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糖皮质激素对急性肺栓塞后肺组织内硫氰酸生成酶表达的影响

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中国现代医学杂志 2008年第3期18卷 293-297,301页

作者：李圣青任新玲刘阿茹远帝新宇简文欧阳海峰赵峰第四军医大学西京医院呼吸科陕西西安710032

目的研究糖皮质激素对大鼠急性肺栓塞后肺组织内硫氰酸生成酶(rhodanase,Rho)表达的影响。方法建立大鼠急性肺栓塞模型,分别在急性肺栓塞后1、8、24和48h开胸取出肺组织。常规提取肺组织的总RNA和总蛋白,以正常组为对照,采取半定量RT-PC... 详细信息

目的研究糖皮质激素对大鼠急性肺栓塞后肺组织内硫氰酸生成酶(rhodanase,Rho)表达的影响。方法建立大鼠急性肺栓塞模型,分别在急性肺栓塞后1、8、24和48h开胸取出肺组织。常规提取肺组织的总RNA和总蛋白,以正常组为对照,采取半定量RT-PCR和westernblot方法研究Rho在mRNA水平和蛋白水平的表达变化;采用免疫组织化学的方法检测大鼠肺组织中Rho在肺栓塞前后表达的变化及其组织分布情况。在大鼠急性肺栓塞后48h,采用RT-PCR和western blot方法观察地塞米松(dexamethasone,DEX)对Rho蛋白表达的影响。分离培养原代大鼠气道上皮细胞,在培养液中加入50ng/mL的共刺激因子IL-1β,TNF-α和IFN-γ,采用半定量RT-PCR,westernblot和免疫荧光染色的方法观察1μM的DEX对上皮细胞Rho表达的影响,采用ELISA方法检测上皮细胞IL-8和GM-CSF的表达。结果大鼠急性肺栓塞后,Rho的mRNA水平和蛋白水平均逐渐下降,免疫组化研究表明Rho主要分布在支气管粘膜上皮细胞,在急性肺栓塞后表达显著下降。DEX可显著提高Rho的肺内表达。大鼠气道上皮细胞在共刺激因子的作用下IL-8和GM-CSF的表达显著升高,DEX可明显抑制IL-8和GM-CSF的表达,但是Rho的表达显著升高。结论大鼠急性肺栓塞后肺组织内Rho的表达明显下降,糖皮质激素可升高Rho的表达。离体实验证明糖皮质激素是通过抑制上皮细胞的炎症反应来提高Rho的表达。

关键词：急性肺栓塞大鼠气道上皮细胞硫氰酸生成酶糖皮质激素

甜荞硫氰酸生成酶cDNA片段的克隆与序列分析

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江苏农业学报 2009年第5期25卷 1185-1187页

作者：吕蕾于寒松郭志军胡耀辉吉林农业大学食品科学与工程学院吉林长春130118 延边大学农学院食品科学系吉林龙井133400

硫氰酸生成酶(Rhodanese,EC2.***.1.1),也称硫代硫酸盐硫基转移酶(Thiosulfate sulfurtransferase,TST),是一种线粒体基质酶,该酶通过催化硫代硫酸盐中的1个硫原子转移到氰化物或巯基化合物,使氰化物和H2S毒性降低,在硫氰酸生成酶的催化下... 详细信息

硫氰酸生成酶(Rhodanese,EC2.***.1.1),也称硫代硫酸盐硫基转移酶(Thiosulfate sulfurtransferase,TST),是一种线粒体基质酶,该酶通过催化硫代硫酸盐中的1个硫原子转移到氰化物或巯基化合物,使氰化物和H2S毒性降低,在硫氰酸生成酶的催化下,与氰离子结合转变为毒性甚微的硫氰酸盐从肾排出[1].

关键词：硫氰酸生成酶 RT—PCR cDNA 基因克隆甜荞

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家蝇和日本沼虾硫氰酸生成酶基因功能研究

家蝇和日本沼虾硫氰酸生成酶基因功能研究

作者：李响河北大学

学位级别：硕士

家蝇（Musca domestica）属于节肢动物门昆虫纲双翅目蝇科蝇属，广泛分布于陆地各处。日本沼虾（Macrobrachium nipponense）属于节肢动物门甲壳纲十足目长臂虾科沼虾属，俗称青虾、河虾，广泛分布于中国、日本、东南亚和俄罗斯远东地... 详细信息

家蝇（Musca domestica）属于节肢动物门昆虫纲双翅目蝇科蝇属，广泛分布于陆地各处。日本沼虾（Macrobrachium nipponense）属于节肢动物门甲壳纲十足目长臂虾科沼虾属，俗称青虾、河虾，广泛分布于中国、日本、东南亚和俄罗斯远东地区的淡水河湖中。本文以陆生昆虫家蝇和水生甲壳动物日本沼虾为材料研究和比较其硫氰酸生成酶的功能。本研究共分以下4个部分：（1）以本实验室前期研究获得的1条家蝇硫氰酸生成酶基因的氨基酸序列作为query sequence，利用tBlastn程序在家蝇转录组和日本沼虾转录组中查找其同源序列。随后使用BlastX、SMART和ORF Finder程序对获得的序列进行分析，最后确定了家蝇的5条序列和日本沼虾的3条序列为硫氰酸生成酶样基因，并命名为Md-Rho1-5和Mn-Rho1-3。使用CLC Main Workbench5软件对获得的序列和其他物种的硫氰酸生成酶、巯基丙酮酸硫转移酶和HSP67B2基因的氨基酸序列进行同源比对和进化树构建，明确了硫氰酸生成酶之间的分子进化关系。（2）成功构建了6种原核表达载体。获得了4种可溶性表达的重组蛋白rMd-Rho1、rMd-Rho4、rMn-Rho1和rMn-Rho2，并且均具有硫氰酸生成酶活性。还获得2种包涵体形式存在的重组蛋白rMd-Rho2和rMd-Rho3，经过变性复性过程之后，这2种重组蛋白也表现出了硫氰酸生成酶活性。（3）利用GST pull down技术筛选了与硫氰酸生成酶相互作用的蛋白质，结果显示1条80kD左右的差异条带，但质谱鉴定未能明确是何种蛋白。（4）利用实时荧光定量技术对Md-Rho3、Md-Rho4和Mn-Rho1、Mn-Rho2基因的表达模式进行研究。发现Md-Rho3、Mn-Rho1、Mn-Rho2基因在细菌刺激后上调表达，而Md-Rho2在刺激后下调表达。组织定量结果显示Md-Rho3主要在家蝇血细胞中表达而Md-Rho4主要在家蝇肠道中表达，Mn-Rho1主要分布日本沼虾的肝脏和鳃中，而Mn-Rho2主要分布在日本沼虾的肝脏中，在鳃中含量较低。揭示了硫氰酸生成酶在免疫中的不同作用。

关键词：家蝇日本沼虾硫氰酸生成酶原核表达实时荧光定量PCR

家蝇硫氰酸生成酶MdRDH2参与抗逆的分子机制

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家蝇硫氰酸生成酶MdRDH2参与抗逆的分子机制

作者：高雅雅河北大学

学位级别：硕士

硫氰酸生成酶(Rhodanese)是生物体中一种重要的硫转移酶,参与氰化物解毒、硫代谢、氧化还原平衡等重要生理生化过程,有关硫氰酸生成酶的研究主要集中在脊椎动物和植物中,而在节肢动物中了解甚少。本研究从双翅目昆虫家蝇(Musca domesti... 详细信息

硫氰酸生成酶(Rhodanese)是生物体中一种重要的硫转移酶,参与氰化物解毒、硫代谢、氧化还原平衡等重要生理生化过程,有关硫氰酸生成酶的研究主要集中在脊椎动物和植物中,而在节肢动物中了解甚少。本研究从双翅目昆虫家蝇(Musca domestica)中克隆一条HSP67B2样硫氰酸生成酶基因MdRDH2,并对其活性和功能进行了探究。所得结果如下:***2序列长度为729 bp,具有1个498 bp的开放阅读框,编码1条165个氨基酸残基的蛋白质,分子量18.54 k Da。蛋白序列无信号肽,具有典型硫氰酸活性催化位点,且C端有硫氰酸生成酶特征序列,是一个单结构域蛋白。2.组织定量qPCR检测MdRDH2在肠道中表达量最高,其次是脂肪体;MdRDH2能响应重金属镉刺激,CdCl胁迫后,家蝇幼虫体内MdRDH2及硫化物代谢相关基因胱硫氨酸γ-裂解酶(MdCSE)、胱硫氨酸β合成酶(MdCBS)、硫醌氧化还原酶(MdSQR)、亚硫酸盐氧化酶(MdSO)和过硫双加氧酶(MdPDO)的mRNA水平均有所上调。3.利用原核表达系统对MdRDH2进行了重组表达,并在体外以NaSO为硫供体,以NaCN为受体,验证了rMdRDH2的转硫酶活性;rMdRDH2分子具有非常强的热稳定性,即便在80℃处理1 h后仍保留了53%的活性;做双倒数曲线对rMdRDH2与硫代硫酸钠和氰化钠亲和力进行了检测,结果发现rMdRDH2对硫代硫酸钠亲和力强于氰化钠;体外耐受试验表明,与对照组相比,表达MdRDH2显著增强了宿主***对Cu、Cd和吩嗪硫酸甲酯(PMS)的耐受能力,提示MdRDH2可能在机体抗逆反应及调节氧化应激中发挥作用。4.通过CRISPR-CAS9基因编辑技术构建了突变体RDH2-M1和RDH2-M2,其中RDH2-M1蛋白缺少6个氨基酸残基,而RDH2-M2缺失了绝大部分氨基酸序列。生长发育观察发现突变体RDH2-M1和RDH2-M2孵化率降低、蛹重量下降、羽化率降低、成蝇寿命变短。幼虫在镉胁迫或热处理下存活率明显下降。提取两个突变体的线粒体,酶学检测发现硫氰酸生成酶活性几乎完全消失,同时发现线粒体电子呼吸链复合物I、II活性降低,提示MdRDH2的突变影响了线粒体呼吸。综上结果得出,家蝇MdRDH2主要功能可能不是氰化物解毒,而是在机体抗逆反应中维持线粒体稳定,维持氧化还原平衡。该研究加深了我们对硫氰酸生成酶超家族在无脊椎动物中功能的了解。

关键词：家蝇硫氰酸生成酶镉耐受氧化应激线粒体

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日本沼虾硫氰酸生成酶抗氧化功能的初步研究

日本沼虾硫氰酸生成酶抗氧化功能的初步研究

作者：吉聪聪河北大学

学位级别：硕士

日本沼虾(Macrobrachium nipponense)是重要的淡水养殖虾类,因其经常遭到病原体侵染而造成巨大的经济损失,因此对日本沼虾的免疫系统中免疫机制的研究具有重要的意义。本实验室研究过一条日本沼虾硫氰酸生成酶序列(MnRHOD1),利用该序列... 详细信息

日本沼虾(Macrobrachium nipponense)是重要的淡水养殖虾类,因其经常遭到病原体侵染而造成巨大的经济损失,因此对日本沼虾的免疫系统中免疫机制的研究具有重要的意义。本实验室研究过一条日本沼虾硫氰酸生成酶序列(MnRHOD1),利用该序列在日本沼虾转录组中检索到4条相似序列,分别命名为MnRHOD2、MnRHOD3、MnRHOD4、MnRHOD5。本研究成功诱导并表达了日本沼虾硫氰酸生成酶MnRHOD2--MnRHOD5,并检测其对应的融合蛋白的活性,4个成功诱导表达的蛋白都有酶活特性。4条基因的表达模式各不相同,MnRHOD2、MnRHOD3、MnRHOD5基因在肝胰腺中相对表达量最高,而MnRHOD4在鳃中表达量最高;MnRHOD2、MnRHOD4、MnRHOD5这三个基因在维氏气单胞菌刺激后都呈现出上调趋势,MnRHOD3呈现出下调的趋势。为验证日本沼虾硫氰酸生成酶基因是否与氧化应激相关,我们用RNAi的方式将MnRHOD2敲低,MnRHOD2敲低后ROS(活性氧)和MDA(丙二醛)的水平都升高了。进一步在细菌中验证日本沼虾硫氰酸生成酶2是否有抗氧化性,在对抗吩嗪硫酸甲酯(PMS,氧化应激激活剂)产生的氧化胁迫时,随着PMS浓度的升高,重组表达菌***中该基因活性位点突变后存活数量明显不如活性位点突变前的重组菌株。初步证实了硫氰酸生成酶2具有抗氧化应激的作用。

关键词：日本沼虾硫氰酸生成酶免疫氧化应激抗氧化

荞麦中2种重要的功能性蛋白cDNA片段克隆与序列分析

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吉林农业大学学报 2008年第3期30卷 356-359页

作者：胡耀辉郭志军于寒松刘仁杰贾帅吕蕾吉林农业大学食品科学与工程学院长春130118

以乌克兰甜荞为材料提取总RNA,反转录后采用cDNA末端快速克隆技术(RACE)克隆蛋白酶抑制剂和硫氰酸生成酶基因的3′端序列,并采用生物信息学技术进行序列分析。结果表明:获得的蛋白酶抑制剂和硫氰酸生成酶的3′端基因序列片段长度分别为3... 详细信息

以乌克兰甜荞为材料提取总RNA,反转录后采用cDNA末端快速克隆技术(RACE)克隆蛋白酶抑制剂和硫氰酸生成酶基因的3′端序列,并采用生物信息学技术进行序列分析。结果表明:获得的蛋白酶抑制剂和硫氰酸生成酶的3′端基因序列片段长度分别为307 bp和372 bp,生物信息学分析结果表明所获得的蛋白酶抑制剂基因片段与GenBank上已发表的苦荞蛋白酶抑制剂同源性为67%,获得的硫氰酸生成酶基因片段与Gen-Bank上已发表的拟南芥硫氰酸生成酶的同源性为65%。

关键词：荞麦蛋白酶抑制剂硫氰酸生成酶 RACE 基因克隆

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氰化物中毒救治药物的研究进展

中华卫生应急电子杂志 2015年第6期1卷 60-64页

作者：但国蓉赵远鹏赵吉清王宾叶枫程晋赛燕蔡颖邹仲敏第三军医大学军事预防医学院毒理学研究所重庆400038

氰化物是分子中含有氰离子(cyanion,CN-)的剧毒化合物,主要有氢氰酸、氯化氢、氰化钠和氰化钾,皮肤伤口接触、吸入、吞食微量就会中毒死亡,军事上属于速杀型战剂。氰化物是非常重要的化工原料,常用于基本化学合成、染料、电镀、冶金、... 详细信息

氰化物是分子中含有氰离子(cyanion,CN-)的剧毒化合物,主要有氢氰酸、氯化氢、氰化钠和氰化钾,皮肤伤口接触、吸入、吞食微量就会中毒死亡,军事上属于速杀型战剂。氰化物是非常重要的化工原料,常用于基本化学合成、染料、电镀、冶金、有机合成医药、农药合成及金属处理等方面,尤其在金银等贵重金属提炼和电镀等行业用量很大。此外,有些装修装饰材料燃烧后产生的烟气中也含有氰化物。因此,氰化物具有结构简单、毒性高、应用广、易获取等特点。

关键词：氰化物中毒氰离子羟钴胺皮肤伤口农药合成依地酸二钴中毒死亡硫氰酸生成酶硫代硫酸装饰材料