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中国食品添加剂 2022年第7期33卷 75-82页

作者：刘育颖张源生吉安职业技术学院现代农林工程学院吉安343000 井冈山应用科技学校吉安343200

以蓝靛果为原料,利用高速逆流色谱法(high-speed counter-current chromatography,HSCCC)分离纯化蓝靛果花色苷(anthocyanins from Lonicera edulis,ALE),并结合紫外、高效液相色谱、液质联用和核磁等分析技术鉴定花色苷组分。结果表明... 详细信息

以蓝靛果为原料,利用高速逆流色谱法(high-speed counter-current chromatography,HSCCC)分离纯化蓝靛果花色苷(anthocyanins from Lonicera edulis,ALE),并结合紫外、高效液相色谱、液质联用和核磁等分析技术鉴定花色苷组分。结果表明分离ALE的HSCCC溶剂体系为1-BU-MTBE-ACN-水-TFA,2∶2∶1∶5∶0.01,V/V。利用该体系成功地从蓝靛果中分离得到矢车菊-3-o-芸香糖苷(cyanidin-3-orutoside,C3R),其纯度和相对含量分别为91.75%和98.13%。通过酶抑制和荧光光谱法研究C3R对α-葡萄糖苷酶抑制作用和荧光猝灭类型。结果发现C3R和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制率的IC_(50)分别为30.85μmol/L和36.18μmol/L,同时C3R能引起α-葡萄糖苷酶发生内部荧光猝灭,猝灭类型属于静态猝灭。因此本研究揭示了蓝靛果为开发α-葡萄糖苷酶抑制剂提供天然资源。

关键词：高速逆流色谱蓝靛果结构鉴定矢车菊-3-o-芸香糖苷 α-葡萄糖苷酶

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桑椹红色素的双水相生物转化及分离纯化研究

桑椹红色素的双水相生物转化及分离纯化研究

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作者：黄婷江苏科技大学

学位级别：硕士

桑椹富含红色素,主要成分为矢车菊素-3-o-葡萄糖苷（Cyanidin-3-o-glucoside,CG）和矢车菊素-3-o-芸香糖苷（Cyanidin-3-o-rutinoside,CR）,分别约占桑色素总量的60%和30%。CG由于其较强的抗氧化和抗炎作用具有潜在的健康益处,是研发功... 详细信息

桑椹富含红色素,主要成分为矢车菊素-3-o-葡萄糖苷（Cyanidin-3-o-glucoside,CG）和矢车菊素-3-o-芸香糖苷（Cyanidin-3-o-rutinoside,CR）,分别约占桑色素总量的60%和30%。CG由于其较强的抗氧化和抗炎作用具有潜在的健康益处,是研发功能性食品的重要活性成分。因此,本文基于桑椹红色素的糖基定向改造策略,构建新型的双水相生物催化反应分离耦合体系,通过α-L-鼠李糖苷酶催化水解CR高效制备CG,为高纯度桑椹花色苷类天然色素的研究与应用提供科技支撑。主要研究内容如下:（1）构建了桑椹红色素的“聚乙二醇/无机盐”双水相富集体系。探究以无机盐与聚乙二醇（Polyethylene glycol,PEG）为组分的双水相成相规律,筛选出适合桑椹红色素富集的双水相体系。结果表明:双水相富集桑椹红色素的最佳工艺为质量分数15%PEG2000、质量分数10%NaSo、体积分数10%桑椹汁、体积分数65%水,调节总体系p H 4,30℃下萃取15 min,一次萃取回收率为92.95±0.46%,其中CG和CR的回收率分别为96.50±0.12%和89.51±1.06%,对CG的富集倍数为2.27。在最佳体系中,40℃下保温4 h,桑色素含量仍保持在80%以上,表明建立的“PEG2000/NaSo”双水相体系有效富集桑椹红色素,且稳定性好,为其生物转化研究提供了温和友好的两相体系。（2）建立了生物转化桑椹红色素的“PEG2000/NaSo”双水相酶催化反应分离耦合工艺。将“PEG2000/NaSo”双水相体系应用于自制的α-L-鼠李糖苷酶催化反应,考察水解CR生成CG的工艺条件,采用圆二色光谱法分析双水相体系中反应前后酶的结构变化。结果表明:双水相酶催化体系的最佳组成为质量分数15%PEG2000、质量分数10%NaSo、底物CR浓度为0.155 mg/m L、体积分数10%的α-L-鼠李糖苷酶的粗酶液（酶活为400.72 U/mg）和水,在总体系p H 4.5、45°C下反应45 min,CR的转化率为71.56±2.05%,CG的纯度达到88.58±0.75%。与“Et oH/（NH）So”双水相酶催化体系相比,该体系中的最适底物浓度提高了44%,反应耗时减少了25%,桑色素回收率提高了20.35%,表明“PEG2000/NaSo”双水相酶催化反应分离耦合工艺应用于桑椹红色素的生物转化更具有优势。（3）设计了“PEG2000/NaSo”双水相体系中全细胞催化桑椹红色素转化的新工艺。以产α-L-鼠李糖苷酶的重组Escherichia coli BL21（DE3）-p ET21a-rha B1的全细胞为催化剂,考察不同因素对双水相体系中全细胞催化CR转化的影响及催化剂的重复利用度。结果表明:双水相全细胞催化最佳工艺为质量分数15%PEG2000、质量分数10%NaSo、底物CR浓度为0.171 mg/m L、细胞浓度为37.5 mg/m L,在p H 4.5、45°C条件下反应1.5 h,CR的转化率为66.56±0.32%,CG的纯度达到83.48±0.72%,全细胞催化剂重复使用5次后的酶活力仍保持50%以上。与“Et oH/（NH）So”双水相体系相比,“PEG2000/NaSo”双水相体系的CR转化率提高了41.16%,催化剂用量减少了25%,其重复利用次数提高了66.67%,表明全细胞催化剂在“PEG2000/NaSo”双水相体系中具有更高的催化性能,且工艺成本大幅降低。（4）提出了桑椹红色素单体的高压制备液相色谱分离及产物峰切割分区收集方法。采用制备型高效液相色谱仪分离桑椹红色素单体,从洗脱程序、流动相流速、进样浓度等方面优化分离方案,并利用高效液相色谱和质谱法进行产物纯度分析和结构鉴定。结果表明:当进样浓度为200 mg/m L,流速10 m L/min,以甲醇和乙酸组成的流动相进行梯度洗脱时,成功分离出2种桑色素单体,即CG和CR,纯度均达到99%,表明制备型高效液相色谱对桑椹红色素单体的的分离效果良好,目标产物纯度达到标准品要求。综上,本文成功构建了桑椹红色素的双水相生物转化模式体系,围绕成相规律、物质分配特性、酶与底物等方面来探索两相间的“反应-分离耦合”过程机理,为高纯度桑椹红色素CG的高效生物制造和新产品研发提供了新的思路。

关键词：桑椹红色素矢车菊-3-o-葡萄糖苷矢车菊-3-o-芸香糖苷双水相体系全细胞催化剂制备色谱分离

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