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聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料与小鼠前成骨细胞的成骨分化

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中国组织工程研究 2022年第16期26卷 2498-2503页

作者：张红梅孙溪饶王程越锦州医科大学附属第二医院辽宁省锦州市121000 赤峰学院附属医院内蒙古自治区赤峰市024000

背景:课题组前期通过冷冻干燥方法制备的矿化胶原/Mg-Ca合金复合体结构松散,使用聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥作为外层加强层对其进行改良可增强复合材料的结构稳定性。目的:探讨聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料对MC3T3-E1细胞... 详细信息

背景:课题组前期通过冷冻干燥方法制备的矿化胶原/Mg-Ca合金复合体结构松散,使用聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥作为外层加强层对其进行改良可增强复合材料的结构稳定性。目的:探讨聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。方法:分别制备聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金、聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原复合材料。将MC3T3-E1细胞分别接种于聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金(A组)、聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原复合材料(B组)及Mg-Ca合金材料(C组)上,以单独培养的细胞为空白对照(D组),扫描电镜下观察材料表面的细胞黏附形态,通过CCK-8、碱性磷酸酶活性、酶联免疫吸附实验、RT-PCR与Western blot检测分析3种材料对MC3T3-E1细胞增殖及成骨分化的影响。结果与结论:(1)扫描电镜下可见,MC3T3-E1细胞在A组复合材料表面黏附数量最多,生长状态良好,细胞拉伸明显,伪足伸出较多,细胞相互连接成网状结构;(2)CCK-8实验显示,与D组相比,3种材料均可促进MC3T3-E1细胞的增殖(P胶原,其中以A组促进作用最显著(P矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料可促进MC3T3-E1细胞成骨分化相关蛋白与基因的表达,对其成骨分化起积极作用。

关键词：聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥矿化胶原成骨分化镁钙合金小鼠前成骨细胞转录因子骨钙素碱性磷酸酶

壳聚糖/矿化胶原多孔支架构建及体外成骨分化与生物相容性

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中国组织工程研究 2022年第34期26卷 5498-5503页

作者：孙溪饶包佳昕王程越锦州医科大学附属第二医院辽宁省锦州市121000

背景:壳聚糖材料具有良好的生物相容性、生物可降解性和低免疫原性,但其活性较差;矿化胶原材料具有良好的生物相容性,但机械性能不足,将两者结合可能会表现出更好的机械性能及成骨活性。目的:构建不同配比的壳聚糖/矿化胶原多孔支架,表... 详细信息

背景:壳聚糖材料具有良好的生物相容性、生物可降解性和低免疫原性,但其活性较差;矿化胶原材料具有良好的生物相容性,但机械性能不足,将两者结合可能会表现出更好的机械性能及成骨活性。目的:构建不同配比的壳聚糖/矿化胶原多孔支架,表征其表面特征与生物相容性。方法:采用冷冻干燥法制备单纯的壳聚糖支架与壳聚糖矿化胶原质量比分别为2∶1、1∶1的壳聚糖/矿化胶原多孔支架,通过扫描电镜、能量色散谱仪、X射线衍射仪、傅里叶红外光谱表征3组支架的表面形貌、元素组成及物相结构。将小鼠成骨前体细胞直接接种于3组支架表面,扫描电镜观察细胞黏附情况。将空白对照及3组材料浸提液分别与小鼠成骨前体细胞共培养,通过CCK-8实验、鬼笔环肽染色及碱性磷酸酶活性分析各组材料对小鼠成骨前体细胞增殖与分化的影响。结果与结论:(1)扫描电镜下可见,单纯壳聚糖多孔支架界面存在明显间隙,壳聚糖/矿化胶原多孔支架界面键合紧密,同时随着支架中壳聚糖含量的减少,矿化胶原颗粒在支架中产生的团聚现象更加明显;能量色散谱仪检测结果显示,单纯壳聚糖支架表面的元素主要为碳、氮、氧,加入矿化胶原后支架材料表面的钙、磷元素逐渐增多;X射线衍射图谱和傅里叶红外光谱显示壳聚糖与矿化胶原为物理性结合;(2)扫描电镜下可见细胞在3组支架材料表面正常黏附和铺展,其中黏附于单纯壳聚糖支架表面的细胞数量较少;(3)CCK-8实验显示,与单纯壳聚糖多孔支架浸提液相比,两种配比的壳聚糖/矿化胶原多孔支架浸提液可促进小鼠成骨前体细胞的增殖;细胞骨架染色显示,两种配比的壳聚糖/矿化胶原多孔支架浸提液组细胞密度较高,细胞丝足相互连接,微丝肌动蛋白表达更清晰;(4)碱性磷酸酶活性检测显示,与单纯壳聚糖多孔支架浸提液相比,两种配比的壳聚糖/矿化胶原多孔支架浸提液可促进小鼠成骨前体细胞的成骨分化;(5)结果表明,壳聚糖/矿化胶原多孔支架可有效促进小鼠成骨前体细胞的增殖与分化。

关键词：壳聚糖矿化胶原小鼠成骨前体细胞多孔支架成骨分化生物相容性

3D打印掺锶矿化胶原复合聚乳酸骨修复支架的制备及性能研究

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3D打印掺锶矿化胶原复合聚乳酸骨修复支架的制备及性能研究

作者：孙玮玮北京印刷学院

学位级别：硕士

骨组织工程修复材料须具有良好的生物相容性,适当的物理机械性能提供支撑,适当的孔隙率孔径以供物质交换和细胞粘附生长,可降解性及促骨愈合效果等优良性能。单一的材料很难满足骨修复材料的所有要求,而复合材料常常可以通过各组分材料... 详细信息

骨组织工程修复材料须具有良好的生物相容性,适当的物理机械性能提供支撑,适当的孔隙率孔径以供物质交换和细胞粘附生长,可降解性及促骨愈合效果等优良性能。单一的材料很难满足骨修复材料的所有要求,而复合材料常常可以通过各组分材料优势的互补从而提高其综合性能。本文使用左旋聚乳酸(Poly(Llactic acid),PLLA)和仿生制备的矿化胶原(Mineralized collagen,MC)材料进行复合,首先通过静电吸附法制备了聚乳酸/矿化胶原复合膜,对其理化性能及细胞相容性进行研究。低剂量的锶可以促进成骨细胞的增殖分化,通过减弱破骨细胞的生成减少细胞骨吸收,以及刺激血管生成等作用,具有良好的骨缺损修复效果。本文通过体外仿生的方式制备了掺锶的矿化胶原,为了满足骨修复材料的更高要求,结合3D打印制造技术具有的纤维排列规则、准确,制备出的支架孔隙率孔径大小可控且孔隙互通的优势,将两种材料共混打印出骨修复支架材料。随后对材料的理化性能和细胞相容性进行研究。(1)对于膜材料进行了FTIR表征和SEM表面形貌观察,结果显示I型胶原蛋白均匀地吸附到了PLLA膜上,且吸附时间越长,胶原蛋白在PLLA膜上的分布就越均匀。测量材料的接触角发现复合后的膜材料亲水性得到极大的改善,而后对复合膜进行了生物相容性和安全性研究。CCK-8细胞毒性评价结果显示复合膜可被认为无细胞毒性。通过BCA蛋白浓度检测,复合膜对细胞增殖有明显的促进作用,碱性细胞蛋白酶染色观察也验证了这一结论。(2)对于支架材料,通过XRD表征、EDS元素分析以及矿化胶原粉末的表面形貌观察,材料具备与人体骨相似的无机相及纳米结构;热分析显示复合材料适用于本文所使用的3D打印方式。SEM显示支架的孔径在400μm～500μm范围内,与模型设计一致,纤维均匀,基本无坍塌且经过横截面观察,共混材料均一性良好,支架的所有孔隙连通,具有很高的具有连续且稳定的三维网状结构,有利于物质交换和废物外排,有利于细胞的粘附、生长。力学性能测试结果表明复合支架抗压性能合适,可以在骨修复过程中提供良好的支撑性能,不产生应力遮挡。复合支架无细胞毒性且具有良好的生物相容性。通过对RAW264.7细胞进行诱导分化共培养,结果表明掺锶的复合材料支架对破骨细胞的生成及活性具有一定抑制作用,综合其性能说明本文制备出的Sr MC/PLA复合支架在骨组织工程修复材料中具有良好的应用价值。

关键词： 3D打印聚乳酸矿化胶原锶细胞相容性

载Icariin的海藻酸盐/矿化胶原体系联合3D打印支架修复大节段骨缺损的研究

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载Icariin的海藻酸盐/矿化胶原体系联合3D打印支架修复大节段骨缺...

作者：李少荣吉林大学

学位级别：硕士

研究背景:随着现代社会的发展,骨缺损的发生率逐渐增加。虽然骨组织具有一定的自我修复功能,但当骨缺损的尺寸较大时,骨缺损将无法自我修复。造成大节段骨缺损的原因多种多样,治疗方法复杂,这对骨科医生来说是一个挑战和难题。随着骨组... 详细信息

研究背景:随着现代社会的发展,骨缺损的发生率逐渐增加。虽然骨组织具有一定的自我修复功能,但当骨缺损的尺寸较大时,骨缺损将无法自我修复。造成大节段骨缺损的原因多种多样,治疗方法复杂,这对骨科医生来说是一个挑战和难题。随着骨组织工程(bone tissue engineering,BTE)的发展,多种生物材料在治疗骨缺损的方面有良好的表现。其中矿化胶原就是一种良好的生物仿生材料。矿化胶原是通过模拟骨组织中的成分制备的仿生材料,具有良好的生物相容性。但是其降解速率较快,不具备良好的药物释放能力,因此不适合作为药物载体。研究表明海藻酸盐可以提高矿化胶原的矿化效率,优化矿化胶原的降解和药物释放性能。此外,具有良好促进成骨活性的药物也是BTE中治疗大节段骨缺损的重要一环。近些年来中医中药在BTE中得到了广泛的深入研究。许多中药包含多种生物活性成分,能够发挥多种生物学作用。淫羊藿苷(icariin,ICA)作为多年用于骨科疾病的中药之一,具有促进成骨分化,抑制破骨细胞相关基因表达,促进血管生成的功能,对骨缺损的修复有明显的效果。因此,开发一种缓释ICA的改良矿化胶原支架治疗大节段骨缺损可能是一种有效的治疗方法。研究目的:ICA是从中草药淫羊藿中分离得到的一种黄酮苷,具有促进成骨和血管生成的作用。既往研究表明ICA通过诱导BMP-2的表达和NO的产生促进体外成骨细胞的形成和血管生成,并且ICA能通过增加OPG/RANKL来减少破骨细胞的形成进而减少骨吸收,治疗骨质疏松。但是由于药物的半衰期和全身给药方式,ICA在骨缺损局部中不能持续维持在适当浓度,降低了其治疗效果。近些年来BTE的快速发展为骨缺损的局部药物治疗提供了便利。因此,本研究使用具有良好生物相容性的海藻酸盐/矿化胶原凝胶作为ICA的负载体系,并且通过联合钛金属多孔支架为骨缺损部位提供机械支撑。本研究目的为验证钛金属多孔支架联合海藻酸盐/矿化胶原/ICA凝胶(alginate/mineralized collagen/ICA/porous Ti,AMCI/PTi)在体外的相容性、生物活性和该体系对于大节段骨缺损的治疗作用。研究方法:1.在室温下将合适浓度的ICA与矿化胶原溶液相混合后加入海藻酸盐获得载药水凝胶;并将载药水凝胶填充于3D打印微孔钛合金支架的微孔隙中,获得AMCI/PTi支架。通过扫描电镜观察材料的支架的微孔结构特征,并且通过药物释放实验和降解实验研究AMCI/PTi支架的药物释放和凝胶降解性能。2.通过在体外环境与骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)共培养后进行细胞增殖实验和活死细胞染色验证AMCI/PTi支架的生物相容性;通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色,实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain,RT-q PCR)验证AMCI/PTi支架对BMSCs成骨分化以及成骨相关基因表达的影响;通过小管形成实验,划痕实验和RT-q PCR实验验证AMCI/PTi支架对于人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的血管生成能力的影响。3.通过体内研究验证AMCI/PTi支架的骨再生效果。我们通过桡骨截骨术建立兔桡骨大节段骨缺损模型后随机分为三组:单纯微孔钛金属支架组(Ti)和填充空白水凝胶的微孔钛合金支架组(AMC/PTi)和载有ICA的水凝胶填充的微孔钛合金支架组(AMCI/PTi)。将各组支架植入兔桡骨缺损中,通过Micro-CT,X-ray,组织学染色分析以及免疫组化分析研究该复合体系在体内环境下的骨再生效果。研究结果:1.通过上述方法成功制备了AMCI/PTi复合体系支架,随后扫描电镜结果显示3D打印微孔钛合金支架的孔径约为600μm,孔隙率70%,并且复合支架具有良好的规则均匀的多孔结构。药物释放实验结果表明AMCI/PTi支架可在4周内持续释放ICA,能够在局部维持合适的药物浓度。凝胶降解实验结果表明AMC凝胶在体内降解周期为50天左右,符合骨组织再生的时间。2.在细胞增殖实验和活死染色实验中,各组均显示了良好的生物相容性,并且AMCI/PTi支架能够明显的促进BMSCs的增殖。在成骨实验中,AMC/PTi支架组和AMCI/PTi支架组都明显地促进了BMSCs的成骨分化,上调成骨相关基因的表达,但是AMCI/PTi支架组有最佳的效果。通过血管生成的相关实验表明,AMCI/PTi支架组能够促进内皮细胞的迁移,促进血管生成和上调血管生成相关基因的表达。3.在体内实验中,我们成功地建立了兔桡骨大节段骨缺损模型,在各组术后12周的X-ray,Micro-CT检测以及组织学染色结果显示,相比较于Ti支架组,AMC/PTi支架组和AMCI/PTi支架

关键词：海藻酸盐大节段骨缺损淫羊藿苷矿化胶原

3D打印双交联丝素/海藻酸钠/矿化胶原骨修复材料的构建及性能研究

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3D打印双交联丝素/海藻酸钠/矿化胶原骨修复材料的构建及性能研究

作者：甘芳巾太原理工大学

学位级别：硕士

骨骼是人类的组织器官之一,对肢体运动提到支撑等作用,但是因为交通事故、人口老龄化以及骨坏死之类的各种因素导致的骨缺损的数量在逐年增加,也因此使得人类对骨修复材料的要求也在日益提高,而对骨组织再生的研究也一直以来都是临床医... 详细信息

骨骼是人类的组织器官之一,对肢体运动提到支撑等作用,但是因为交通事故、人口老龄化以及骨坏死之类的各种因素导致的骨缺损的数量在逐年增加,也因此使得人类对骨修复材料的要求也在日益提高,而对骨组织再生的研究也一直以来都是临床医学领域的重点和难题,同时也是科学研究的热点问题所在。传统的骨修复支架需要提前塑形再通过手术移植到缺损部位,而3D打印能够根据患者骨缺损部位进行个性化定制,制备出同患者骨缺损尺寸相吻合的骨修复支架,同时可以设计多级孔结构,逐渐成为骨修复材料的研究热点。丝素蛋白(Silk fibrion,SF)是人类最早开始利用的天然蛋白质之一,来源广泛,并具有较好的生物相容性、机械性能和较低的免疫原性,被人们广泛地运用于组织工程中。但是,其作为骨修复材料存在着明显的不足,如机械性能不足、不具有光交联的位点等。因此对SF的缺点进行改善的研究具有重要的意义。本文为了增加SF的光交联位点,对其进行改性研究,并探究与海藻酸钠(Sodium alginate,SA)复合制备双交联体系;同时为提高支架的成骨活性和力学性能,本研究复合矿化胶原(Mineralized collagen,n HAP)、纳米丝素纤维(Nano silk fibroin fiber,SFF)制备3D打印支架,并对其性能进行研究。论文具体研究内容如下:(1)本研究将天然的蚕丝通过无水碳酸钠(NaCO)进行脱胶处理后得到SF,然后使用溴化锂(Li Br)对其溶解制备成SF溶液,加入甲基丙烯酸缩水甘油酯对其进行改性,通过透析除盐,最后冷冻干燥制备出丝素/甲基丙烯酸缩水甘油酯(Silk fibrion-Glycidyl Methacrylate,Silk-GMA)。为了检测丝素改性是否成功,采用扫描电子显微镜(SEM)、傅里叶变换红外光谱分析(FTIR),核磁共振氢谱(H-NMR)对材料进行表征。实验结果表明:制备的Silk-GMA具有光交联的基团,并可以紫外光交联固化。(2)研究了不同比例Silk-GMA对3D打印支架的影响。通过改变Silk-GMA的比例来探究对支架性能的影响。通过SEM、力学、降解、溶胀,细胞实验等对其孔结构、理化及生物学性能进行研究。研究结果表明:随着Silk-GMA的比例的增加,复合材料的弹性模量性能随之增强,含有1 wt%Silk-GMA的压缩弹性模量为0.183±0.052 MPa,2 wt%Silk-GMA的压缩弹性模量为0.201±0.004 MPa,3 wt%Silk-GMA的压缩弹性模量为0.217±0.018 MPa,4 wt%Silk-GMA的比例的弹性模量为0.260±0.072 MPa。其降解率也随着降低,在28 d时4 wt%Silk-GMA的复合材料的降解率比1 wt%Silk-GMA降低了17%。并且随着Silk-GMA的含量的增多,所测得的Pr值也随之增高,打印的孔径约接近于方形,材料的融合率随之降低,可打印性提高;复合材料的溶胀率也随之降低;并且随着Silk-GMA的浓度增加,其细胞的活性有所增加,并随着培养天数的增长细胞活性随之增强,说明Silk-GMA能够促进细胞增殖。(3)为了改善双交联生物墨水的成骨性能、力学性能等,通过自组装和体外仿生矿化的原理分别制备了SFF、n HAP材料并将其复合制备成SF-GMA/SA,SF-GMA/SA/SFF,SF-GMA/SA/n HAP一系列具有双交联网络生物墨水用于3D打印支架。研究使用SEM、力学测试等对其进行表征。结果表明:复合SFF材料后进行打印发现其可打印性在一定程度上提高,打印的孔径更完整,并在一定范围内改善了其复合材料的机械性能、降解速率,其中添加了SFF材料的机械性能提高最明显,其4 wt%的压缩弹性模量为0.370±0.009 MPa,1 wt%的压缩弹性模量为0.225±0.025 MPa,比4wt%SF-GMA/SA提高了0.110 MPa,并且具有显著性差异。而复合了n HAP的材料组明显的降低了材料的降解速率,相比SF-GMA/SA组支架的降解率降低了4%～11%,且均具有显著性差异。细胞实验表明,这三种生物墨水制备的支架具有良好的细胞相容性,其中复合n HAP的材料组的细胞增长情况最好,具有显著性差异。综上所述,本论文构建了SF-GMA/SA双交联水凝胶网络,并将其与SFF、n HAP材料复合制备3D打印骨修复支架,并进行性能研究。本论文的研究可作为SF-GMA/SA双交联网络水凝胶在骨科临床上的应用提供一定的理论和实验的依据。

关键词： 3D打印骨修复双交联改性丝素矿化胶原海藻酸钠纳米丝素纤维

基于生物信息学分析矿化胶原材料促进骨髓间充质干细胞软骨分化中LGR5和S100A4的表达及意义

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基于生物信息学分析矿化胶原材料促进骨髓间充质干细胞软骨分化中...

作者：刘克达中国医科大学

学位级别：硕士

目的:骨关节炎是一种慢性、退行性关节疾病。关节软骨形成的复杂机制受一系列基因表达调控。高通量测序技术推动了基础研究的发展。有效利用多个数据集来分析差异表达基因有助于疾病诊断和分子机制研究。组织工程仿生支架技术为组织修... 详细信息

目的:骨关节炎是一种慢性、退行性关节疾病。关节软骨形成的复杂机制受一系列基因表达调控。高通量测序技术推动了基础研究的发展。有效利用多个数据集来分析差异表达基因有助于疾病诊断和分子机制研究。组织工程仿生支架技术为组织修复和再生提供了多种可能性。矿化胶原是一种良好的骨移植材料,有利于干细胞的粘附、生长和分化。本研究利用生物信息学技术探讨,矿化胶原作为移植材料,促进骨髓间充质干细胞软骨分化的相关分子生物学机制,为应用矿化胶原材料治疗骨关节炎提供理论及实验依据。研究方法:从GEO基因数据库下载GSE9451和GSE104113基因表达谱芯片数据集,使用R语言筛选差异表达基因,并对其进行GO和KEGG富集分析。随后使用STRING数据库对差异表达基因进行蛋白互作网络分析,通过Cytoscape软件使其可视化,并筛选枢纽基因。随后制备含有不同浓度矿化胶原材料的培养基与人骨髓间充质干细胞共培养并进行软骨诱导,利用甲苯胺蓝染色确定最适浓度,流式细胞术检测材料对细胞周期的影响,最后通过实时荧光定量PCR验证实验组最适浓度下枢纽基因的表达情况。结果:GSE9451芯片中含有1515个上调基因和1564个下调基因,GSE104113芯片中含有425个上调基因和328个下调基因。取交集获得了42个同时下调表达和38个同时上调表达的差异基因。GO富集分析的结果表明,差异表达基因主要富集在信号转导、葡萄糖稳态、角化、外泌体和钙离子结合。KEGG富集分析结果主要包括雌激素信号转导通路和细胞粘附分子。枢纽基因主要为:KRT19、LGR5、KRT18、KRT34、S100A4。当MC浓度为50μg/mL时,促进细胞软骨分化的效果最好,并且该浓度没有增加细胞凋亡水平。实时荧光定量PCR检测结果符合生信分析预测结果。结论:软骨发育的枢纽基因可能是LGR5/S100A4/KRT19/KRT34/KRT18,重要的信号通路可能是雌激素信号通路、细胞外信号转导,细胞对缺氧状态的反应。矿化胶原材料对BMSCs软骨分化具有促进作用,有望在未来应用于骨关节炎及软骨下骨缺损治疗。

关键词：生物信息学骨髓间充质干细胞软骨矿化胶原

负载VEGF的海藻酸钠/矿化胶原水凝胶促进3D打印钛合金微孔界面骨整合的研究

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负载VEGF的海藻酸钠/矿化胶原水凝胶促进3D打印钛合金微孔界面骨...

作者：盛枭吉林大学

学位级别：硕士

研究背景:钛合金由于其优异的生物相容性,良好的机械性能以及可塑性被广泛应用于制造临床植入物。采用三维打印(3D printing)技术制造的多孔钛合金假体具有独特的多孔结构,不仅能够降低植入物的弹性模量,还能够骨和血管的生长提供更多... 详细信息

研究背景:钛合金由于其优异的生物相容性,良好的机械性能以及可塑性被广泛应用于制造临床植入物。采用三维打印(3D printing)技术制造的多孔钛合金假体具有独特的多孔结构,不仅能够降低植入物的弹性模量,还能够骨和血管的生长提供更多的空间。然而,钛合金植入物仍然面临着一些挑战,包括较强的生物惰性以及疏水性,这导致了骨整合不良的发生。为了解决这个难题,许多研究试图通过改变钛合金的表面形态和化学成分来提高其表面生物活性。尽管这些方法已经显示出一定的积极作用,但它们在提高成骨活性方面的有效性是有限的。近年来,仿生假体界面的研究在生物材料领域受到了广泛的关注。一些研究人员致力于创造一种具有类似于天然骨组织的组件和结构的假体界面,以促进骨与植入物的直接结合。矿化胶原蛋白(MC)是天然骨组织的基本单位,主要由1型胶原蛋白(Col-1)(20%-30%)和羟基磷灰石(60%-70%)组成。Col-1具有磷灰石晶体颗粒的成核位点,可以引导矿物晶体的生长和排列。受仿生学的启发,研究人员合成了模仿天然骨组织成分的人工MC材料,这类仿生材料在体内外均表现出优异的生物相容性和生物降解性,并有效诱导骨与血管再生。原位沉积是制备矿化胶原的主要方法之一,即将Ca和PO引入胶原溶液中,并将PH调节至中性,以触发胶原纤维的自组装和矿化。尽管这种方法很简单,但所获得的矿化胶原蛋白的机械性能极差,无法发挥其作为支架和涂层的生物作用。因此,研究人员经常在矿化胶原蛋白中添加某些聚合物,赋予其更强的物理化学性质和生物功能。海藻酸盐是一种天然聚合物,是从海带或马尾藻中提取碘和甘露醇的副产品。在温和的条件下,海藻酸钠(SA)可以与Ca交联,形成牢固的凝胶结构。一些研究表明,将藻酸盐添加到胶原系统中会形成更厚的原纤维和具有Ca捕获能力的机械增强水凝胶。此外,SA还赋予MC材料更大的灵活性。这是因为SA可以用作多种治疗成分(细胞、抗生素和生长因子)的载体。与纯MC相比,SA/MC复合材料可以更好地持续释放药物并长期保持生物活性。血管内皮生长因子(VEGF)作为一种有效的血管形成诱导剂,可以通过募集内皮细胞和上调MMP-2、HIF-1和KDR等各种基因来诱导血管再生。通过将含VEGF的海藻酸钠混合到MC材料中获得功能性矿化胶原(FMC)。FMC可以在体内潮湿的环境中缓慢释放信号因子,在植入物周围形成浓度梯度,刺激BMSCs和血管内皮细胞(VECs)向植入物中心迁移,完成细胞募集,促进血管再生,提供氧气和营养,加速植入物界面处的骨再生。在本研究中,我们开发了一种FMC来构建有利于成骨的细胞微环境,并系统地检测了包括生物相容性,迁移和成骨分化在内的细胞行为。将FMC与3D打印的钛合金多孔支架相结合,构建一种新的生物活性假体界面(sTi/VEGF)。该假体界面被植入兔股骨远端的骨缺损中,显微CT、推出机械测试、组织学评估和免疫组织化学染色进一步证实,这种生物活性假体界面通过诱导局部骨和血管再生来增强骨-假体界面的稳定性和结合力。方法:1.使用过电子束熔化法(electron beam melting,EBM)制备的3D打印钛合金微孔支架具有优异的机械性能,将功能化矿化胶原水凝胶填充到微孔支架的孔隙中得到实验所需的生物活性界面(详见2.2.2)。2.采用电子扫面显微镜观察支架的表面形貌和微孔参数并采用酶联吸附实验(ELISA)测定VEGF在模拟体液中的释放速率。3.将水凝胶注射到大鼠皮下,在不同时间点处死大鼠取出样本并称重,从而得出水凝胶在体内环境中的降解速率。4.在体外试验中,采用活死染色试剂盒与CCK-8测试复合界面的生物相容性。采用细胞侵袭实验,划痕实验与小管形成实验评估界面对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的成血管趋化作用。采用RT-PCR实验测定界面对HUVECs的成血管基因的表达。采用ALP染色与定量分析测定界面的成骨分化能力。采用RT-PCR测定界面对BMSCs成骨基因的表达的影响。5.在体内实验中,将实验分为3组:空支架(e Ti),填充SA/MC的支架(sTi)和填充负载VEGF的SA/MC水凝胶的支架(sTi/VEGF)。采用电钻在家兔股骨远端制造出一个与支架大小相当的圆柱形骨缺损并将不同支架植入其中。在植入后12周,处死家兔取出支架,采用显微CT(Micro-CT),力学推出实验,组织学评估以及免疫组化染色等方法评价界面的骨整合与血管再生能力。结果:1.制备圆盘形细胞支架(φ10 mm×L3 mm)与圆柱形动物支架(φ4mm×L8 mm),两种支架的孔隙率与孔径分别为70%与1000μm。在电子显微镜的观察下,钛合金支架表面具有微米级的粗糙度并且水凝胶完全填充到支架的微孔中。2.ELISA实验显示VEGF在第一周内释放了55.00%±1.86%,在接下来的21天内持续释放最终释放了79.22%±2.17%。3.水凝胶大鼠皮下降解实验测定了水凝胶在体内的降解率。

关键词： 3D打印多孔钛支架矿化胶原生长因子仿生界面血管生成骨整合

矿化胶原联合浓缩生长因子治疗颌骨囊肿术后骨缺损的临床研究

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口腔颌面外科杂志 2023年第5期33卷 320-325页

作者：孙昊林超马旭彤仲若恺范欣潍坊医学院附属医院口腔科潍坊261035

目的:探究新型矿化胶原(mineralized collagen,MC)骨充填材料联合浓缩生长因子(concentrated growth factor,CGF)治疗颌骨囊肿刮治术后骨缺损的临床疗效。方法:对120例颌骨囊肿患者进行回顾性分析,采用随机数字法分为CGF组(A组,40例)、M... 详细信息

目的:探究新型矿化胶原(mineralized collagen,MC)骨充填材料联合浓缩生长因子(concentrated growth factor,CGF)治疗颌骨囊肿刮治术后骨缺损的临床疗效。方法:对120例颌骨囊肿患者进行回顾性分析,采用随机数字法分为CGF组(A组,40例)、MC组(B组,40例)及MC+CGF组(C组,40例),比较3组术后3、6、12个月时的成骨效果、疼痛及肿胀程度。结果:A组骨缺损区在术后3、6、12个月时,CT值分别为(220.07±29.25)、(358.77±48.42)、(473.07±55.63)HU,B组分别为(281.00±36.14)、(464.66±51.30)、(569.10±71.21)HU,C组分别为(344.14±39.31)、(528.79±63.98)、(603.62±95.04)HU,两两比较差异有统计学意义(P<0.05);在术后2 d时,3组患者疼痛程度视觉模拟评分法(visual analogue scale,VAS)评分依次为64.13±11.46、65.31±9.89、51.68±14.24,C组与A、B两组相比,差异均有统计学意义(P<0.05);通过粗线测量法测得C组的术后肿胀程度较A、B两组轻,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:MC联合CGF应用于颌骨囊肿刮治患者的方法可降低患者术后疼痛、肿胀程度,且能有效促进局部成骨,具有良好疗效。

关键词：矿化胶原浓缩生长因子颌骨囊肿骨缺损

镁离子协同矿化胶原通过调节巨噬细胞免疫反应影响骨/血管生成特性的研究

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镁离子协同矿化胶原通过调节巨噬细胞免疫反应影响骨/血管生成特...

作者：刘畅锦州医科大学

学位级别：硕士

目的镁基金属与矿化胶原(nano-Hydroxyapatite/collagen,n HAC)因其良好的促成骨特性已成为现在研究的热点,然而骨组织的生长及修复并不仅仅是材料与成骨细胞相互作用。良好的骨整合总是伴随着快速的血管形成,血管为新骨的生长提供营养... 详细信息

目的镁基金属与矿化胶原(nano-Hydroxyapatite/collagen,n HAC)因其良好的促成骨特性已成为现在研究的热点,然而骨组织的生长及修复并不仅仅是材料与成骨细胞相互作用。良好的骨整合总是伴随着快速的血管形成,血管为新骨的生长提供营养。除此之外,免疫反应在释放促炎或抗炎细胞因子和生长因子以操纵成骨和血管形成方面同样起着核心作用,生物材料对骨免疫微环境的调节作用影响着骨再生的结果。因此,本研究选用镁离子(Mg2+)及n HAC,探究Mg2+及n HAC能否协同调节巨噬细胞免疫反应,诱导巨噬细胞向M2表型极化。并且进一步研究Mg2+及n HAC协同作用下通过调节免疫微环境进而影响成骨及血管生成能力。方法根据Mg、S和O的分子量,将硫酸镁溶于完全培养基中,制备成100mg/L Mg2+溶液。n HAC按照直径为15mm,厚度为2mm尺寸切割,形成n HAC圆盘。实验分组如下,空白对照组:DMEM完全培养基;Mg2+组:100mg/L Mg2+;n HAC组:n HAC圆盘;Mg2++n HAC组:100mg/L Mg2++n HAC圆盘。1.首先通过CCK-8检测空白对照组,Mg2+组,n HAC组,Mg2++n HAC组四组条件下RAW264.7巨噬细胞增殖活力;然后使用LPS将巨噬细胞诱导成M1型巨噬细胞,分别用空白对照组,Mg2+组,n HAC组,Mg2++n HAC组四组培养LPS诱导后的RAW264.7巨噬细胞,通过流式细胞术评估M1巨噬细胞表面标记物CCR7和M2巨噬细胞表面标记物CD206阳性细胞百分率,q RT-PCR检测TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10及IL-1ra炎症相关基因及细胞生长因子BMP-2和PDGF-B的基因表达,Western blot检测信号通路蛋白NF-κB p65和IκB-α的表达。2.分别用空白对照组,Mg2+组,n HAC组,Mg2++n HAC四组去培养RAW264.7巨噬细胞,2天后收集RAW264.7巨噬细胞上清液,与完全培养基按1:2比例混合,所形成的培养基为RAW细胞条件培养基。四组分别记为:RAW组,Mg2++RAW组,n HAC+RAW组,Mg2+/n HAC+RAW组。然后将四组RAW细胞条件培养基分别与MC3T3-E1及HUVEC细胞进行培养。检测MC3T3-E1细胞ALP活性,茜素红染色分析MC3T3-E1细胞外基质的矿化,q RT-PCR检测Runx-2、OPN和OCN的成骨相关基因表达;血管形成实验检测HUVEC细胞体外血管生成,q RT-PCR检测HIF-1α、KDR和VEGF基因表达。结果1.CCK-8结果显示,与空白对照组相比,Mg2+组,n HAC组,Mg2++n HAC组均能促进RAW264.7巨噬细胞增殖,Mg2++n HAC组表现出最佳的细胞增殖活力。RAW264.7巨噬细胞经LPS诱导后,通过流式细胞术检测细胞表型,显示与空白对照组相比,其他几组均降低了RAW264.7巨噬细胞M1表型CCR7阳性细胞百分率,其中Mg2++n HAC组的CCR7阳性细胞百分率最低,而M2表型CD206阳性细胞百分率在n HAC组,Mg2+组,Mg2++n HAC组中均显示升高趋势,在Mg2++n HAC组中CD206阳性细胞百分率最高;q RT-PCR结果显示,Mg2++n HAC组显著促进巨噬细胞抗炎基因IL-10、IL-1ra,促进骨形态发生蛋白2(BMP-2)及血小板衍生生长因子-B(PDGF-B)的基因表达,并且显著抑制促炎基因TNF-α、IL-1β及IL-6表达;Western blot实验检测表明,与空白对照组相比,Mg2+组,n HAC组,Mg2++n HAC组均可抑制NF-κB p65蛋白,促进IκB-α蛋白的表达,其中Mg2++n HAC组效果最显著。2.通过四组不同的RAW细胞条件培养基培养MC3T3-E1及HUVEC细胞,碱性磷酸酶(ALP)活性测定与茜素红染色实验结果显示,Mg2+/n HAC+RAW组条件培养基中MC3T3-E1细胞的ALP活性及矿化水平最显著,q RT-PCR实验检测结果显示Mg2+/n HAC+RAW组Runx-2、OPN和OCN的成骨相关基因表达效果最显著。同时,血管形成实验和q RT-PCR检测结果表明,与其他组相比,Mg2+/n HAC+RAW组细胞条件培养基明显促进HUVEC细胞血管形成及血管生成基因HIF-1α、KDR和VEGF的表达。结论本实验研究结果表明,Mg2+协同n HAC显著降低巨噬细胞的炎症因子释放,可能与NF-κB通路受到抑制有关,并促使巨噬细胞向M2型极化。产生有利的骨免疫微环境增强成骨分化和血管生成能力。

关键词：镁离子矿化胶原免疫调控成骨分化血管生成