关键因素。因此，本研究表明ALP的表达水平差异是一种可用于抗性检测的有效分子标记。通过原核表达ALP毒素结合区片段，用原核表达的ALP毒素结合区片段与Cry1Ac毒素混合对敏感棉铃虫初孵幼虫进行生物测定，结果表明该多肽片段对Cry1Ac毒素有较强的增效作用。该研究为延缓抗性演化提供了一种可能的新途径。

关键词：棉铃虫碱性磷酸酯酶实时定量PCR 生测分析增效机理