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中华医学遗传学杂志 2003年第4期20卷 328-330页

作者：郭紫芬陈琳玲张佳彭翠英杨向东张旭何淑雅廖端芳李凯南华大学药物药理研究所衡阳421001 津脉公司南华大学生物化学与分子生物学研究所衡阳421001

目的　探讨硫化修饰的次 3′末端不配对引物能否引发高保真 DNA聚合酶介导的聚合反应的非成熟性终止 ,即所谓聚合反应的“关”效应。方法　采用配对及非末端不配对的 3′硫化修饰引物 ,研究其对不同保真度 DNA聚合酶引物延伸反应的影响... 详细信息

目的　探讨硫化修饰的次 3′末端不配对引物能否引发高保真 DNA聚合酶介导的聚合反应的非成熟性终止 ,即所谓聚合反应的“关”效应。方法　采用配对及非末端不配对的 3′硫化修饰引物 ,研究其对不同保真度 DNA聚合酶引物延伸反应的影响。结果　非末端不配对的 3′硫化修饰引物也能引发高保真 DNA聚合酶介导的聚合反应非成熟性终止 ,而对低保真 DNA聚合酶所介导的聚合反应则无明显影响。同时 ,3′硫化修饰的配对引物对不同保真度 DNA聚合酶引物延伸反应均无影响。结论　硫化修饰的次 3′末端不配对引物与 3′末端不配对引物对引物延伸的影响相似 ,同样能引起高保真 DNA聚合酶介导的聚合反应的“关”的效应。显然 ,在单基因遗传病的诊断及单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism,SNP)的高通量分析等方面 ,硫化修饰的碱基特异性引物与高保真 DNA聚合酶所构成的对 SNP敏感的“开 /关”系统 ,具有广阔的应用前景。

关键词：单核酸多态性高保真聚合酶硫化修饰引物 DNA 聚合反应单基因遗传病诊断

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基因突变敏感性分子开关检测β地中海贫血基因突变

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实用医学杂志 2012年第2期28卷 178-180页

作者：兰芬郭紫芬邓坤龙廖端芳李凯南华大学药物药理研究所湖南省衡阳市421001 湖南中医药大学药学院中医诊断学系 410208 苏州大学第二附属医院分子医学中心 215004

目的:采用高保真DNA聚合酶介导的基因突变敏感性分子开关准确、快速检测β地中海贫血。方法:首先提取正常人血液基因组DNA,根据已知β珠蛋白基因热点突变CD41-42、IVS2-654区域序列,分别设计突变序列扩增引物,利用低保真酶进行引物延伸... 详细信息

目的:采用高保真DNA聚合酶介导的基因突变敏感性分子开关准确、快速检测β地中海贫血。方法:首先提取正常人血液基因组DNA,根据已知β珠蛋白基因热点突变CD41-42、IVS2-654区域序列,分别设计突变序列扩增引物,利用低保真酶进行引物延伸反应,将其PCR产物克隆到pMD19-T载体,得到β地中海贫血常见的两个突变位点的基因突变克隆:CD41-42、IVS2-654,然后以这两个突变位点为检测靶点,分别设计3′末端与野生型基因位点或突变基因位点配对的引物,硫化磷酸修饰3′末端并偶联高保真DNA聚合酶构成的基因突变敏感性分子开关,对含有相应突变的阳性质粒模板及正常人基因组DNA模板进行引物延伸反应,并通过凝胶成像系统对其进行分析。结果:当引物与模板完全配对时,引物被延伸,有PCR产物;当引物与模板不完全配对时,引物不被延伸,无PCR产物。结论:高保真DNA聚合酶介导的基因突变敏感性分子开关能准确、快速筛查β地中海贫血CD41-42、IVS2-654突变,提示其在单基因遗传病的诊断中具有广阔的应用前景。

关键词： β地中海贫血高保真聚合酶硫化修饰引物

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基因突变敏感性分子开关检测β地中海贫血

基因突变敏感性分子开关检测β地中海贫血

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作者：兰芬南华大学

学位级别：硕士

目的：采用高保真DNA聚合酶介导的基因突变敏感性分子开关准确、快速检测β地中海贫血基因突变。方法：首先提取正常人血液基因组DNA，根据已知中国人群β珠蛋白基因热点突变CD41-42、IVS-2nt654、TATAbox-28、CD17、CD71-72及CD26... 详细信息

目的：采用高保真DNA聚合酶介导的基因突变敏感性分子开关准确、快速检测β地中海贫血基因突变。方法：首先提取正常人血液基因组DNA，根据已知中国人群β珠蛋白基因热点突变CD41-42、IVS-2nt654、TATAbox-28、CD17、CD71-72及CD26区域序列，分别设计引入突变位点的扩增引物，利用低保真酶进行引物延伸反应，将其PCR产物克隆到pMD19-T载体，得到β地中海贫血常见的六个突变位点的基因突变克隆：CD41-42、IVS-2nt654、TATAbox-28、CD17、CD71-72及CD26。然后以这六个突变位点为检测靶点，分别设计3’末端与野生型基因位点或突变型基因位点配对的引物，硫化磷酸修饰后偶联高保真DNA聚合酶构成基因突变敏感性分子开关。首先在不同体系分别对含有相应突变位点的六个阳性质粒模板及正常人基因组DNA模板进行引物延伸反应，并通过凝胶成像系统对其进行分析;然后在同一体系中同时对含有相应突变位点的六个阳性质粒模板及正常人基因组DNA模板进行引物延伸反应，并通过凝胶成像系统对其进行分析;最后对已知分别含有CD26和TATAbox-28突变位点的病人DNA样本进行检测。结果：在不同反应体系分别对六个热点突变进行检测。结果显示，使用正常人的染色体DNA样本，该方法仅能使野生型等位基因相关引物得以延伸，而突变型等位基因位点特异性引物不能被延伸。反之，使用突变质粒模板，该方法仅能使突变型等位基因位点相关引物得以延伸，而野生型等位基因位点特异性引物不能被延伸。在同一反应体系同时对以上热点突变进行检测。同样，完全配对引物能被延伸，不完全配对引物不能被延伸。对分别含有CD26和TATAbox-28突变位点的病人DNA样本进行检测，与含CD26突变位点的病人DNA模板配对的突变引物有产物，不配对的无产物;与含TATAbox-28突变位点的病人DNA模板配对的突变引物有产物，不配对的无产物。结论： 1.成功获得可用于基因检测技术研发的人工突变的地中海贫血基因突变阳性模板;2.高保真聚合酶介导的突变敏感性分子开关对β地中海贫血基因单一热点突变有较高的特异性和敏感性;3.高保真聚合酶介导的突变敏感性分子开关可用于多重PCR快速筛查β地中海贫血基因热点突变。

关键词：高保真聚合酶硫化修饰引物 β地中海贫血基因检测

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应用SNP敏感性分子开关检测线粒体DNA编码区单核苷酸多态性的研究

应用SNP敏感性分子开关检测线粒体DNA编码区单核苷酸多态性的研究

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作者：洪美南京医科大学

学位级别：硕士

目的建立高保真DNA聚合酶介导的硫化修饰等位基因特异性PCR(allele-specific PCR, AS-PCR),并将其应用于线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)编码区单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)的研究工作,探讨其实际应用价值;同时调查60例中国江苏无关汉族个体mtDNA编码区4个SNP基因座等位基因频率和单倍型分布情况,为群体遗传学提供新的数据。方法1根据线粒体DNA编码区10400(T/C)位点设计未修饰及3′末端硫化修饰的等位基因特异性引物,采用低保真Taq和高保真Pfu DNA聚合酶进行引物延伸反应,2%琼脂糖凝胶电泳比较扩增结果。2从线粒体DNA编码区筛选多态性较好的4个SNP(C12705T、G8701A、G8584A、C10400T)基因座。针对每个SNP基因座设计两条片段相差4个碱基的3′末端硫化修饰等位基因特异性引物和一条公共引物。血液标本采自中国江苏地区60名汉族无关、健康个体。采用Chelex-100法提取模板mtDNA,利用Pfu高保真DNA聚合酶进行扩增反应。扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染显带后分析样本的基因型并应用直接测序技术验证分型结果的准确性。结果1与传统AS-PCR相比,高保真Pfu DNA聚合酶介导的硫化修饰等位基因特异性PCR独具的开关效应使引物延伸的特异性大大提高,降低了SNP分析的假阳性率,提高了对SNP检测的准确性和可靠性。2应用上述方法对江苏地区汉族群体60名无关个体4个mtDNA-SNP基因座进行了准确分型,不同等位基因型各为一条长度不同的单一谱带,分型结果与直接测序完全一致。4个mtDNA-SNP基因座C12705T、G8701A、G8584A、C10400T等位基因频率分别为0.37/0.63、0.47/0.53、0.83/0.17、0.53/0.47,共检出6种单倍型,单倍型的基因多样性为0.7438,偶合概率值为0.2686。结论本研究成功建立了由高保真DNA聚合酶和3′末端硫化修饰等位基因特异性引物共同构成的SNP敏感性分子开关技术,并应用于mtDNA编码区单核苷酸多态性的群体遗传学研究,证实该技术检测SNP的准确性和优越性,具有极高的临床实用价值,值得在基因SNP研究中进一步推广;同时为线粒体SNP基因座在法医学等方面的应用提供了方法学和群体遗传学基础。

关键词： SNP 等位基因特异性PCR 高保真DNA聚合酶硫化修饰引物线粒体DNA

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单核苷酸多态性敏感分子开关在基因组单核苷酸多态性检测中的特异性分析

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中国动脉硬化杂志 2005年第3期13卷 279-281页

作者：彭翠英胡卫民周翠兰陈琳玲刘俊肖莉殷宇芳李凯廖端芳南华大学药物药理研究所娄底市中心医院湖南省娄底市417000 南华大学细胞生物学与遗传学教研室湖南省衡阳市421001

目的探讨硫化修饰的碱基特异性引物与高保真DNA聚合酶所构成的对单核苷酸多态性敏感的分子开关系统在基因组单核苷酸多态性检测中的特异性。方法以人类基因组DNA为模板,采用3’末端配对及不配对的3’末端硫化修饰引物,进行不同保真度DN... 详细信息

目的探讨硫化修饰的碱基特异性引物与高保真DNA聚合酶所构成的对单核苷酸多态性敏感的分子开关系统在基因组单核苷酸多态性检测中的特异性。方法以人类基因组DNA为模板,采用3’末端配对及不配对的3’末端硫化修饰引物,进行不同保真度DNA聚合酶介导的引物延伸反应。结果Taq酶介导的碱基特异引物延伸反应扩增产物出现非特异性带,而单核苷酸多态性敏感分子开关介导的引物延伸反应未出现非特异性带。结论单核苷酸多态性敏感分子开关是一种特异性强,可靠性高的可用于基因组单核苷酸多态性分析的新方法,可在单碱基水平对遗传病相关基因进行特异性检测。

关键词：分子生物学单核苷酸多态性 DNA聚合酶特异性硫化修饰引物

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