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本氏烟草悬浮细胞NBS-1的创建及底盘特征分析

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生物工程学报 2024年第6期40卷 1935-1949页

作者：张方晴史佳欣于静赵玥范荣王晓伟李志超天津科技大学生物工程学院天津300457 国家合成生物学技术创新中心天津300308 中国科学院天津工业生物技术研究所天津300308

植物合成生物学在植物天然产物的发掘制造方面具有明显的理论优势,但因缺乏高效的底盘系统及相关使能技术,其对生物合成领域的贡献有限。最常用的植物底盘——烟草由于操作周期长、改造难度大、代谢及纯化背景复杂、烟碱毒性和农业生产... 详细信息

植物合成生物学在植物天然产物的发掘制造方面具有明显的理论优势,但因缺乏高效的底盘系统及相关使能技术,其对生物合成领域的贡献有限。最常用的植物底盘——烟草由于操作周期长、改造难度大、代谢及纯化背景复杂、烟碱毒性和农业生产难精准控制等问题,而烟草悬浮细胞底盘体系可有效解决上述问题。本研究旨在开发出生长快速、生物量高、分散度好、转化效率高、烟碱含量极低并具备较高科研价值及工业化潜力的烟草悬浮细胞底盘。选取分子技术高适用性的本氏烟草(Nicotiana benthamiana),诱导获得的悬浮细胞NBS-1生长迅速、分散性好,最高生物量可达到476.39g/L(鲜重),各项参数均远超常用的烟草BY-2(Nicotiana tabacum L.cv Bright Yellow 2)细胞系。常用的pEAQ-HT高效瞬时表达系统在NBS-1中的转化表达效率可达81%,远高于BY-2。利用转录组数据对BY-2和NBS-1的代谢特征及偏好性进行分析,发现NBS-1的黄酮类等化合物合成通路基因的表达显著高于BY-2,且NBS-1的生物碱合成通路基因的表达显著低于BY-2,并通过代谢物含量测定实验验证了该分析结果,表明NBS-1极低烟碱含量的同时,为该底盘对应产品的选择提供参考。综上,本研究开发出的生长转化优异、黄酮类含量较高且烟碱含量极低的本氏烟草悬浮细胞底盘NBS-1,对于开发烟草悬浮细胞底盘有重要指导意义。

关键词：植物底盘悬浮细胞本氏烟草生物量瞬时表达烟碱黄酮

工业大麻腺毛发育基因CsMIXTA启动子克隆及功能分析

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作物学报 2024年

作者：周智满张小雨高峰戴志刚许英程超华杨泽茂粟建光唐蜻中国农业科学院麻类研究所/种质资源研究室云南省工业大麻产业研究院

CsMIXTA在调控大麻雌性花器官中腺毛的发生和发育中发挥重要作用。为了研究CsMIXTA基因的表达调控，对CsMIXTA基因上游2199 bp启动子序列进行了克隆。通过PlantCARE预测发现，该启动子序列具有多个胁迫响应元件与光响应元件。根据预测... 详细信息

CsMIXTA在调控大麻雌性花器官中腺毛的发生和发育中发挥重要作用。为了研究CsMIXTA基因的表达调控，对CsMIXTA基因上游2199 bp启动子序列进行了克隆。通过PlantCARE预测发现，该启动子序列具有多个胁迫响应元件与光响应元件。根据预测的响应元件分布情况，扩增获得5个5′端缺失的启动子片段。用克隆的启动子全长和缺失片段分别构建融合GUS基因的表达载体，并将其瞬时转化到烟草叶片和工业大麻糖叶中。通过GUS染色观察发现，CsMIXTA启动子的核心区域位于-393～-99 bp之间，包含赤霉素响应元件TATC-box和转录起始元件TATA-box。通过LUC荧光素酶表达发现，CsMIXTA启动子的核心区域具有转录活性。并且研究还发现，CsMIXTA基因在工业大麻糖叶的腺毛中特异性表达。对启动子进行胁迫响应分析的结果显示，低温、脱落酸（ABA）和赤霉素(GA3)都能增强该启动子的活性。这些结果为CsMIXTA基因调控机制研究奠定了重要基础。

关键词：工业大麻 CsMIXTA启动子瞬时表达 GA 、ABA处理

月季‘月月粉’与野蔷薇U6启动子的克隆及活性分析

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中国农业科学 2024年第13期 2651-2661页

作者：覃语祺苏健馨曹雪敏朱婉程文翰张蔚华中农业大学园艺林学学院/果蔬作物种质创新与利用全国重点实验室华中农业大学花卉研究所荆楚理工学院/特色花卉生物育种湖北省工程研究中心

【背景】U6启动子是CRISPR/Cas9基因编辑系统中驱动sgRNA转录的重要元件，而不同物种的U6启动子转录活性可能存在差异，且物种内源U6启动子相比物种外源U6启动子可能具有更高效的启动效率。迄今对蔷薇属（Rosa）植物的U6启动子少有报道... 详细信息

【背景】U6启动子是CRISPR/Cas9基因编辑系统中驱动sgRNA转录的重要元件，而不同物种的U6启动子转录活性可能存在差异，且物种内源U6启动子相比物种外源U6启动子可能具有更高效的启动效率。迄今对蔷薇属（Rosa）植物的U6启动子少有报道，且尚未获得转录活性强于拟南芥U6的启动子。【目的】筛选转录活性更高的蔷薇属植物U6启动子，为后续月季和野蔷薇等蔷薇属植物CRISPR/Cas9基因编辑系统的优化和分子育种奠定基础。【方法】利用拟南芥保守的102 bp U6 snRNA序列，从中国古老月季‘月月粉’（Rosa chinensis Old Blush,OB）基因组中克隆相似性最高的6个OBU6启动子，从野蔷薇（R. multiflora）基因组中克隆相似性最高的7个RmU6启动子，并构建OBU6启动子和RmU6启动子分别驱动LUC和GUS报告基因的融合表达载体，利用农杆菌介导的瞬时转化法转染本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片和月季‘萨曼莎’（R. Samantha）组培苗，通过双荧光素酶活性检测和GUS组织化学染色对月季和野蔷薇的启动子转录活性分别进行比较。【结果】‘月月粉’6个OBU6启动子和野蔷薇7个RmU6启动子均具有影响U6启动子转录活性的两个必要元件USE和TATA box。双荧光素酶活性检测和GUS组织化学染色结果显示，月季‘月月粉’OBU6启动子和野蔷薇RmU6启动子均具有转录活性，但OBU6启动子的转录活性均弱于拟南芥AtU6-1启动子。考虑到过长的U6启动子可能会削弱其转录活性，于是选取其中转录活性相对较高的OBU6-4进行5′端截短（1 507、1 076、574和187 bp），但截短后的启动子未能提高转录活性；而在野蔷薇中，成功筛选到一个长度为630 bp的RmU6-2启动子，其转录活性显著高于拟南芥AtU6-1启动子。【结论】从月季‘月月粉’中克隆得到6条U6启动子，从野蔷薇中克隆得到7条U6启动子，并筛选出一条转录活性显著高于拟南芥AtU6-1启动子的野蔷薇U6启动子RmU6-2，为构建蔷薇属植物CRISPR/Cas9基因组编辑系统提供了极具应用潜力的启动子。

关键词： U6启动子月季蔷薇属报告基因瞬时表达

比利时杜鹃花类黄酮3'-羟化酶(F3'H)基因克隆及功能分析

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生物技术通报 2024年第6期40卷 251-259页

作者：吴泽航杨中义鄢毅铖贾永红吴月燕谢晓鸿浙江万里学院生物与环境学院宁波315100 浙江万里学院设计艺术与建筑学院宁波315100

【目的】类黄酮3’-羟化酶(flavanone 3’-hydroxylase,F3’H)是植物花青素合成过程中的关键酶,探究比利时杜鹃花(Rhododendron hybridum Hort)F3’H基因的功能及表达特性。【方法】以比利时杜鹃花不同发育时期的花瓣及盛花期的根、茎... 详细信息

【目的】类黄酮3’-羟化酶(flavanone 3’-hydroxylase,F3’H)是植物花青素合成过程中的关键酶,探究比利时杜鹃花(Rhododendron hybridum Hort)F3’H基因的功能及表达特性。【方法】以比利时杜鹃花不同发育时期的花瓣及盛花期的根、茎、叶为实验材料,从比利时杜鹃花转录本数据库中筛选类黄酮生物合成通路关键酶类黄酮3’-羟化酶基因序列信息并进行生物信息学分析,利用反转录(RT-PCR)技术克隆RhF3’H基因;利用紫外分光光度计测定了比利时杜鹃花花瓣不同时期的花青素含量,利用RT-qPCR技术对不同发育时期花瓣和成熟期的不同组织进行RhF3’H基因表达量分析;采用Gateway技术构建过表达载体35S:RhF3’H-GFP重组载体进行亚细胞定位验证;构建p1302-RhF3’H过表达载体对比利时杜鹃花花瓣进行侵染。【结果】成功获得比利时杜鹃花RhF3’H基因长度为1557 bp,编码518个氨基酸,具有保守的F3’H结构域,属于P450超家族;系统进化树分析显示,比利时杜鹃花RhF3’H与龙眼和荔枝F3’H蛋白亲缘关系最近;RT-qPCR结果显示,RhF3’H在比利时杜鹃花不同花瓣时期和根、茎、叶组织中均有表达,在不同花瓣发育时期中,盛开期和衰败期中RhF3’H基因的表达量较高,与花青素含量结果相一致;亚细胞定位分析显示,RhF3’H主要存在于细胞膜上;成功构建P1302-RhF3’H瞬时过表达载体,相较于CK和p1302,p1302-RhF3’H在杜鹃花花瓣中显著高表达,其花青素含量也显著增加。【结论】RhF3’H基因在花瓣细胞膜中表达,表达模式与花青素积累趋势一致;过表达RhF3’H基因促进了花青素的合成。

关键词：比利时杜鹃花类黄酮3’-羟化酶(F3’H) 花青素亚细胞定位瞬时表达

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不同载体和农杆菌对苜蓿瞬时表达影响的研究

植物研究 2023年第6期43卷 835-845页

作者：孙敏杨红红王安琪张悦婧达晓伟张继孙坤吴建平冯汉青西北师范大学生命科学学院兰州730070 西北师范大学新农村发展研究院兰州730070

苜蓿(Medicago sativa)是重要的牧草类植物,为了在苜蓿中有效地实现外源基因的瞬时表达,该研究以绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因,以本氏烟草(Nicotiana benthamiana)作为对比,研究了2种不同的表达载体(非复制型载体和基于菜豆黄矮病毒... 详细信息

苜蓿(Medicago sativa)是重要的牧草类植物,为了在苜蓿中有效地实现外源基因的瞬时表达,该研究以绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因,以本氏烟草(Nicotiana benthamiana)作为对比,研究了2种不同的表达载体(非复制型载体和基于菜豆黄矮病毒的复制型载体)、2种不同类型的根癌农杆菌菌株(Agrobacterium tumefa⁃ciens)(LBA4404和EHA105)对苜蓿叶片瞬时表达水平的影响。结果表明,LBA4404与复制型载体的组合(revector/LBA4404)可在苜蓿叶片中有效地实现GFP的瞬时表达。进一步地,研究了re-vector/LBA4404的浓度和侵染后时间对苜蓿叶片瞬时表达的影响。观察显示,随着re-vector/LBA4404菌悬液浓度或侵染后时间的增加,GFP在苜蓿叶片中的瞬时表达水平呈现出先升后降的趋势。菌悬液浓度为1.0(OD600)时,GFP瞬时表达水平最高;侵染后时间为5~7 d时,GFP瞬时表达水平达到峰值。相较于本氏烟草叶片,在苜蓿叶片中实现最高水平的瞬时转化需要更高浓度的农杆菌和更长的侵染后孵育的时间。

关键词：农杆菌瞬时表达苜蓿

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柱花草叶肉原生质体提取与瞬时表达体系构建

草地学报 2023年第3期31卷 893-902页

作者：高静杨丽云张世子蒋凌雁海南大学热带作物学院/海南省热带生物资源可持续利用重点实验室海南海口570228

柱花草(Stylosanthes guianensis)是一种重要的热区豆科牧草,为利用原生质体瞬时表达体系开展柱花草基因功能研究,以20 d龄期‘热研5号’柱花草子叶为试验材料,通过正交试验考察不同因素对原生质体分离及转化效率的影响。结果表明:采用1... 详细信息

柱花草(Stylosanthes guianensis)是一种重要的热区豆科牧草,为利用原生质体瞬时表达体系开展柱花草基因功能研究,以20 d龄期‘热研5号’柱花草子叶为试验材料,通过正交试验考察不同因素对原生质体分离及转化效率的影响。结果表明:采用1.5%纤维素酶、1.25%离析酶、0.5 mol·L^(-1)甘露醇和4 mmol·L^(-1)MES酶解液组合,酶解时间为16 h时,原生质体的产量和活性均达到最佳,分别为(4.567×10^(6))个·g^(-1)和92.271%;原生质体浓度为(6×10^(5))个·mL^(-1)、质粒浓度为0.6μg·μL^(-1),PEG-4000浓度为50%、转化时间为5 min时,转化效率最高,可达52.524%。构建了目标蛋白SgRKL1表达载体pA7-BIUTNT::SgRKL1-GFP,利用PEG介导法将其转入柱花草原生质体,激光扫描共聚焦显微镜检测结果显示SgRKL1蛋白定位于细胞膜上,说明所建立的柱花草叶肉原生质体瞬时表达体系可应用于目标基因的瞬时表达和亚细胞定位研究。

关键词：柱花草叶肉原生质体酶解 PEG介导瞬时表达

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植物原生质体分离与瞬时表达体系研究进展

植物生理学报 2023年第1期59卷 21-32页

作者：李悦宋慧云王志王悦阳毛文迈吴劲松周瑜李培华南农业大学林学与风景园林学院广州510642 广东省森林植物种质资源创新开发利用重点实验室广州510642 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室广州510642

原生质体由于易吸收外源物质而被广泛应用于遗传转化、生理生化等领域,建立高效的原生质体分离体系和瞬时转化体系是进行分子生物学及相关研究的基础。近年来,植物原生质体分离和转化技术取得了迅速的发展和应用。目前,植物原生质体瞬... 详细信息

原生质体由于易吸收外源物质而被广泛应用于遗传转化、生理生化等领域,建立高效的原生质体分离体系和瞬时转化体系是进行分子生物学及相关研究的基础。近年来,植物原生质体分离和转化技术取得了迅速的发展和应用。目前,植物原生质体瞬时转化常用的方法包括根癌农杆菌渗透、聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)介导、电穿孔、植物病毒载体及基因枪法。本文总结了原生质体分离的步骤、影响原生质体分离纯化的因素、植物瞬时转化的方法和瞬时表达体系的应用领域,以期为更多植物原生质体分离体系和瞬时转化体系的建立提供参考。

关键词：原生质体原生质体分离瞬时表达

不同转化条件对3种农杆菌GFP基因在本氏烟草中瞬时表达的影响

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植物研究 2022年第1期42卷 121-129页

作者：张悦婧李颖王娟娟庞海龙贾凌云冯汉青西北师范大学生命科学学院兰州730070

以本氏烟草(Nicotiana benthamiana)为植物材料,分析了不同农杆菌菌株(LBA4404菌株、EHA105菌株、GV3101菌株)、菌液浓度以及侵染时间在瞬时转化过程中对报告基因GFP荧光表达量的影响。结果显示,不同的农杆菌菌株瞬时表达外源基因的最... 详细信息

以本氏烟草(Nicotiana benthamiana)为植物材料,分析了不同农杆菌菌株(LBA4404菌株、EHA105菌株、GV3101菌株)、菌液浓度以及侵染时间在瞬时转化过程中对报告基因GFP荧光表达量的影响。结果显示,不同的农杆菌菌株瞬时表达外源基因的最适浓度和时间均有所不同:LBA4404菌株在菌悬液OD_(600)值为0.8时所介导的瞬时表达效率最高;而EHA105和GV3101菌株在菌悬液OD_(600)值为0.6时可达到最高瞬时表达效率。LBA4404菌株所介导的瞬时表达在农杆菌注射后第2天时表达量最高,而EHA105和GV3101菌株所介导的瞬时表达在农杆菌注射后第4天时表达量最高。不同菌株间比较分析表明,LBA4404菌株所介导的瞬时表达效率最高。上述结果表明,农杆菌菌株以及浓度和侵染时间等转化条件均是影响瞬时表达效率的重要因素。

关键词：本氏烟草注射渗透法瞬时表达 GFP

转基因在菊花叶肉原生质体瞬时表达及亚细胞定位分析

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江苏农业学报 2023年第2期39卷 518-524页

作者：丁林云万可杨丹王同王春梅郭书巧杨霞江苏省农业科学院中心实验室/江苏省农业科学院种质资源与生物技术研究所江苏南京210014 江苏省农业科学院经济作物研究所江苏南京210014 南京农业大学农学院江苏南京210095

为探究用于亚细胞定位研究的菊花叶肉原生质体分离的最适条件,本研究以菊花无菌苗叶片为受体材料,分析不同叶龄叶片和酶解时间对菊花原生质体细胞产量的影响,并利用外源质粒的导入验证了聚乙二醇(PEG)介导的菊花原生质体瞬时转化体系。... 详细信息

为探究用于亚细胞定位研究的菊花叶肉原生质体分离的最适条件,本研究以菊花无菌苗叶片为受体材料,分析不同叶龄叶片和酶解时间对菊花原生质体细胞产量的影响,并利用外源质粒的导入验证了聚乙二醇(PEG)介导的菊花原生质体瞬时转化体系。结果表明,以组织培养14 d的菊花无菌苗叶片为外植体材料,在含1.5%纤维素酶、0.4%离析酶和0.8 mol/L甘露醇的酶解液中振荡酶解6 h,能获得高产的原生质体细胞。采用PEG介导的瞬时转化含绿色荧光蛋白(GFP)的表达载体,在菊花原生质体细胞中观察到强烈的绿色荧光信号。结果显示,稗草乙烯转录因子基因(EcERF)在菊花原生质体中与本氏烟草叶片中的瞬时表达一致,EcERF基因定位于细胞核中。

关键词：菊花原生质体瞬时表达亚细胞定位