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短发夹RNA沉默丝裂原活化蛋白激酶1对胃癌细胞生物学表型的影响及其分子机制

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中国生物制品学杂志 2021年第9期34卷 1047-1055页

作者：王转兄宋耀辉杜正平陈熙顾静李海龙甘肃中医药大学临床医学院临床检验诊断学教研室甘肃兰州730000 甘肃中医药大学基础医学院生理教研室甘肃兰州730000

目的探讨短发夹RNA(short hairpin rna,shrna)沉默丝裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1)对胃癌细胞生物学表型的影响及其分子机制。方法 SGC-7901和HGC-27细胞按MOI=20分别感染慢病毒LV-sh-MAPK1、LV-sh-Ctrl(分别为两种细胞的试验组及阴性对照组)。RT-qPCR及Western blot法检测SGC-7901及HGC-27细胞中MAPK1的沉默效果,MTT法检测细胞的增殖能力,细胞划痕愈合试验和Transwell小室试验检测细胞的迁移能力,Transwell小室试验检测细胞的侵袭能力,流式细胞术检测细胞周期及凋亡,Western blot检测细胞周期及凋亡相关信号因子的表达情况。结果与阴性对照组比较,试验组细胞中MAPK1基因m rna及蛋白表达水平均显著降低(P<0.01);细胞增殖、侵袭、迁移能力均显著降低(P<0.01);凋亡率显著增加(P<0.01),且细胞阻滞于G1期;CDK6、Bax、Caspase 3、C-Caspase 3、Caspase 9、C-Caspase 9的表达水平明显上调(P<0.01),CDK1、CCNB1、Bcl-2表达水平明显下调(P<0.01)。结论沉默MAPK1可抑制人胃癌细胞的增殖、侵袭、迁移能力,促进细胞凋亡,并将其阻滞在G1期。

关键词：短发夹RNA 胃癌丝裂原活化蛋白激酶1 生物表型

基于微小rna架构的新型随机短发夹RNA文库构建

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中国医学科学院学报 2017年第4期39卷 518-524页

作者：郭倩朱宁卜萌萌郭思超闫雪静陈倩陈梅红中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础医学院生物化学与分子生物学系医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的构建高效发夹状随机短发夹RNA(shrna)文库。方法构建由polⅡ启动子(CMV)驱动的增强绿色荧光蛋白(EGFP)下游连接shrna的表达载体,转染细胞后收取蛋白,用Western blot和荧光素酶报告基因系统检测该载体表达的shrna对靶基因表达的抑制... 详细信息

目的构建高效发夹状随机短发夹RNA(shrna)文库。方法构建由polⅡ启动子(CMV)驱动的增强绿色荧光蛋白(EGFP)下游连接shrna的表达载体,转染细胞后收取蛋白,用Western blot和荧光素酶报告基因系统检测该载体表达的shrna对靶基因表达的抑制效率。在由CMV启动的EGFP下游连接shrna的表达载体基础上,构建EGFP下游连接基于微小rna(mirna)架构的shrna表达载体,转染细胞后收取rna,用实时定量荧光PCR法检测该载体表达的shrna对靶基因表达的抑制效果。基于EGFP下游连接基于mirna架构的shrna表达载体实时定量荧光PCR的检测结果,构建基于mirna架构的大容量随机shrna文库。结果由polⅡ启动子(CMV)驱动发夹状shrna转录时,shrna要位于一个大的转录本之后才能被有效转录。基于mirna架构环境可提高shrna的干扰效率。构建了一个容量为1.8×10~7的基于mirna架构的大容量随机shrna文库。结论构建了一个大容量的新型随机shrna文库。

关键词：微小rna 短发夹RNA 随机文库

磷酸二酯酶5的短发夹RNA对肌细胞纤维化的作用抑制研究

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中国临床药理学杂志 2021年第2期37卷 128-132页

作者：孙洋李龙虎胡爽陈宏魏冬梅马天翔齐齐哈尔市第一医院心内科黑龙江齐齐哈尔161005 齐齐哈尔市第一医院干部病房黑龙江齐齐哈尔161005 齐齐哈尔市第一医院科教部黑龙江齐齐哈尔161005

目的通过短发夹RNA(shrna)延长对磷酸二酯酶5(PDE5)的抑制作用,探索shrna-PDE5对细胞存活率的影响以及对心肌梗死后心功能及心室重构的作用及其机制。方法(1)细胞实验:分离SD大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),将Ad-shrna-PDE5和Ad-Null分别... 详细信息

目的通过短发夹RNA(shrna)延长对磷酸二酯酶5(PDE5)的抑制作用,探索shrna-PDE5对细胞存活率的影响以及对心肌梗死后心功能及心室重构的作用及其机制。方法(1)细胞实验:分离SD大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),将Ad-shrna-PDE5和Ad-Null分别感染体外培养的MSCs,嘌呤霉素筛选稳定表达它们的细胞株,分为shPDE5组和空白对照载体(Ad-Null)组,另设正常组。缺口末端标记法染色检测各组缺氧缺糖(OGD)诱导的稳转MSCs细胞凋亡情况。(2)动物实验:通过结扎左冠状动脉前降支方法建立雄性SD大鼠心肌梗死模型。按照体重将大鼠随机分成6组:假手术组、模型组、对照组、第1转染组、第2转染组和第3转染组,在结扎前降支后,立即在心肌梗死区及周边区4个点各注射经不同处理的MSCs细胞。用蛋白质印迹法检测大鼠心肌中转化生长因子-β(TGF-β)和成纤维细胞生长因子2(FGF2)的蛋白表达水平(光密度值);Masson染色检测心肌梗死区及周边区组织的纤维化情况。结果(1)shPDE5组、Ad-Null组和正常组的凋亡细胞数分别为(6.00±1.00),(14.33±1.52)和(5.33±1.52)个,shPDE5组与Ad-Null组比较,凋亡细胞数明显减少,差异有统计学意义(Prna-PDE5可通过减少细胞凋亡,调节相关因子的表达,抑制心肌细胞纤维化,从而改善心功能。

关键词：短发夹RNA 磷酸二酯酶5 骨髓间充质干细胞心肌细胞纤维化

慢病毒介导短发夹RNA特异性沉默黏蛋白3A表达对肝外胆管癌细胞生长增殖能力的影响

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中华肝胆外科杂志 2019年第8期25卷 616-621页

作者：刘成行黄海琇杨建锋浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院消化内科杭州310006 浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院转化医学研究中心杭州310006 江苏省昆山市中医院

目的探索慢病毒介导短发夹RNA(shrna)沉默黏蛋白3A(Muc3A)表达对肝外胆管癌QBC939细胞生长和增殖能力的影响。方法设计、合成针对Muc3A基因的shrna干扰序列,重组慢病毒质粒进行包装产生病毒液,测定其滴度。转染肝外胆管癌QBC939细胞,采... 详细信息

目的探索慢病毒介导短发夹RNA(shrna)沉默黏蛋白3A(Muc3A)表达对肝外胆管癌QBC939细胞生长和增殖能力的影响。方法设计、合成针对Muc3A基因的shrna干扰序列,重组慢病毒质粒进行包装产生病毒液,测定其滴度。转染肝外胆管癌QBC939细胞,采用最佳药物筛选浓度筛选获得稳定阳性细胞株。将肝外胆管癌QBC939细胞分为三组培养:慢病毒介导shrna转染细胞(转染组)、空病毒转染细胞(阴性对照组)及未转染细胞(空白对照组)。蛋白印记(western blot)检测shrna对Muc3A基因的沉默效率;MTS法检测细胞生长情况,平板克隆形成实验检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果成功包装慢病毒,病毒悬液的滴度为1×10^8 TU/ml;病毒液感染EHCCQBC939细胞,Western blot证实shrna序列定向插入慢病毒载体质粒中;选择3μg/ml嘌呤霉素最佳筛选浓度,获得稳定细胞株;Western blot结果分别显示转染组Muc3A表达明显低于阴性对照组与空白对照组(P0.05)。结论慢病毒介导shrna转染干扰Muc3A基因表达后可明显抑制肝外胆管癌QBC939细胞的生长增殖和克隆能力,提示Muc3A能促进肝外胆管癌细胞的生长与克隆增殖。

关键词：胆管肿瘤细胞增殖胆管上皮癌黏蛋白3A 短发夹RNA 慢病毒

“三明治”式短发夹RNA自组装纳米复合物抗肿瘤靶向治疗的研究

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中国医药工业杂志 2017年第10期48卷 1466-1473页

作者：赵元培董秋玲周建平丁杨中国药科大学药剂学教研室天然药物活性组分与药效国家重点实验室江苏南京210009

短发夹RNA(short hairpin rna,shrna)因稳定性好、可实现目标蛋白的长期沉默成为基因治疗的有力手段,而聚乙烯亚胺(PEI)递送基因常会引发细胞毒性。本课题组为屏蔽PEI正电荷,采用透明质酸(HA)包裹PEI/shrna制备"三明治"式自组装纳米复合... 详细信息

短发夹RNA(short hairpin rna,shrna)因稳定性好、可实现目标蛋白的长期沉默成为基因治疗的有力手段,而聚乙烯亚胺(PEI)递送基因常会引发细胞毒性。本课题组为屏蔽PEI正电荷,采用透明质酸(HA)包裹PEI/shrna制备"三明治"式自组装纳米复合物HA/PEI/shrna用于抗肿瘤靶向治疗。自组装得到的纳米复合物粒径约150 nm,ζ电位约-30 mV。凝胶电泳试验表明在一定范围内,HA的加入并不影响shrna络合。细胞摄取试验表明,该复合物能通过MDA-MB-231细胞表面HA受体介导的细胞内吞而被摄取。MTT试验表明HA/PEI复合物的细胞毒性远低于PEI,HA/PEI/shrna纳米复合物递送治疗型基因细胞毒性较大、转染效率高。综上所述,自组装纳米复合物HA/PEI/shrna是一种有潜在价值的基因靶向传输系统。

关键词：短发夹RNA 透明质酸自组装纳米复合物靶向治疗

EMMPRIN短发夹RNA对SGC-7901细胞侵袭与迁移的影响

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上海交通大学学报（医学版） 2013年第1期33卷 12-18,24页

作者：亢渝俊王川姜政王丕龙重庆医科大学附属第一医院消化科重庆400016

目的构建人细胞外金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)短发夹RNA(shrna),研究其对人胃癌细胞SGC-7901侵袭与迁移的影响。方法体外设计合成针对人EMMPRIN的4组小干扰rna(sirna),退火形成双链shrna,并插入pGenesil-1质粒中。经测序鉴定及RT-PCR和... 详细信息

目的构建人细胞外金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)短发夹RNA(shrna),研究其对人胃癌细胞SGC-7901侵袭与迁移的影响。方法体外设计合成针对人EMMPRIN的4组小干扰rna(sirna),退火形成双链shrna,并插入pGenesil-1质粒中。经测序鉴定及RT-PCR和Western blotting筛选出沉默效果明显的干扰质粒,通过脂质体Lipofectamine 2000转染SGC-7901细胞,Transewell法检测重组干扰质粒对SGC-7901细胞侵袭及迁移能力的影响。结果成功构建并筛选出pshrna-EMMPRIN干扰质粒。重组干扰质粒转染SGC-7901细胞后,细胞EMMPRIN mrna和蛋白表达显著降低。Transewell法检测发现,在转染重组干扰质粒的SGC-7901细胞中,侵袭细胞和迁移细胞的个数明显减少。结论下调EMMPRIN表达能够显著减弱肿瘤的侵袭和迁移能力,为进一步研究EMMPRIN对消化道肿瘤的基因治疗奠定了基础。

关键词：细胞外金属蛋白酶诱导因子短发夹RNA SGC-7901 侵袭迁移

水甘油通道蛋白9短发夹RNA的构建与筛选及其对非酒精性脂肪性肝病细胞模型的作用

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中华肝脏病杂志 2013年第3期21卷 222-227页

作者：王川亢渝俊姜政王丕龙重庆市第三人民医院消化内科 400014 重庆医科大学附属第一医院消化内科

目的构建人水甘油通道蛋白9（AQP9）短发夹RNA（shrna），筛选出沉默效果明显的重组质粒，检测AQP9的shrna对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）细胞模型的作用。方法设计合成针对人AQP9的小干扰rna，退火形成双链shrna后插入pGensil-1质粒中... 详细信息

目的构建人水甘油通道蛋白9（AQP9）短发夹RNA（shrna），筛选出沉默效果明显的重组质粒，检测AQP9的shrna对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）细胞模型的作用。方法设计合成针对人AQP9的小干扰rna，退火形成双链shrna后插入pGensil-1质粒中，并将其转染L02肝细胞，逆转录一聚合酶链反应（RT-PCR）及Westem blot筛选出沉默效果明显的重组质粒。经油酸诱导L02细胞脂肪变性建立NAFLD细胞模型，通过油红O染色，测定甘油三酯、游离脂肪酸及甘油含量，检测重组质粒对NAFLD细胞模型的作用。数据比较采用方差分析。结果经RT-PCR及Westem blot筛选，pshrna—AQP9a转染组mrna及蛋白质相对表达率为25．10％士1．19％及25．41％±1．96％，与未处理L02细胞组的39．33％±1．69％及35．08％±1．89％相比，均明显降低∽值均〈0．01）；将重组质粒pshrna-AQP9a转染NAFLD细胞模型能够降低其AQP9的mrna及蛋白质表达量；油红O染色结果显示，油酸／pshrna-AQP9a转染组细胞内脂质含量明显减少。油酸／pshrna-AQP9a转染组细胞内甘油三酯、游离脂肪酸及甘油含量分别为（2．738±0．231）mmol／L、（1．182±0．168）mmol／L和（0．730±0．084）mmol／L，油酸组分别为（3．218土0．220）mmol／L、（1．538±0．193）mmol／L及（1．024±0．148）mmol／L，油酸／pshrna-AQP9a转染组均明显降低（尸值均〈0．05）。结论降低AQP9表达量能够减轻NAFLD细胞模型的脂肪变l生程度，为进一步研究AQP9对NAFLD的基因治疗奠定基础。

关键词：水甘油通道蛋白质类 rna干扰基因沉默短发夹RNA 脂肪肝非酒精性

短发夹RNA干扰技术沉默趋化因子受体7基因表达对结肠癌LoVo细胞侵袭、转移能力的影响

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中华实验外科杂志 2015年第9期32卷 2175-2178页

作者：钱益施文孙晋洁孙永强南通大学第二附属医院普外科江苏226001

目的通过对趋化因子受体7（CXCR7）的基因干扰,观察其对人结肠癌细胞株LoVo的侵袭、转移能力的影响.方法将靶向CXCR7基因的携带短发夹RNA（shrna）表达的质粒转入LoVo细胞株,以体外侵袭实验观察LoVo细胞侵袭能力的改变;将36只裸鼠分成... 详细信息

目的通过对趋化因子受体7（CXCR7）的基因干扰,观察其对人结肠癌细胞株LoVo的侵袭、转移能力的影响.方法将靶向CXCR7基因的携带短发夹RNA（shrna）表达的质粒转入LoVo细胞株,以体外侵袭实验观察LoVo细胞侵袭能力的改变;将36只裸鼠分成3组,行种植成瘤肝转移实验观察LoVo细胞转移能力的改变.结果体外实验结果显示CXCR7-shrna干扰组LoVo细胞穿膜数[（51.70 ±6.89）个]较空白对照组[（94.30±7.40）个]减少（P＜0.05）;动物实验结果显示3组裸鼠的中位生存时间分别为：CXCR7-shrna干扰组52 d、空白对照组30 d、阴性对照组32 d.CXCR7-shrna干扰组较空白对照组生存率明显提高（P＜0.05）,肝脏表面的转移瘤结节数较空白对照组明显减少（P＞0.05）.空白对照组与阴性对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 shrna干扰技术沉默CXCR7的表达能抑制人结肠癌细胞LoVo的侵袭和转移能力.

关键词：结肠癌短发夹RNA 基因沉默趋化因子受体7

靶向磷酸二酯酶5的短发夹RNA重组腺病毒载体对小鼠急性心梗后早期细胞凋亡的影响

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中国临床药理学杂志 2016年第3期32卷 238-240页

作者：陈宏肖锦雯李龙虎洪炳哲肖健齐魏冬梅齐齐哈尔市第一医院干部病房黑龙江齐齐哈尔161005 大连大学附属中山医院心内科辽宁大连116001 齐齐哈尔市第一医院心内科黑龙江齐齐哈尔161005 齐齐哈尔市第一医院科教部黑龙江齐齐哈尔161005

目的探讨靶向持续抑制磷酸二酯酶5(PDE5)的短发夹RNA(shrna)[PDE5 shrna]重组腺病毒载体对小鼠急性心梗后早期细胞凋亡的影响。方法结扎小鼠左冠状动脉前降支建立小鼠心肌梗死模型,随机分为实验组10例,将携带有PDE5 shrna重组腺病毒载... 详细信息

目的探讨靶向持续抑制磷酸二酯酶5(PDE5)的短发夹RNA(shrna)[PDE5 shrna]重组腺病毒载体对小鼠急性心梗后早期细胞凋亡的影响。方法结扎小鼠左冠状动脉前降支建立小鼠心肌梗死模型,随机分为实验组10例,将携带有PDE5 shrna重组腺病毒载体注射到心肌梗死区及周边区和对照组10例,将没有插入PDE5 shrna的普通腺病毒载体注射到心肌梗死区及周边区。1周后,进行免疫组化和原位末端标记分析(TUNEL)检测梗死及梗死周边细胞凋亡情况,酶联免疫吸附实验(ELISA法)检测环磷酸鸟苷(c GMP)和蛋白激酶G(PKG)的表达,蛋白印迹分析检测各组PDE5的表达情况。结果心梗1周后,和对照组相比较,实验组小鼠梗死区及梗死周围区域细胞凋亡明显减少(Prna的干预可以明显减少心肌梗死及梗死周边区细胞凋亡和非梗死区心肌细胞凋亡,可能与上调c GMP和PKG的表达密切相关。

关键词：短发夹RNA 干预治疗心肌梗死磷酸二酯酶5