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破伤风毒素c片段单克隆抗体的研制

细胞与分子免疫学杂志 2009年第2期25卷 161-163页

作者：单艳菊潘志明程宁宁张成全孙林焦新安扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室江苏扬州225009

目的:研制抗破伤风毒素c片段(Tetc)的单克隆抗体(mAb)。方法:以纯化蛋白His-Tetc免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,末次加强免疫后取其脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0-Ag-14融合,应用间接ELISA筛选阳性克隆。Westernblot鉴定mAb的特异性,并用mAb亚类... 详细信息

目的:研制抗破伤风毒素c片段(Tetc)的单克隆抗体(mAb)。方法:以纯化蛋白His-Tetc免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,末次加强免疫后取其脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0-Ag-14融合,应用间接ELISA筛选阳性克隆。Westernblot鉴定mAb的特异性,并用mAb亚类试剂盒鉴定mAb亚类。结果:共获得5株稳定分泌抗Tetc的杂交瘤细胞株,分别命名为1E5、5G10、6B9、7D6、7F5,其腹水效价除1E5为3×210外,其余均为1×105,亚类鉴定结果均为IgG1。West-ernblot分析结果显示,5株mAb均与融合蛋白His-Tetc发生特异性反应。结论:成功制备了抗Tetc的mAb,为进一步研究Tetc的生物学功能、破伤风毒素结构与功能的关系以及建立快速检测破伤风抗毒素水平的方法奠定了基础。

关键词：破伤风毒素c片段单克隆抗体研制

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破伤风毒素c片段在乳链菌内的表达

广东医学 2011年第13期32卷 1644-1647页

作者：杨晓强赵亚刚孙大勇姜泊陈学清中国人民解放军75600部队医院综合科广州军区广州总医院消化内科南方医科大学南方医院消化内科广州医学院第一附属医院消化内科

目的构建破伤风毒素c片段(TETc)乳链菌表达载体,并验证其生物活性。方法将采用基因拼接方法获得的TETc基因从测序正确的质粒pBS-TETc上以SalⅠ、HindⅢ切下,分别定向连接到以XhoⅠ、HindⅢ酶切的质粒分泌表达的乳链菌表达载体pNBc1000... 详细信息

目的构建破伤风毒素c片段(TETc)乳链菌表达载体,并验证其生物活性。方法将采用基因拼接方法获得的TETc基因从测序正确的质粒pBS-TETc上以SalⅠ、HindⅢ切下,分别定向连接到以XhoⅠ、HindⅢ酶切的质粒分泌表达的乳链菌表达载体pNBc1000和膜锚定表达的乳链菌表达载体pNBc2000。电穿孔转化乳链菌,分别提取分泌蛋白及膜锚定蛋白,通过蛋白电泳及Western blot检测蛋白定位表达情况。结果构建了分泌表达及锚定表达TETc的乳链菌表达载体pNBcL1002与pNBcL2002,电穿孔转化乳链菌获得了分泌表达及膜锚定表达TETc的乳链菌,SDS-PAGE分析显示分泌表达的TETc大小约为57.8 kD,表达量占总体蛋白的8.06%、上清蛋白的9.82%,锚定表达的TETc大小约为73.5 kD的表达蛋白,表达量占总体蛋白的10.7%、膜蛋白的17.9%;Western blot检测显示所表达的TETc均可与破伤风抗毒素血清发生免疫印迹。结论成功构建了TETc乳链菌表达载体并在乳链菌内表达TETc,初步验证了表达的TETc的免疫反应性,这一结果可能为进一步研究生物佐剂及防治破伤风疫苗奠定基础。

关键词：破伤风毒素c片段乳链菌生物佐剂疫苗

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破伤风毒素c片段神经特异性载体的研究进展

中华神经医学杂志 2011年第1期10卷 94-96页

作者：王传伟宁丽萍刘王光山东大学齐鲁医院神经外科济南250012 山东大学齐鲁医院康复科济南250012

目前,针对许多中枢神经系统疾病的传统疗法的效果不甚令人满意,这些难治性疾病包括帕金森病等神经退行性疾病、颅脑损伤、脑卒中后遗症及中枢神经系统恶性肿瘤等.

关键词：破伤风毒素c片段药物释放系统基因疗法神经元靶向

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破伤风毒素c片段单克隆抗体的研制与鉴定

破伤风毒素C片段单克隆抗体的研制与鉴定

作者：单艳菊扬州大学

学位级别：硕士

破伤风毒素是由破伤风梭菌在厌氧环境中产生的强烈的神经毒素,是已知最毒的毒素之一。根据破伤风毒素在体内的作用,将其分为A、B、c三个部分。破伤风毒素c片段(Tetc)不具备神经毒性,却保留了完整毒素与神经节苷脂结合等许多性质,免疫效... 详细信息

破伤风毒素是由破伤风梭菌在厌氧环境中产生的强烈的神经毒素,是已知最毒的毒素之一。根据破伤风毒素在体内的作用,将其分为A、B、c三个部分。破伤风毒素c片段(Tetc)不具备神经毒性,却保留了完整毒素与神经节苷脂结合等许多性质,免疫效果与毒素相当,是毒素的保护性抗原,用Tetc蛋白诱导产生的单克隆抗体(McAb)具有中和毒素的能力。Tetc与神经元表面的结合是破伤风毒素其它片段发挥毒性作用的先决条件。本研究构建了原核表达Tetc蛋白的重组大肠杆菌,获得具有抗原活性的融合蛋白,并制备了特异性针对Tetc的McAbs,这为研究Tetc的生物学功能、破伤风毒素结构与功能的关系提供重要条件,同时也为建立快速检测破伤风抗毒素水平的方法提供了生物材料。一、破伤风毒素c片段基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达根据破伤风梭菌64008菌株基因组DNA序列设计引物扩增Tetc基因,并将其定向克隆至原核表达载体pGEX-6p-1,构建出重组菌BL21(pGEX-6p-1-Tetc),经IPTG(1mM终浓度)诱导表达,利用Redipack GST purification module进行亲和层析获得纯化的表达产物。SDS-PAGE结果表明表达的融合蛋白GST-Tetc大小与预期一致。Western-blot检测结果显示融合蛋白GST-Tetc可以与破伤风类毒素抗血清发生特异性结合反应,说明其具有良好的免疫原性。二、破伤风毒素c片段单克隆抗体的制备及鉴定应用淋巴细胞杂交瘤技术,以重组菌Rosetta(DE3)(pET-Tetc)表达产物His-Tetc蛋白免疫8w雌性BALB/c小鼠,100μg/只。首免时,抗原与等量弗氏完全佐剂(FcA)乳化,皮下分点注射。间隔2w,用弗氏不完全佐剂(FIA)乳化抗原,腹腔注射进行第二次免疫。此后每隔2w用弗氏不完全佐剂乳化抗原腹腔注射一次,直至ELISA检测血清抗体效价达到1:10000以上,尾静脉注射等量的不加佐剂的抗原作为加强免疫。3d后,取免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤Sp2/0-Ag-14细胞进行融合。以纯化蛋白GST-Tetc作为检测抗原,用间接ELISA方法筛选阳性克隆,获得5株稳定分泌Tetc单克隆抗体的细胞株,分别命名为1E5、5G10、6B9、7D6、7F5,亚类鉴定结果都为IgG,腹水测定效价除1E5为3×2外,其余均为1×10。Western-blot试验显示5株McAbs均能与融合蛋白His-Tetc发生反应,出现特异性条带,而与作为对照的空载体细菌Rosetta(DE3)(pET)和BL21(6p-1)不发生反应,说明1E5、5G10、6B9、7D6、7F5这5株McAbs是特异性针对Tetc表位的单抗。

关键词：破伤风毒素c片段单克隆抗体研制鉴定

破伤风毒素c片段基因的克隆、表达及其产物的免疫生物学特性

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破伤风毒素C片段基因的克隆、表达及其产物的免疫生物学特性

作者：刘婷扬州大学

学位级别：硕士

破伤风是由破伤风毒素引起的一种严重的痉挛性疾病,有效的预防方法是接种破伤风类毒素疫苗。传统的类毒素疫苗是破伤风毒素经甲醛脱毒、精制而成的,现仍存在一些问题:接种类毒素后有一定的副反应发生;破伤风梭菌可形成芽孢形式,毒性高,... 详细信息

破伤风是由破伤风毒素引起的一种严重的痉挛性疾病,有效的预防方法是接种破伤风类毒素疫苗。传统的类毒素疫苗是破伤风毒素经甲醛脱毒、精制而成的,现仍存在一些问题:接种类毒素后有一定的副反应发生;破伤风梭菌可形成芽孢形式,毒性高,生产疫苗有一定危险性;甲醛处理类毒素容易造成污染;化学处理后的类毒素可能发生毒性逆转。因此,现有的类毒素疫苗还需进一步改进和发展,开发新型的基因工程疫苗是方向之一。本研究以破伤风毒素c片段基因为基础,用大肠杆菌表达系统得到了高效表达的融合蛋白,之后又用沙门氏菌表达系统构建了运送破伤风毒素c片段的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌菌株,为研制新型的破伤风疫苗奠定了基础。 1.破伤风毒素c片段基因的克隆及在大肠杆菌中的表达本研究对破伤风毒素c片段进行基因克隆、重组表达、蛋白纯化和免疫原性分析。应用PcR技术直接从破伤风梭菌64008菌株中扩增出大小为1356bp的破伤风毒素c片段基因,该片段是与靶细胞起结合作用的重链c端基因,经DNA序列测定分析,扩增出的基因与GenBank上登陆的序列AF154828的同源性达到99.2%。将此基因克隆入大肠杆菌融合表达载体pET-30a(+),构建成重组表达质粒pET-Tetc,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达,经SDS-PAGE蛋白电泳鉴定,表达产物为50kD左右的特异性重组蛋白,重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的33.5%,

关键词：破伤风毒素c片段大肠杆菌鼠伤寒沙门氏菌表达免疫原性

重组破伤风毒素c片段的原核表达、纯化及其活性

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中国生物制品学杂志 2010年第3期23卷 270-273,285页

作者：付作申花艳红金贞姬伊纯德苏彩霞陈尔佳刘勇邵一鸣大连汉信生物制药有限公司辽宁大连116600 中国疾病预防控制中心北京100050

目的原核表达、纯化重组破伤风毒素c片段(rTTc),并进行活性鉴定。方法采用PcR法从破伤风梭菌基因组DNA中扩增TTc基因片段,将其插入载体pThioHisA中,构建重组表达质粒rTTc-pThioHisA,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。表达的rTTc蛋白经离... 详细信息

目的原核表达、纯化重组破伤风毒素c片段(rTTc),并进行活性鉴定。方法采用PcR法从破伤风梭菌基因组DNA中扩增TTc基因片段,将其插入载体pThioHisA中,构建重组表达质粒rTTc-pThioHisA,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。表达的rTTc蛋白经离子交换、凝胶层析两步纯化后,采用Western blot、免疫双扩散及动物免疫试验进行活性及免疫原性鉴定。结果重组表达质粒经双酶切鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白以包涵体和可溶性形式存在;纯化的重组蛋白纯度大于95%,能与全段破伤风毒素(TT)抗体反应,rTTc抗体能与全段TT反应。rTTc能较好地诱导家兔产生免疫反应,但诱导小鼠产生的免疫反应较弱。结论已原核表达并纯化了rTTc,其有望开发为一种新型抗破伤风芽孢梭菌疫苗及细菌多糖类结合疫苗的蛋白载体。

关键词：破伤风毒素c片段原核表达纯化活性

破伤风毒素c片段基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

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破伤风毒素C片段基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

破伤风毒素c片段基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

第六届全国会员代表大学暨第11次学术研讨会

作者：刘婷焦新安潘志明黄金林扬州大学生物科学与技术学院人兽共患病与免疫学研究室

本研究对破伤风毒素c片段进行基因克隆、重组表达、蛋白纯化和免疫原性分析。应用PcR技术直接从破伤风梭菌64008菌株中扩增出大小为1356bp的破伤风毒素c片段基因,该片段是与靶细胞起结合作用的重链c端基因,经DNA序列测定分析,扩增出的... 详细信息

本研究对破伤风毒素c片段进行基因克隆、重组表达、蛋白纯化和免疫原性分析。应用PcR技术直接从破伤风梭菌64008菌株中扩增出大小为1356bp的破伤风毒素c片段基因,该片段是与靶细胞起结合作用的重链c端基因,经DNA序列测定分析,扩增出的基因与GenBank上登陆的序列AF154828的同源性达到99.2%。将此基因克隆入大肠杆菌融合表达载体pET-30a(+),构建成重组表达质粒pET-Tetc,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达,经SDS-PAGE蛋白电泳鉴定,表达产物为50kD左右的特异性重组蛋白,重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的33.5%,经免疫印迹试验证实该重组蛋白是破伤风毒素c片段抗原。动物试验证明此重组抗原具有良好的免疫原性,能保护动物免受破伤风毒素的攻击。

关键词：破伤风毒素c片段大肠杆菌克隆表达

来源： cnki会议评论

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破伤风毒素C片段基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第六届全国会员代表大会...

作者：刘婷焦新安潘志明黄金林扬州大学生物科学与技术学院人兽共患病与免疫学研究室

关键词：破伤风毒素c片段大肠杆菌克隆表达

来源： cnki会议评论

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破伤风毒素c片段单克隆抗体的研制

破伤风毒素C片段单克隆抗体的研制