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中华微生物学和免疫学杂志 2014年第9期34卷 657-661页

作者：吴素霞柴立辉杨菲李伟华谷敬丽马远方抗体药物河南省工程实验室、河南大学医学院细胞与分子免疫学实验室开封475004

目的：研究重组破骨细胞抑制凝集素相关蛋白2胞外段蛋白（OCILRP2-Fc）阻断OCILRP2受体信号对LPS诱导的内毒素血症的影响，探讨OCILRP2受体在机体炎症反应中的作用。方法荧光定量RT-PCR检测LPS刺激前后OCILRP2在RAW264．7细胞的表达；... 详细信息

目的：研究重组破骨细胞抑制凝集素相关蛋白2胞外段蛋白（OCILRP2-Fc）阻断OCILRP2受体信号对LPS诱导的内毒素血症的影响，探讨OCILRP2受体在机体炎症反应中的作用。方法荧光定量RT-PCR检测LPS刺激前后OCILRP2在RAW264．7细胞的表达；小鼠腹腔注射20mg/kg体重的LPS诱导内毒素血症的发生，分析OCILRP2-Fc对内毒素血症小鼠存活率的影响；称量小鼠脾脏重量分析脾脏充血肿大情况；HE染色观察肺脏、肝脏组织病理损伤情况；ELISA检测小鼠血清中炎症性细胞因子的水平；Westernblot检测LPS刺激前后巨噬细胞中NF-κB的活化。结果荧光定量RT-PCR结果表明LPS刺激显著提高了OCILRP2在小鼠巨噬细胞的表达（P＜0．05）；与对照组相比，OCILRP2-Fc可以显著提高内毒素血症小鼠的存活率；减轻小鼠脾脏肿大程度和内毒素血症对肺脏和肝脏组织造成的病理损伤；降低血清中细胞因子IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ的浓度（P＜0．05）。Westernblot结果表明OCILRP2-Fc抑制LPS诱导的RAW264．7细胞内IκB的降解和NF-κBp65的磷酸化。结论采用OCILRP2-Fc阻断OCILRP2受体信号，减轻了小鼠内毒素血症对机体造成的炎症性损伤，提示OCILRP2在LPS诱导的炎症反应发生过程中具有促进作用。

关键词：脂多糖内毒素血症破骨细胞抑制凝集素相关蛋白2 核因子-κB

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OCILRP2-Fc抑制小鼠骨髓来源的树突状细胞分化成熟

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中国免疫学杂志 2015年第7期31卷 917-921页

作者：柴立辉李伟华杨菲刘广超马远方吴素霞抗体药物河南省工程实验室河南大学医学院细胞与分子免疫学实验室开封475004

目的:采用OCILRP2胞外段蛋白OCILRP2-Fc阻断OCILRP2受体,探讨OCILRP2对小鼠树突状细胞发育成熟的影响及其机制。方法:分离培养小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDC),荧光定量RT-PCR和流式细胞术分析OCILRP2在不成熟BMDC和LPS诱导的成熟BMDC... 详细信息

目的:采用OCILRP2胞外段蛋白OCILRP2-Fc阻断OCILRP2受体,探讨OCILRP2对小鼠树突状细胞发育成熟的影响及其机制。方法:分离培养小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDC),荧光定量RT-PCR和流式细胞术分析OCILRP2在不成熟BMDC和LPS诱导的成熟BMDC的表达差异;流式细胞术分析OCILRP2-Fc对BMDC细胞表面标志分子的表达以及对BMDC抗原摄取能力的影响;ELISA检测培养上清中细胞因子的浓度,分析OCILRP2-Fc对BMDC分泌炎性细胞因子的影响;Western blot检测转录因子NF-κB的活化,分析OCILRP2-Fc影响BMDC分化成熟的分子机制。结果:荧光定量RT-PCR和流式细胞术结果均表明LPS可以显著上调OCILRP2在BMDC的表达(P2-Fc可以明显抑制MHCⅡ类分子及共刺激分子CD80在LPS诱导的成熟BMDC的表达;和成熟BMDC相比,OCILRP2-Fc组BMDC经LPS诱导24 h后仍然具有较强的抗原吞噬能力;而且,OCILRP2-Fc组BMDC培养上清中炎性细胞因子IL-6、IL-12、TNF-α的浓度明显低于对照组(P2-Fc抑制了LPS诱导的I-κB降解和NF-κB p65的磷酸化。结论:OCILRP2-Fc阻断OCILRP2受体信号,通过抑制LPS诱导的NF-κB活化影响小鼠BMDC分化成熟。提示OCILRP2受体在树突状细胞的分化成熟过程中具有促进作用。

关键词：破骨细胞抑制凝集素相关蛋白2 树突状细胞脂多糖核因子κB

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CHO细胞表达的重组OCILRP2蛋白的研制

CHO细胞表达的重组OCILRP2蛋白的研制

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作者：王战争河南大学

学位级别：硕士

背景 C型凝集素样受体如NKG2D和CD94/NKG2由于它们共刺激T细胞增殖和细胞因子分泌的能力而被认为是一种新的T细胞刺激分子。C型凝集素家族具有独特的糖基识别结构域（cysteine rich domain，CRD），这种糖基识别结构域被称为C型凝集... 详细信息

背景 C型凝集素样受体如NKG2D和CD94/NKG2由于它们共刺激T细胞增殖和细胞因子分泌的能力而被认为是一种新的T细胞刺激分子。C型凝集素家族具有独特的糖基识别结构域（cysteine rich domain，CRD），这种糖基识别结构域被称为C型凝集素样结构域。实验表明，C型凝集素样分子，包括NK细胞受体CD94/NKG2A和NKG2D，NKRP1家族成员和CD69,在先天和适应性免疫反应中扮演重要角色。通过与其配体相互结合，C型凝集素样受体能够在NK细胞和其他细胞中扮演多种角色。C型凝集素受体成员在免疫系统中发挥多种功能，病原体识别调节，NK细胞和T细胞的刺激，细胞运输和骨的形成。破骨细胞抑制凝集素相关蛋白（2osteoclast inhibitory lectinrelated protein2, OCILRP2）是破骨细胞抑制凝集素（OCIL）家族的成员之一,属于Ⅱ型跨膜糖蛋白,具有较小的胞内区和跨膜区, OCIL家族成员的胞外区均包含一个C型凝集素样的结构域。OCILRP2是一种新的C型凝集素。小鼠OCILrP2基因位于6号染色体的NK基因复合体内。OCIL家族包括OCIL（Clrb）、OCILrP1（Clrd）和OCILrP2（Clrg）3个基因,其胞外区具有很高的同源性（约80%）。 OCILRP2主要在免疫组织器官中表达,在小鼠脾脏和胸腺中高水平表达，在其他器官如大脑、心脏、肝脏、肾脏、睾丸、肺、胎盘和肌肉等均未检测到OCILRP2的表达;其中主要在B细胞和树突状细胞（DC）中呈高表达，在未活化的T细胞中几乎很少表达,但在T细胞被活化后其表达水平明显上升。初步研究表明, OCILRP2可作为T细胞的共刺激分子,在T细胞的活化过程中发挥一定作用，且OCILRP2是与其配体NKRP1f相互配合在T细胞的活化过程中发挥共刺激作用的。 T细胞活化能够快速诱导OCILRP2的产生，并在72小时内保持相当高的水平。OCILRP2的配体NKRP1f在树突状细胞显著表达。可溶性的OCILRP2-IgFc重组蛋白能够在体内和体外显著抑制特异性抗原刺激对T细胞的增殖，白介素2（IL-2）的产生;相反，抗原递呈细胞表达的NKRP1f通过与OCILRP2共刺激增强B7.1/CD28介导的T细胞的增值。但是有关OCILRP2在T细胞共刺激中的作用机制目前尚不清楚。目的探讨OCILRP2-IgFc融合蛋白在哺乳动物中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中的稳定分泌表达及其表达产物的纯化和鉴定，利用纯化鉴定后的OCILRP2-IgFc融合蛋白免疫宿主动物制备特异性的抗OCILRP2抗体。方法利用脂质体2000为转染媒介，将OCILRP2-IgFc重组质粒转染哺乳动物细胞CHO细胞，经G418抗性培养基加压筛选、克隆化培养、ELISA测定，获得稳定表达OCILRP2-IgFc融合蛋白的细胞克隆;稳定转染的CHO细胞在培养瓶中扩大培养，适时更换无血清无动物组织培养基，继续培养5-7天后收集培养上清，培养上清经低温高速离心和0.45微米滤膜过滤后上Protein A柱进行亲和层析纯化;利用BCA、SDS-PAGE、Western blot、ELISA、质谱分析等方法对纯化得到的融合蛋白浓度、纯度、分子量、抗原特异性进行测定和鉴定。使用流式细胞术及ELISA等检测方法对获得的重组蛋白OCILRP2的生物学活性进行分析。用纯化得到的OCILRP2-IgFc融合蛋白加弗氏完全佐剂（CFA）或不完全佐剂（IFA）乳化免疫雄性的新西兰白兔制备抗OCILRP2的抗血清，利用饱和硫酸铵（SAS）盐析和ProteinG亲和层析纯化获得特异性抗OCILRP2的多克隆抗体。结果建立稳定分泌表达OCILRP2-IgFc融合蛋白的CHO细胞系。利用Protein A亲和层析纯化获得OCILRP2-IgFc融合蛋白，SDS-PAGE可见两条蛋白主带，一条分子量为55kDa,另一条分子量为40kDa， Western blot可在同样位置检测到该两条蛋白与HRP标记的山羊抗人Ig/Fc抗体特异性结合，将上述两条蛋白条带进行质谱分析均含有OCILRP2和标签Fc的氨基酸序列，证实纯化得到的蛋白为OCILRP2-IgFc融合蛋白。制备的OCILRP2-IgFc融合蛋白能有效抑制T细胞增殖、IL-2的分泌、OCILRP2表达等。 ELISA、Western blot均证实制备的兔抗OCILRP2抗体与纯化得到的融合蛋白OCILRP2-IgFc的两个主条带发生特异性结合。结论在CHO细胞中成功地建立了稳定分泌表达OCILRP2-Ig Fc融合蛋白的

关键词：破骨细胞抑制凝集素相关蛋白2 融合蛋白亲和层析抗体

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OCILRP2-Fc抑制小鼠树突状细胞的发育成熟

OCILRP2-Fc抑制小鼠树突状细胞的发育成熟

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第九届全国免疫学学术大会

作者：李伟华柴立辉吴素霞杨菲刘广超马远方抗体药物河南省工程实验室河南大学医学院细胞与分子免疫学实验室

研究背景:树突状细胞(dendritic cells,DC)是体内唯一能够激活初始T淋巴细胞的抗原提呈细胞,在连接固有免疫和适应性免疫中起桥梁作用。DC的发育分化是一个十分复杂的过程,许多因素参与调控DC的发育分化过程。破骨细胞抑制凝集素相关蛋... 详细信息

研究背景:树突状细胞(dendritic cells,DC)是体内唯一能够激活初始T淋巴细胞的抗原提呈细胞,在连接固有免疫和适应性免疫中起桥梁作用。DC的发育分化是一个十分复杂的过程,许多因素参与调控DC的发育分化过程。破骨细胞抑制凝集素相关蛋白2(Osteoclast Inhibitory Lectin Related Protein 2,OCILRP2)是由217个氨基酸残基组成的Ⅱ型跨膜蛋白,选择性表达在淋巴组织、活化的淋巴细胞和DC,虽然OCILRP2高表达在DC,但有关OCILRP2在DC分化成熟中的作用目前还鲜有报道。目的:采用OCILRP2胞外段蛋白OCILRP2-Fc阻断OCILRP2受体,探讨OCILRP2对小鼠树突状细胞发育成熟的影响及其机制。方法:分离培养小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDC),荧光定量RT-PCR和流式细胞术检测LPS刺激前后OCILRP2在BMDC的表达差异;流式细胞术分析OCILRP2-Fc对BMDC细胞表面标志分子的表达以及对BMDC抗原摄取能力的影响;ELISA检测培养上清中细胞因子的浓度分析OCILRP2-Fc对BMDC分泌炎性细胞因子的影响;western blot检测LPS刺激前后巨噬细胞中NF-κB的活化分析OCILRP2-Fc影响BMDC成熟的分子机制。结果:荧光定量RT-PCR和流式细胞术结果均表明LPS可以上调OCILRP2在BMDC的表达(p2-Fc可以明显抑制MHC-II类分子及共刺激分子CD80在LPS诱导的成熟DC的表达;和成熟DC相比,OCILRP2-Fc组BMDC经LPS诱导24h后仍然具有较强的抗原吞噬能力;OCILRP2-Fc处理组BMDC培养上清中炎性细胞因子IL-6、IL-12、TNF-α的浓度明显低于对照组(p2-Fc抑制LPS诱导的BMDC中I-κB的降解和NF-κBp65的磷酸化。结论:OCILRP2-Fc阻断OCILRP2受体信号,通过抑制LPS诱导的NF-κB活化影响小鼠BMDC的分化成熟。提示OCILRP2受体在BMDC的分化成熟过程中具有促进作用。

关键词：破骨细胞抑制凝集素相关蛋白2 树突状细胞脂多糖核因子кB

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OCILRP2-Fc对小鼠内毒素血症的保护作用

OCILRP2-Fc对小鼠内毒素血症的保护作用

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第九届全国免疫学学术大会

作者：杨菲柴立辉吴素霞李伟华马远方抗体药物河南省工程实验室河南大学医学院细胞与分子免疫学实验室

研究背景:固有免疫系统识别病原菌的成分尤其是革兰阴性菌的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可以启动机体的炎症反应,严重时可发生败血症,导致感染性休克、多器官功能衰竭、弥漫性血管内凝血等。通过干扰LPS对效应细胞如树突状细胞(dend... 详细信息

研究背景:固有免疫系统识别病原菌的成分尤其是革兰阴性菌的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可以启动机体的炎症反应,严重时可发生败血症,导致感染性休克、多器官功能衰竭、弥漫性血管内凝血等。通过干扰LPS对效应细胞如树突状细胞(dendritic cells,DC)和巨噬细胞的激活,调节固有免疫细胞的活化和下调过度的炎症反应是目前败血症治疗中的一个重要方向。目的:研究OCILRP2-Fc阻断OCILRP2受体信号对LPS诱导的内毒素血症的影响,探讨OCILRP2受体在机体炎症反应中的作用。方法:荧光定量RT-PCR检测LPS刺激前后OCILRP2在RAW264.7巨噬细胞的表达;小鼠腹腔注射20mg/kg体重的LPS诱导内毒素血症的发生,分析OCILRP2-Fc对内毒素血症小鼠存活率的影响;HE染色观察肺脏、肝脏组织病理损伤情况;ELISA检测小鼠血清中炎症性细胞因子的水平;western blot检测LPS刺激前后巨噬细胞中NF-κB的活化。结果:荧光定量RT-PCR结果表明LPS刺激显著提高了OCILRP2在小鼠巨噬细胞的表达(p2-Fc可以显著提高内毒素血症小鼠的存活率;减轻小鼠脾脏肿大程度和内毒素血症对肺脏和肝脏组织造成的病理损伤;降低血清中细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12和TNFα的浓度(p2-Fc抑制了LPS诱导的巨噬细胞中I-κB的降解和NF-κB p65的磷酸化。结论:采用OCILRP2-Fc阻断OCILRP2受体信号,减轻了小鼠内毒素血症对机体造成的炎症性损伤,提示OCILRP2在LPS诱导的内毒素血症发生中具有促进作用。

关键词：脂多糖败血症破骨细胞抑制凝集素相关蛋白2 核因子-κB

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