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Nurr1在多巴胺能细胞中的表达及其短发夹rna表达载体的构建与鉴定

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Nurr1在多巴胺能细胞中的表达及其短发夹RNA表达载体的构建与鉴定

针对乙酰肝素酶基因的短发夹rna干扰载体的构建

中国神经科学学会第六届学术会议暨学会成立十周年庆祝大会

作者：吴云成蔡友庆刘文文赵永波上海交通大学附属第一人民医院神经科中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所上海交通大学附属第一人民医院神经科上海交通大学附属第一人民医院神经科

＜正＞目的:检测小鼠核受体相关因子1（Nurrl）在多巴胺能细胞系中的表达,并构建其sbrna的真核表达载体。方法:以RT-PCR和Western blot方法检测Nurrl在多巴胺能细胞株MN9D中的表达。选择两段rna干扰靶序列,合成两对编码发夹sirna序列的... 详细信息

＜正＞目的:检测小鼠核受体相关因子1（Nurrl）在多巴胺能细胞系中的表达,并构建其sbrna的真核表达载体。方法:以RT-PCR和Western blot方法检测Nurrl在多巴胺能细胞株MN9D中的表达。选择两段rna干扰靶序列,合成两对编码发夹sirna序列的单链DNA,并将其克隆到pSilenCircle 载体中,构建含目的基因片段的重组质粒Nurrl-shrna1和Nurrl-shrna2。以同样的方法,构建无关基因P53的重组质粒P53-shrna。以脂质体法转染上述重组载体至多巴胺能细胞株MN9D中,

关键词：核受体相关因子1 多巴胺能神经元 rna干扰短发夹rna 基因表达

来源： cnki会议评论

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新乡医学院学报 2011年第1期28卷 7-9页

作者：许立薇刘阳霍强王爱红王启光蚌埠医学院药学系安徽蚌埠233030 安徽省生化药物工程技术研究中心安徽蚌埠233030 安徽宏业药业有限公司质量管理部安徽蚌埠233030

目的构建对人乙酰肝素酶(hpa)基因有特异性抑制作用的短发夹rna(shrna)表达载体。方法根据GenBank数据库提供的hpa基因核苷酸序列,按照shrna设计原则设计5对特异性的寡核苷酸序列及阴性对照,分别克隆到pGPU6/GFP/Neo载体中,酶切鉴定和... 详细信息

目的构建对人乙酰肝素酶(hpa)基因有特异性抑制作用的短发夹rna(shrna)表达载体。方法根据GenBank数据库提供的hpa基因核苷酸序列,按照shrna设计原则设计5对特异性的寡核苷酸序列及阴性对照,分别克隆到pGPU6/GFP/Neo载体中,酶切鉴定和测序验证阳性克隆。结果经酶切、测序鉴定均证实重组质粒构建成功。结论成功构建了5个靶向人hpa的shrna表达载体,为进一步研究该载体转染MDA-MB-231细胞后对hpa基因的沉默效果奠定基础。

关键词：乙酰肝素酶 rna干扰短发夹rna

小鼠CDC26基因短发夹rna重组腺病毒载体的构建与表达分析

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生物技术通讯 2014年第5期25卷 656-659页

作者：程然然闫永红弓蒙蒙曹培丽贺福初王晓晖北京工业大学生命科学与生物工程学院北京100124 军事医学科学院放射与辐射医学研究所北京蛋白质组研究中心蛋白质组学国家重点实验室北京102206

目的:构建靶向CDC26基因的短发夹rna(shrna)重组腺病毒载体,干扰小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中CDC26的表达。方法:设计小鼠靶向CDC26基因的shrna,插入穿梭质粒pENTRY-EF1a-EGFP-Mir30,通过Gateway系统获得重组腺病毒载体pAd-CDC26-shrna;线性化后转染HEK293A细胞,进行病毒包装;用包装的重组腺病毒感染MEF,24 h后收集细胞,提取总rna,逆转录后用荧光定量PCR法检测MEF内CDC26 mrna的变化,以检测所设计shrna的敲低效率。结果:构建的重组腺病毒载体pAd-CDC26-shrna经酶切鉴定后正确;转染HEK293A细胞后8 d,观察到细胞病变及GFP的大量表达,表明重组腺病毒包装成功;感染MEF后,实时荧光定量PCR检测表明,细胞内CDC26 mrna的水平较对照组敲低了73.14%,腺病毒注射7 d后,注射CDC26 shrna的小鼠血糖较对照组明显降低。结论:构建了具有较高敲低效果的小鼠CDC26基因shrna重组腺病毒,并且具有体内活性。

关键词： CDC26 短发夹rna 腺病毒血糖

针对K—ras^Asn12的短发夹rna表达载体对胰腺癌细胞生长的抑制作用

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中华实验外科杂志 2008年第3期25卷 396-396页

作者：孟繁杰曹斌蔡建辉华北石油管理局总医院普外二科河北任丘062552

我们利用rnai技术达到了特异抑制胰腺癌突变K-ras^Asn12的目的，现报道如下。一、材料和方法1．材料：AsPC-1和BxPC-3细胞株购自中科院上海细胞库。pSilenCircle试剂盒购自Allele公司。质粒抽提纯化盒购自Promrga公司。PCR引物及插入序... 详细信息

我们利用rnai技术达到了特异抑制胰腺癌突变K-ras^Asn12的目的，现报道如下。一、材料和方法1．材料：AsPC-1和BxPC-3细胞株购自中科院上海细胞库。pSilenCircle试剂盒购自Allele公司。质粒抽提纯化盒购自Promrga公司。PCR引物及插入序列由上海生工生物工程公司合成。CellCounting Kit-8购自日本同仁公司。An-nexin V-FITC apoptosis detectionkit购自晶美公司。

关键词：胰腺癌细胞生长短发夹rna 抑制作用表达载体 apoptosis PC-3细胞株 rnai技术 AsPC-1

血管内皮生长因子-C短发夹rna对肝癌细胞的抑制作用

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中华实验外科杂志 2008年第9期25卷 1212-1212页

作者：徐波夏金堂朱光辉翁杰锋蔡文松李书华广州医学院附属广州市第一人民医院普外科 510180 广州医学院病理学教研室

我们通过构建靶向血管内皮生长因子（VEGF）-C的短发夹rna（shrna）质粒载体，观察其对肝癌细胞增殖及侵袭转移能力的抑制效应，探讨靶向VEGF—C的rna干扰（rnai）应用于肝癌基因治疗的可行性。

关键词：血管内皮生长因子-C 肝癌细胞增殖短发夹rna 抑制作用癌基因治疗 rna干扰质粒载体抑制效应

乳腺癌相关抗原基因1-短发夹rna质粒对乳腺癌细胞MCF-7增殖影响

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中华实验外科杂志 2015年第10期32卷 2329-2329页

作者：王建杨波徐州医学院第二附属医院普外科江苏221006

本实验旨在观察乳腺癌相关抗原基因1（BRCAA1）在MCF-7细胞发生发展过程中的作用，现报道如下。一、材料与方法1．材料：人乳腺癌细胞株MCF-7、质粒转染试剂盒、细胞增殖-毒性检测试剂盒、细胞凋亡试剂盒、BRCAA1-短发夹rna（shrna）质... 详细信息

本实验旨在观察乳腺癌相关抗原基因1（BRCAA1）在MCF-7细胞发生发展过程中的作用，现报道如下。一、材料与方法1．材料：人乳腺癌细胞株MCF-7、质粒转染试剂盒、细胞增殖-毒性检测试剂盒、细胞凋亡试剂盒、BRCAA1-短发夹rna（shrna）质粒：BRCAA1-shrna1（BRCAA1-homo-536）：5＇-GCACTGATGTGAGTGCTAAATITCAAGAGAATTTAGCACTCACA-TCAGTGCT3’；BRCAA1-shrna2（BRCAA1-homo-718）：5’-GCATATCAGGAAGCTGTTATCTTCAAGAGAGATAACAGCTTCCT-GATATGCTT-3’；BRCAA1-shrna3（BRCAA1-homo-893）：5’-GCACTCCACTCATGGAAAGATTCAAGAGATCTTTCCTATGACT-GGAGTGCTT-3’；BRCAA1-shrna4（BRCAA1-homo-1371）：5’-GGAGGATAATAGCAGTGAAGATTCAAGAGATCTTCACTGCTATT-ATCCTCCTT-3’。2．方法：MCF-7细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基。将设计好的4组质粒转染细胞，并设立空白对照组（未转染组）和阴性对照组（shrna-NC）。细胞计数法（CCK-8）检测干扰质粒对乳腺癌细胞增殖的影响，选择增殖抑制率最佳的质粒组进行流式细胞学检测。

关键词：乳腺癌细胞MCF-7 相关抗原基因癌细胞增殖质粒转染短发夹rna 人乳腺癌细胞株MCF-7 检测试剂盒 MCF-7细胞

多药耐药基因MDR1短发夹状rna表达质粒的构建与鉴定

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多药耐药基因MDR1短发夹状RNA表达质粒的构建与鉴定

作者：胡礼仪武汉大学

学位级别：硕士

目的:rna干扰是一种双链rna进入细胞内而使特异基因表达抑制的进化保守的转录后基因沉默现象,目前rna干扰已成为研究基因功能的重要方法。本研究旨在利用DNA载体在细胞内产生短发夹状rna,来诱导rna干扰。本研究构建含多药耐药基因MDR1... 详细信息

目的:rna干扰是一种双链rna进入细胞内而使特异基因表达抑制的进化保守的转录后基因沉默现象,目前rna干扰已成为研究基因功能的重要方法。本研究旨在利用DNA载体在细胞内产生短发夹状rna,来诱导rna干扰。本研究构建含多药耐药基因MDR1的短发夹状rna(short hairpin rna,shrna)表达质粒,并观察其对肝癌耐药细胞Bel-7402/R的MDR1 mrna的抑制作用。同时也为rna干扰研究基因功能建立技术平台。方法:根据Genebank中的MDR-1mrna设计的两条反向重复多聚核苷酸序列,退火形成双链DNA,利用分子克隆技术,将含MDR-1的双链DNA,与经双酶切后的载体PGE-1连接,构建pshrna-MDR1重组质粒,通过聚合酶链反应(PCR)和DNA测序证实了表达质粒构建成功;在脂质体的介导下转染肝癌耐药细胞株BEL-7402/R,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析MDR-1 mrna的表达,MTT法检测细胞对药物的敏感性,流式细胞仪(FCM)检测细胞内罗丹明123(Rh123)的潴留和P-gP的表达。结果:PCR和DNA测序证实了含多药耐药基因MDR-1的短发夹状rna表达质粒构建成功,转染肝癌耐药细胞Bel-7402/R后能明显地抑制其MDR-1 mrna的表达,Prna-MDR1,该质粒能有效地降低肝癌耐药细胞MDR-1 mrna的表达,有望消除P-gP的作用,为逆转其引起的MDR的基因治疗提供实验基础,开创一条新途径。

关键词：多药耐药基因重组质粒短发夹rna rna干扰肝癌细胞

人Bcl-2基因短发夹样rna真核表达载体的构建和鉴定

同方学位论文库评论

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青岛医药卫生 2009年第1期41卷 5-8页

作者：肖文静沈方臻林明刚青岛大学医学院 266021 青岛大学医学院附属医院肿瘤科

目的构建人Bcl-2基因序列特异性的短发夹样rna(Short Hairpin rna,shrna)质粒载体。方法根据Bcl-2基因序列及shrna设计原则,化学合成4段编码短发夹rna的寡核苷酸序列,将其定向克隆到带有卡那霉素抗性和增强绿色荧光蛋白的真核表达载体pG... 详细信息

目的构建人Bcl-2基因序列特异性的短发夹样rna(Short Hairpin rna,shrna)质粒载体。方法根据Bcl-2基因序列及shrna设计原则,化学合成4段编码短发夹rna的寡核苷酸序列,将其定向克隆到带有卡那霉素抗性和增强绿色荧光蛋白的真核表达载体pGPH1/GFP/Neo中H1启动子的下游,重组构建rnai质粒,同时设立阴性对照,并对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定。结果限制性内切酶PstI和BamHI酶切显示设计合成的shrna编码序列被成功插入pGPH1/GFP/Neo质粒中,测序结果证实插入片断与设计序列完全一致。结论针对人Bcl-2的shrna真核表达载体成功构建及鉴定为进一步研究Bcl-2功能奠定了良好的基础。

关键词： Bcl-2 短发夹rna shrna 质粒载体 rnai

针对核因子-κBP65基因的短发夹干扰rna逆转录病毒载体构建与鉴定

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现代生物医学进展 2009年第8期9卷 1462-1464,1483页

作者：吴春婷赵佳晖闫树凤靳丽妍朱光发首都医科大学附属北京安贞医院呼吸科北京100029 首都医科大学附属北京安贞医院泌尿外科北京100029

目的:构建针对人核因子κB亚基P65基因mrna的短发夹干扰rna(shrna)逆转录病毒表达载体,并探讨小干扰rna(sirna)靶向抑制NF-κBP65基因表达的作用。方法:根据shrna设计原则,在人NF-κBP65全长序列中选取含19个核苷酸靶序列,设计形成sirna... 详细信息

目的:构建针对人核因子κB亚基P65基因mrna的短发夹干扰rna(shrna)逆转录病毒表达载体,并探讨小干扰rna(sirna)靶向抑制NF-κBP65基因表达的作用。方法:根据shrna设计原则,在人NF-κBP65全长序列中选取含19个核苷酸靶序列,设计形成sirna的DNA模板并克隆到shrna表达载体***中,构建针对NF-κBP65基因的shrna表达载体。经293A细胞包装,并感染NIH3T3细胞进行病毒滴度测定后,感染THP-1细胞。分别采用RT-PCR和Westernblot从mrna和蛋白水平检测干扰效果。结果:限制性酶切和基因测序证实针对人NF-κBP65亚基的shrna表达逆转录病毒载体成功构建;其感染THP-1细胞后,NF-κBP65的mrna和蛋白表达明显抑制。结论:成功构建了NF-κBP65shrna逆转录病毒表达载体,该载体能高效感染THP-1并明显抑制NF-κBP65的表达。

关键词： rna干扰短发夹rna 逆转录病毒核因子-κB