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硫酸软骨素酶abc治疗减少大鼠脊髓损伤引起的酪氨酸蛋白激酶A4的表达

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生理学报 2011年第6期63卷 498-504页

作者：刘喜民康红钰徐纪伟孙丹华河南漯河医学高等专科学校漯河462002

本研究旨在探讨大鼠脊髓损伤(spinal cord impairment,SCI)后硫酸软骨素酶abc(chondroitinase abc,Chabc)对酪氨酸蛋白激酶A4(ephrin A4,EphA4)表达变化的影响。选取成年雌性SD大鼠,随机分为假手术组、生理盐水(NS)组和Chabc组。NS组和Chabc组大鼠行脊髓半切损伤术,并通过蛛网膜下腔分别注射NS和Chabc;假手术组仅接受背部切开术,没有半切脊髓。SCI后1、3、7、14、21d取损伤段脊髓样品,采用免疫荧光染色和免疫印迹检测各组EphA4表达;SCI后3d采用免疫荧光双标法检测损伤段脊髓内生长相关蛋白-43(growth associated protein43,GAP-43)和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表达情况。结果显示,术后1、3、7d,NS组EphA4阳性神经元数明显少于假手术组(Pabc组和NS组EphA4阳性神经元多于假手术组(Pabc组EphA4阳性神经元数均明显低于NS组(Pabc组最少;另外,各组均未出现GAP-43阳性神经元。以上结果提示,SCI后,Chabc可以降低神经元EphA4的表达,并减少EphA4阳性神经元周围的胶质细胞数,从而改善脊髓的内环境,有利于神经轴突的生长与延伸。

关键词：脊髓损伤硫酸软骨素酶abc 酪氨酸蛋白激酶A4

硫酸软骨素酶abc对大鼠脊髓损伤后生长相关蛋白43和神经胶质纤维酸性蛋白的影响

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中国修复重建外科杂志 2010年第10期24卷 1212-1216页

作者：徐纪伟孙丹华刘喜民刘红敏华新宇陈旭东漯河医学高等专科学校基础医学部河南漯河462002

目的探讨硫酸软骨素酶abc(chondroitinase abc,Chabc)对大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后生长相关蛋白43(growth associated protein43,GAP-43)和神经胶质纤维酸性蛋白(glial fi brillary acidic protein,GFAP)表达的影响。方法取成年雌性SD大鼠150只,体重250～300g,随机分为Chabc治疗组(A组)、生理盐水治疗组(B组)和假手术组(C组),每组50只。A、B组制作大鼠脊髓横断损伤模型,分别于SCI区通过蛛网膜下腔注射6μL Chabc(1U/mL)和等量生理盐水治疗;C组不切断脊髓及不治疗作为空白对照。于术后1、3、7、14、21d采用BBB评分法观察大鼠后肢运动功能情况,用免疫荧光染色法检测各组GAP-43和GFAP阳性表达并计数阳性表达神经元数量。结果术后各时间点A、B组BBB评分均明显小于C组(P0.05);术后14、21d,A组BBB评分明显高于B组(P0.05)。术后7、14、21d,A组GFAP阳性神经元数明显少于B组(P0.05)。结论 Chabc能够降解胶质瘢痕,改善大鼠SCI区域的微环境,使GAP-43表达增强,促进神经轴突的生长与延伸。

关键词：脊髓损伤硫酸软骨素酶abc 硫酸软骨素蛋白多糖生长相关蛋白43 神经胶质纤维酸性蛋白火鼠

硫酸软骨素酶abc-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物缓释微球的制备及其体外性质

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中国组织工程研究与临床康复 2008年第32期12卷 6247-6250页

作者：张德盛钟德君宋跃明吴江四川大学华西医院骨科四川大学华西医学中心生物医学工程实验室四川省成都市610041

背景:硫酸软骨素酶abc能够分解脊髓损伤局部持续产生的硫酸软骨素蛋白多糖,从而促进轴突的生长,但该酶性质不稳定,需要多次局部用药。目的:制备硫酸软骨素酶abc-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物缓释微球,观察其体外释药特性。设计、时间及地点:... 详细信息

背景:硫酸软骨素酶abc能够分解脊髓损伤局部持续产生的硫酸软骨素蛋白多糖,从而促进轴突的生长,但该酶性质不稳定,需要多次局部用药。目的:制备硫酸软骨素酶abc-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物缓释微球,观察其体外释药特性。设计、时间及地点:重复测量设计,于2006-03/2007-01在中国科学院成都有机所和四川大学华西医学中心药理实验室完成。材料:聚乳酸-聚乙醇酸共聚物、硫酸软骨素酶abc、CH2Cl2、硫酸软骨素B。方法:复乳法制备硫酸软骨素酶abc缓释微球,并以生理盐水为体外释药介质。主要观察指标:扫描电镜下观察硫酸软骨素酶abc缓释微球的形态。应用Malvern激光粒度分布测试仪测定其粒径分布并自动计算微球的平均粒径和径距。采用酶解分光光度测定硫酸软骨素酶abc含量,并计算载药量与包封率。于0.5,1,1.5,2,3,4,6,8,10,12,14,16,18,21d取样,绘制体外释药曲线。结果:硫酸软骨素酶abc缓释微球形态均匀,其平均粒径5.538μm,径距1.479,呈正态分布。平均载药量(15.55±0.90)×10-3%,平均包封率(53.88±1.45)%,硫酸软骨素酶abc微球在3周内的体外累积释药分数为0.8514,释药平稳,其最佳体外释药拟合方程为Weibull方程:lnln(1/1-Y)=0.7396lnX-1.617,R2=0.9933。结论:所制备的硫酸软骨素酶abc微球形态均匀,粒径分布窄,再分散性好,3周内能维持有效的药物浓度。

关键词：硫酸软骨素酶abc 聚乳酸-聚乙醇酸共聚物缓释微球生物材料

硫酸软骨素酶abc联合BMSCs修复大鼠脊髓损伤的实验研究

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中国修复重建外科杂志 2013年第5期27卷 541-546页

作者：张纯贺西京李浩鹏西安交通大学医学院第二附属医院骨二科西安710004

目的探讨硫酸软骨素酶abc(chondroitinase abc,Chabc)联合BMSCs对大鼠脊髓损伤的修复作用。方法取新生SD大鼠股骨、胫骨骨髓分离培养原代BMSCs。取成年雄性SD大鼠24只,体重200～230 g,制备脊髓挤压伤模型后,随机分为脊髓损伤对照组(A组)... 详细信息

目的探讨硫酸软骨素酶abc(chondroitinase abc,Chabc)联合BMSCs对大鼠脊髓损伤的修复作用。方法取新生SD大鼠股骨、胫骨骨髓分离培养原代BMSCs。取成年雄性SD大鼠24只,体重200～230 g,制备脊髓挤压伤模型后,随机分为脊髓损伤对照组(A组)、BMSCs移植组(B组)、Chabc注射组(C组)和Chabc联合BMSCs移植组(D组),每组6只。伤后7、14 d采用BBB评分法评价大鼠后肢运动功能;伤后14 d取材行HE染色计算损伤区面积;采用免疫荧光染色法观察胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)/硫酸软骨素蛋白多糖(chondroitin sulfate proteoglycan,CSPG)和GFAP/生长相关蛋白43(growth associated protein 43,GAP43)双标表达情况。结果伤后7 d各组大鼠均恢复了后肢3个关节的运动,各组BBB评分比较差异无统计学意义(P>0.05);伤后14 d A、B、C组大鼠后肢3个关节无负重拖动,D组大鼠足底位于负重位或偶尔足背负重步行,D组BBB评分高于其余3组(Pabc早期抑制星形胶质细胞分泌CSPG,并联合BMSCs移植可促进神经纤维再生,对大鼠脊髓损伤有一定修复作用。

关键词： BMSCs 硫酸软骨素酶abc 脊髓损伤细胞治疗大鼠

硫酸软骨素酶abc及Nogo-66受体拮抗剂联合鼠胚神经干细胞移植对大鼠脊髓损伤的影响

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中国脊柱脊髓杂志 2016年第6期26卷 527-536页

作者：余永涛廖烨晖唐强彭道琥钟德君四川医科大学附属医院脊柱外科四川省泸州市646000

目的:研究硫酸软骨素酶abc(chondroitinase abc,Ch abc)、Nogo-66受体拮抗剂[Nogo-66(1-40)antagonist peptide,NEP1-40]及鼠胚神经干细胞(neural stem cells,NSCs)联合移植对大鼠损伤脊髓功能恢复的影响。方法:体外应用全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)(浓度1.0μmol/L)诱导NSCs(前期实验分离、培养并冻存的鼠胚NSCs),诱导后鉴定NSCs特异性标志物,移植前通过5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxy Uridine,Brdu)标记NSCs。将60只SD大鼠随机分为假手术组(A组,n=10)、损伤对照组(B组,n=10)、NSCs治疗组(C组,n=10)、NSCs联合Ch abc治疗组(D组,n=10)、NSCs联合NEP1-40治疗组(E组,n=10)、NSCs联合Ch abc和NEP1-40治疗组(F组,n=10)。移植前分别对B、C、D、E及F组的大鼠制作胸段脊髓全横断损伤模型。术后3d,E和F组经留置的导管注入NEP1-40 20μl/d,连续28d;术后8d,C、D、E及F组经留置导管注入经ATRA干预和Brd U标记的NSCs 10μl;术后8d,D组和F组经留置导管注入Ch abc 10μl/d,连续7d;各时间点通过留置导管注入生理盐水保持各组移植液等量。术前及术后不同时间点,用BBB评分和体感诱发电位(somatosensory evoked potentials,SEP)潜伏期对大鼠后肢神经功能进行评价。移植后8周通过HE染色观察损伤脊髓组织情况,免疫荧光染色观察移植NSCs存活、神经元分化及轴突生长情况。结果:体外应用1.0μmol/L的ATRA诱导NSCs培养,可提高NSCs向神经元分化的比例。移植后2周开始各组大鼠BBB评分、SEP潜伏期开始观察到改善,移植治疗各组均优于损伤对照组,组间BBB评分和SEP潜伏期有差异(Pabc和NEP1-40移植对损伤脊髓功能的恢复具有协同促进作用。

关键词：脊髓损伤细胞移植全反式维甲酸神经干细胞硫酸软骨素酶abc Nogo-66受体拮抗剂大鼠

硫酸软骨素酶abc对大鼠脊髓损伤后硫酸软骨素蛋白多糖与生长相关蛋白43表达的影响

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解剖学杂志 2007年第5期30卷 582-584,601页

作者：林扬元谢群陈建明王玮莆田学院医学院人体解剖与组织胚胎学教研室莆田351100 福建医科大学人体解剖学与组织胚胎学系福州350001

目的:探讨硫酸软骨素酶abc对严重的大鼠脊髓损伤蛋白多糖及生长相关蛋白43(GAP-43)基因表达的影响。方法:制作大鼠脊髓横断伤模型,分为脊髓损伤组和脊髓损伤治疗组,给于治疗组硫酸软骨素酶abc鞘内注射,用免疫荧光组织化学观察硫酸软骨... 详细信息

目的:探讨硫酸软骨素酶abc对严重的大鼠脊髓损伤蛋白多糖及生长相关蛋白43(GAP-43)基因表达的影响。方法:制作大鼠脊髓横断伤模型,分为脊髓损伤组和脊髓损伤治疗组,给于治疗组硫酸软骨素酶abc鞘内注射,用免疫荧光组织化学观察硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs)的表达,半定量RT-PCR、Western印迹法观察GAP-43 mR- NA及蛋白的表达。结果:治疗组与损伤组比较,CSPGs的表达减少,差异具有显著性,而GAP-43mRNA及蛋白表达增多。结论:硫酸软骨素酶abc能够裂解CSPGs,改善脊髓损伤区的微环境,促进GAP-43 mRNA及蛋白的表达,是修复脊髓损伤和促进神经再生的机制之一。

关键词：硫酸软骨素酶abc 脊髓损伤硫酸软骨素蛋白多糖生长相关蛋白43

硫酸软骨素酶abc对大鼠脊髓损伤修复的影响

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神经解剖学杂志 2007年第3期23卷 288-292页

作者：林扬元谢群陈建明王玮莆田学院医学院人体解剖与组织胚胎学教研室莆田351100 福建医科大学人体解剖学与组织胚胎学系福州350001

为了探讨硫酸软骨素酶abc对脊髓损伤后损伤局部瘢痕形成和脊髓传导功能修复的影响,本研究首先制作大鼠脊髓全横断损伤动物模型,并将其分为脊髓损伤组(A组)和脊髓损伤治疗组(B组)。在观察期内对动物的行为学表现进行BBB评分;用免疫荧光... 详细信息

为了探讨硫酸软骨素酶abc对脊髓损伤后损伤局部瘢痕形成和脊髓传导功能修复的影响,本研究首先制作大鼠脊髓全横断损伤动物模型,并将其分为脊髓损伤组(A组)和脊髓损伤治疗组(B组)。在观察期内对动物的行为学表现进行BBB评分;用免疫荧光组织化学方法观察损伤4周后硫酸软骨素酶abc对损伤局部的硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPGs)的裂解作用;用辣根过氧化物酶(HRP)示踪法观察损伤8周后神经纤维的再生情况。结果显示:A组与B组之间动物的行为学评分B组优于A组,有显著性差异(P硫酸软骨素蛋白聚糖阳性物质的表达明显低于A组,具有显著性差异(P硫酸软骨素核心蛋白的表达无显著性差异(P>0.05);HRP示踪法显示B组脊髓损伤头端可见少量HRP标记的神经元胞体和纤维。本研究结果提示硫酸软骨素酶abc能够裂解CSPGs中的葡胺聚糖链,减少瘢痕,促进损伤的神经纤维再生。

关键词：脊髓损伤神经再生硫酸软骨素酶abc 硫酸软骨素蛋白聚糖硫酸软骨素核心蛋白

硫酸软骨素酶abc对脑损伤后胶质瘢痕影响的实验研究

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中华神经医学杂志 2011年第6期10卷 609-613页

作者：洪怡瑜李业海寇盛斌杜谋选姜晓丹南方医科大学珠江医院神经外科广东神经外科研究所广东省脑功能修复与再生重点实验室广州510282

目的探讨硫酸软骨素酶abc（chabc）对脑损伤后胶质瘢痕组织的影响。方法38只Wistar大鼠按随机数字表法分成5组：正常对照组（n=2）、模型组（n=9）、1．0U／mLchabc治疗组m=9）、2．5U／mLchabc治疗组（n=9）、5．0U／mLchabc治疗组（n=... 详细信息

目的探讨硫酸软骨素酶abc（chabc）对脑损伤后胶质瘢痕组织的影响。方法38只Wistar大鼠按随机数字表法分成5组：正常对照组（n=2）、模型组（n=9）、1．0U／mLchabc治疗组m=9）、2．5U／mLchabc治疗组（n=9）、5．0U／mLchabc治疗组（n=9），后4组采用自由落体撞击法制作大鼠脑损伤模型，造模后即刻在后3组大鼠局部脑皮层下1mm处注射不同浓度chabc2μL，正常对照组不做任何处理。造模后1、2、4周取脑组织标本行HE染色．分别应用免疫组化染色和Western blotting检测硫酸软骨素多聚蛋白糖（CSPGs）的表达。结果HE染色显示损伤后2周模型组大鼠脑皮层大量星形胶质细胞聚集．不同浓度chabc治疗组损伤部位的星形胶质细胞聚集较模型组减少，以5．0U／mL chabc治疗组明显。免疫组化染色显示模型组，1．0、2．5、5．0U／mLchabc治疗组损伤后2周大鼠脑组织CSPGs分泌均较正常对照组增加，差异有统计学意义（职0．05）；与模型组比较，5．0U／mLchabc治疗组大鼠脑组织CSPGs分泌减少．差异有统计学意义（P〈0．05）。Westem blotting检测显示造模后1、2、4周不同浓度chabc治疗组CSPGs表达均较模型组低．差异有统计学意义（p〈0．05）；模型组和2．5、5．0U／mLchabc治疗组大鼠脑组织中CSPGs的表达在造模后1、2、4周逐渐降低，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论chabc能降解胶质瘢痕中主要抑制分子CSPGs，改善脑损伤后局部轴突再生的抑制性微环境．且高浓度（5．0U／mL）chabc表现最明显。

关键词：硫酸软骨素酶abc 颅脑损伤神经再生

硫酸软骨素酶abc及Nogo-66受体拮抗剂联合鼠胚神经干细胞移植对大鼠脊髓损伤修复的实验研究

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硫酸软骨素酶ABC及Nogo-66受体拮抗剂联合鼠胚神经干细胞移植对大...

作者：余永涛西南医科大学

学位级别：硕士

目的:研究硫酸软骨素酶abc(chondroitinase abc,Chabc)、Nogo-66受体拮抗剂(Nogo-66(1-40)antagonist peptide,NEP1–40)及鼠胚神经干细胞(neural stem cells,NSCs)联合移植对移植神经元轴突的再生、生长以及大鼠损伤脊髓功能修复的作用。方法:(1)对前期实验冻存的鼠胚神经干细胞进行复苏。体外应用全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)(浓度1.0umol/L)诱导NSCs。(2)随机将60只Sprague-Dawleg(SD)大鼠分成6组,每组10只,如实验过程有死亡,及时补充:假手术对照组(只做椎板切除)(A组)、脊髓横断伤对照组(B组)、神经干细胞(NSCs)治疗组(C组)、神经干细胞(NSCs)结合硫酸软骨素酶abc(Chabc)治疗组(D组)、神经干细胞(NSCs)结合Nogo-66受体拮抗剂(NEP1-40)治疗组(E组)、神经干细胞(NSCs)结合硫酸软骨素酶abc(Chabc)及Nogo-66受体拮抗剂(NEP1-40)治疗组(F组),对B、C、D、E及F组构建T10水平脊髓完全横断损伤模型。通过5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine,Brdu)标记前期经ATRA诱导培养的NSCs,以备移植。术后第2天,D组经留置导管注入Chabc10uL/d(浓度:5U/ml),连续14d;E组经留置导管注入NEP1-4010uL/d(浓度:1ug/uL),连续14天;F组经留置导管注入NEP1-4010uL/d(浓度:1ug/uL)和Chabc 10uL/d(浓度:5U/ml),连续14天;A、B和C组经留置导管注入PBS液20uL/d,连续14d;(2)术后第8d,C、D、E及F组在无菌条件下用微量注射器经留置导管向脊髓横断处蛛网膜下腔注入经ATRA干预和BrdU标记的NSCs10uL(细胞浓度:2×10/uL);A、B组经留置导管向脊髓横断处蛛网膜下腔注入PBS液10uL;各时间点各组通过注入磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)使移植量均等,进行对照。(3)术前及术后不同时间点,用Basso,Beattie,Bresnahan(BBB)评分和体感诱发电位(Somatosensory evoked potentials,SEP)潜伏期对大鼠后肢神经功能改变进行评价。移植后8w取实验大鼠损伤处脊髓组织制作切片,通过HE和免疫荧光染色观察损伤处脊髓组织改变、移植NSCs存活、神经元轴突再生及生长情况。应用SPSS17.0软件进行统计学分析,不同干预处理间交互效应用析因设计方差分析;组间差异采用单因素方差分析,两两比较采用独立样t检验,统计学检验标准为Pabc和NEP1–40联合NSCs移植的效应估计值大于两者单独联合NSCs移植的效应之和。(2)移植后8w,HE染色显示:假手术组:组织形态、细胞结构完整,细胞排列规则;损伤对照组:组织结构严重破坏,细胞排列不规则,大量细胞结构溶解、消失,可见较大的囊腔以及较多胶质瘢痕;各移植组:毛细血管及细胞增生明显,见较小囊腔,尤其联合移植组更明显。(3)免疫荧光染色显示:仅C、D、E及F组内可见橘红色Brdu标记阳性细胞,Brdu标记阳性细胞数组间比较差异有统计学意义(Pabc和NEP1–40联合NSCs移植的效应估计值大于两者单独联合NSCs移植的效应之和。结论:(1)ATRA诱导培养的NSCs移植、NSCs联合Chabc移植和NSCs联合NEP1-40移植均能促使大鼠脊髓损伤

关键词：脊髓损伤全反式维甲酸神经干细胞硫酸软骨素酶abc Nogo-66受体拮抗剂细胞移植