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微生物学通报 2021年第5期48卷 1528-1537页

作者：邵钰晨马燕燕谷庆花鲍渴望孙晓宇陈晓雨李婷婷司鑫鑫江苏海洋大学药学院江苏连云港222005 江苏海洋大学江苏省海洋药物活性分子筛选重点实验室江苏连云港222005

【背景】限制性内切酶Mlu Ⅰ是一种常用的工具酶,在分子生物学领域发挥着重要的作用,其三维结构尚未被解析。【目的】在大肠杆菌中克隆表达、纯化重组Mlu Ⅰ蛋白及其硒代蛋白,并进行结晶条件的研究。【方法】构建重组表达载体pET28b-Mlu... 详细信息

【背景】限制性内切酶Mlu Ⅰ是一种常用的工具酶,在分子生物学领域发挥着重要的作用,其三维结构尚未被解析。【目的】在大肠杆菌中克隆表达、纯化重组Mlu Ⅰ蛋白及其硒代蛋白,并进行结晶条件的研究。【方法】构建重组表达载体pET28b-Mlu Ⅰ,在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达,利用亲和层析和凝胶过滤层析纯化重组Mlu Ⅰ蛋白和硒代Mlu Ⅰ蛋白。对蛋白进行质谱检测、圆二色谱检测以及酶活检测,利用坐滴法进行结晶条件的筛选。【结果】构建了重组表达载体pET28b-Mlu Ⅰ并纯化获得达到结晶纯度的蛋白,通过质谱检测确定硒代Mlu Ⅰ蛋白中的8个甲硫氨酸全部被取代,结合酶活测试及圆二色谱检测确定了硒代对Mlu Ⅰ蛋白的活性、结构无明显影响。采用坐滴法进行初步的晶体生长研究,重组蛋白目前已在1种条件下获得针状晶体并进行初步衍射,获得分辨率在0.32 nm左右的衍射数据。【结论】Mlu Ⅰ蛋白及硒代Mlu Ⅰ蛋白纯化体系的构建和结晶条件的研究,可为下一步解析Mlu Ⅰ三维结构、作用机制的探讨及定向改造奠定基础。

关键词：限制性内切酶 MluⅠ 硒代蛋白结晶

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雷可肽生物合成中LxmX的表达纯化与结晶

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基因组学与应用生物学 2021年第9期40卷 3027-3034页

作者：程焯王业民郑舰艇陶美凤上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室上海200030

雷可肽是一种对革兰氏阳性菌具有强抑制活性的第V类新型羊毛硫肽,其生物合成关键酶LxmX的蛋白晶体结构对雷可肽的生物合成机制解析至关重要。本研究构建了LxmX及其突变体LxmX’(S129/189M)的重组表达载体pPSUMO-lxmX和pPSUMO-lxmX’(S12... 详细信息

雷可肽是一种对革兰氏阳性菌具有强抑制活性的第V类新型羊毛硫肽,其生物合成关键酶LxmX的蛋白晶体结构对雷可肽的生物合成机制解析至关重要。本研究构建了LxmX及其突变体LxmX’(S129/189M)的重组表达载体pPSUMO-lxmX和pPSUMO-lxmX’(S129/189M),并优化了表达条件,最终以Escherichia coli BL21(DE3)/pGro7为宿主,在0.1 mmol/L IPTG 30℃条件下诱导表达。通过镍柱亲和层析、TEV酶切、superdex200柱层析纯化得到纯度较高的蛋白。利用坐滴法点晶,20℃培养,经过结晶条件初筛和优化,得到了符合衍射条件的晶体。研究结果为解析LxmX的结构和研究雷可肽生物合成机制奠定了基础。

关键词：羊毛硫肽 LxmX 蛋白纯化结晶硒代蛋白

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多功能SAM依赖性酶LepI和海栖热袍菌乙酰羟酸合酶的结构生物学研究

多功能SAM依赖性酶LepI和海栖热袍菌乙酰羟酸合酶的结构生物学研究

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作者：常敏北京化工大学

学位级别：硕士

酶是生命体必不可少的重要物质,为生物体内发生多种催化反应提供了重要保障。随着深入的探究,生物酶在生产生活中的应用越来越重要。周环反应在工业合成中应用广泛,但能够催化周环反应的酶很少,目前已报道了黄曲霉中有具有相似活性的酶... 详细信息

酶是生命体必不可少的重要物质,为生物体内发生多种催化反应提供了重要保障。随着深入的探究,生物酶在生产生活中的应用越来越重要。周环反应在工业合成中应用广泛,但能够催化周环反应的酶很少,目前已报道了黄曲霉中有具有相似活性的酶,对其进行探究将为工业生产提供重要价值。极端环境下嗜热菌的典型生物海栖热袍菌在合成生物学中的应用越来越广泛,而对于其乙酰羟酸合酶的研究将为支链氨基酸生产提供新的方向。本文开展了对两种重要酶的结构生物学研究,首先是黄曲霉生物合成leporinB途径中生成吡喃环的关键酶——多功能SAM依赖性酶LepI。我们通过构建重组质粒并且进行表达纯化,得到纯度高、均一性好的蛋白后进行结晶实验,在筛选了 768个池液条件后,发现有晶体生长。对相关的结晶条件进行优化,通过X-射线衍射收集有效的衍射数据。在没有同源结构的情况下,通过对硒代蛋白进行表达纯化和结晶实验,收集到硒代晶体的衍射数据后成功解析LepI的蛋白结构。随后通过结构分析,序列比对和分子对接实验提出了LepI的催化机理。本文研究的另一个酶是海栖热袍菌的乙酰羟酸合酶,乙酰羟酸合酶是生物合成支链氨基酸过程中的第一个限速酶,该酶由两个亚基组成:大亚基又名催化亚基、小亚基又名调节亚基,本研究主要对催化亚基部分构建了重组质粒,成功表达带不同标签的蛋白,根据相关的纯化结果,选择了带His标签的蛋白进行结晶实验,共筛选了 2544个池液条件。在完成初筛后,我们发现了一些结晶条件,并对衍射质量较好的两个晶体条件进行优化,目前获得的晶体衍射最佳分辨率达到3.8埃,后续优化仍在进行中。综上,本文解析了 LepI蛋白的结构,并提出了其详细工作机理的结构生物学基础,为其今后的工业应用提供了可能。乙酰羟酸合酶结晶条件的探究为其未来晶体结构解析提供了重要参考。

关键词：酶蛋白质结构 LepI 硒代蛋白乙酰羟酸合酶

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限制性内切酶DpnⅡ及其硒代衍生物的制备

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江苏海洋大学学报（自然科学版） 2021年第1期30卷 72-76页

作者：邵钰晨杨琪王鹏吴尚成王东晖司鑫鑫曹阳江苏海洋大学药学院江苏连云港222005 江苏海洋大学江苏省海洋药物活性分子筛选重点实验室江苏连云港222005

来源于肺炎双球菌Diplococcus pneumoniae的Ⅱ型限制性内切酶DpnⅡ是分子生物学领域中常用的一种工具酶,它在基因工程等领域发挥着重要作用,目前其三维结构尚未被解析。为了解析DpnⅡ的蛋白结构,进一步阐明DpnⅡ的分子机制,构建了pET28b... 详细信息

来源于肺炎双球菌Diplococcus pneumoniae的Ⅱ型限制性内切酶DpnⅡ是分子生物学领域中常用的一种工具酶,它在基因工程等领域发挥着重要作用,目前其三维结构尚未被解析。为了解析DpnⅡ的蛋白结构,进一步阐明DpnⅡ的分子机制,构建了pET28b-DpnⅡ重组表达载体,并采用大肠杆菌表达系统,利用BL21(DE3)pLysS菌株高效表达了DpnⅡ及其硒代衍生物,经Ni亲和层析、阴离子交换、凝胶过滤层析、肝素亲和层析等4步纯化获得了纯度在95%以上的重组蛋白和硒代蛋白,质量浓度均为10 mg/mL,产量分别为6.5 mg/L和5.5 mg/L。酶活研究发现,硒代蛋白和重组蛋白对底物pUC19质粒切割产生了大小一致的条带,表明硒代蛋白的活性未受到明显影响。

关键词：限制性内切酶 DpnⅡ 硒代蛋白表达纯化

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