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邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯对大鼠睾丸巨噬细胞凋亡的影响

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环境与健康杂志 2013年第12期30卷 1045-1047,F0003页

作者：裴秀丛段志文马明月张玉敏孙飞跃沈阳医学院公共卫生学院辽宁沈阳110034

目的研究邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)对大鼠睾丸巨噬细胞(TM)凋亡的影响,为探讨免疫-内分泌途径在环境污染物雄性生殖毒性中的作用提供依据。方法采用剥离提取法原代培养大鼠TM,运用形态学观察、HE染色、墨汁吞噬实验及CD68抗原的... 详细信息

目的研究邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)对大鼠睾丸巨噬细胞(TM)凋亡的影响,为探讨免疫-内分泌途径在环境污染物雄性生殖毒性中的作用提供依据。方法采用剥离提取法原代培养大鼠TM,运用形态学观察、HE染色、墨汁吞噬实验及CD68抗原的免疫荧光实验鉴定细胞。分别用0(对照)、10、100、1 000μmol/L DEHP处理TM 24 h,采用流式细胞仪检测凋亡情况。结果原代培养72 h,贴壁的细胞呈圆形、梭形和不规则形,有突起,胞浆丰富,具有巨噬细胞的形态特征,细胞纯度大于90%。墨汁吞噬率>90%,提示细胞吞噬功能良好;CD68抗原鉴定为巨噬细胞,与对照组比较,各DEHP染毒组TM的凋亡率均较高,差异有统计学意义(P细胞的凋亡。

关键词：邻苯二甲酸二酯睾丸巨噬细胞细胞凋亡

邻苯二甲酸酯及双酚A或氯化镉对睾丸巨噬细胞分泌白细胞介素-10的影响

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环境与健康杂志 2015年第10期32卷 851-854页

作者：裴秀丛喻道军段志文王晓红何秀马明月张玉敏沈阳医学院公共卫生学院辽宁沈阳110034

目的研究邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)及双酚A(BPA)或氯化镉对大鼠睾丸巨噬细胞(TM)分泌细胞因子IL-10的影响。方法原代提取大鼠TM细胞,以50μg/ml脂多糖(LPS)作为激活剂,分别设1、10、100μmol/L DEHP、BPA和1、10、50μmol/L氯化... 详细信息

目的研究邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)及双酚A(BPA)或氯化镉对大鼠睾丸巨噬细胞(TM)分泌细胞因子IL-10的影响。方法原代提取大鼠TM细胞,以50μg/ml脂多糖(LPS)作为激活剂,分别设1、10、100μmol/L DEHP、BPA和1、10、50μmol/L氯化镉单独染毒组以及0.5μmol/L DEHP+0.5μmol/L BPA、5μmol/L DEHP+5μmol/L BPA、50μmol/L DEHP+50μmol/L BPA、0.5μmol/L DEHP+0.5μmol/L氯化镉、5μmol/L DEHP+5μmol/L氯化镉、50μmol/L DEHP+25μmol/L氯化镉联合染毒组。作用细胞24 h后,采用ELISA及细胞因子抗体芯片方法检测TM细胞上清液中细胞因子白细胞介素-10(IL-10)的浓度。结果与LPS组比较,1μmol/L氯化镉、10μmol/L BPA或100μmol/L DEHP单独染毒组的IL-10蛋白均较低,差异有统计学意义(P细胞上清液中IL-10蛋白浓度均较低,差异有统计学意义(P细胞分泌IL-10蛋白。低剂量(0.5μmol/L)DEHP和BPA的联合作用为协同作用,中、高剂量(5μmol/L、50μmol/L)的联合作用为拮抗作用。而DEHP和氯化镉对IL-10蛋白的交互作用为协同作用。

关键词：邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯双酚A 氯化镉睾丸巨噬细胞白细胞介素-10

皮质酮调控巨噬细胞免疫抑制表型促进细菌性睾丸炎好转的机制研究

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皮质酮调控巨噬细胞免疫抑制表型促进细菌性睾丸炎好转的机制研究

作者：蒋子鸣郑州大学

学位级别：硕士

背景:泌尿生殖系统感染和免疫因素约占所有男性不育病例的13-15%。睾丸是免疫豁免器官,需要耐受生殖细胞的自身抗原,即使在感染或炎症条件下也能保持免疫稳态。睾丸巨噬细胞(TM)在维持睾丸免疫豁免和保护精子发生中起着核心作用。最近... 详细信息

背景:泌尿生殖系统感染和免疫因素约占所有男性不育病例的13-15%。睾丸是免疫豁免器官,需要耐受生殖细胞的自身抗原,即使在感染或炎症条件下也能保持免疫稳态。睾丸巨噬细胞(TM)在维持睾丸免疫豁免和保护精子发生中起着核心作用。最近的研究表明,睾丸间质液中的皮质酮在维持TM功能和表型中发挥重要作用,但其潜在的分子机制尚不清楚。巨噬细胞经常被分为经典激活的促炎巨噬细胞(M1)和选择性激活的抗炎巨噬细胞(M2)。细胞能量代谢途径与其功能存在重要的直接联系,例如:M1和M2巨噬细胞分别依赖糖酵解和氧化磷酸化途径维持其特定的表型和功能。此外,这些代谢途径之间的转换也可以诱导巨噬细胞表型和功能的改变。皮质酮能否通过调控巨噬细胞代谢途径从而改变其表型并在细菌性睾丸过程中发挥作用有待于继续研究。因此,本课题旨在研究皮质酮对巨噬细胞代谢途径、表型和功能的影响,探讨调节和维持小鼠TM抗炎表型的途径,并为睾丸炎患者创新疗法的开发开辟一条的新的途径。方法:***、腹腔巨噬细胞(PM)和骨髓源性巨噬细胞(BMDM)的分离培养将从生精小管、腹腔、骨髓中得到的细胞经过离心、裂红、贴壁、洗涤等步骤得到对应的巨噬细胞,TM、PM于RPMI 1640完全培养基中,BMDM于RPMI 1640+巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(50ng/ml)的完全培养基中,37℃,5%CO2 培养。*** blotRIPA裂解液提取蛋白并测量蛋白浓度后,每个样品上样20μg蛋白跑胶并转移到硝化纤维素膜上。5%脱脂牛奶孵育1h后与p-AMPK、AMPK、pACC1、ACADM、ACADVL等一抗4℃孵育过夜。洗膜后与对应种属二抗室温结合1小时,TBST洗涤三次后ECL显影。***提取细胞总RNA,2μg总RNA逆转录为cDNA。使用SYBR Green PCR Master Mix在ABI PRISM 7300HT序列检测系统上进行qRT PCR,检测脂肪酸代谢相关基因表达。*** XF96 分析将TM、PM或皮质酮刺激的BMDM接种在海马培养板上的分析培养基中,并使用海马XFe-96系统进行分析,测量ECAR和OCR。5.流式细胞术(FACS)采用FACS测定TM和皮质酮刺激BMDM中的巨噬细胞标记物水平。将细胞与目标抗体4℃,无光条件下孵育30min,洗涤并重新悬浮在洗涤缓冲液中。使用FACS AriaⅡ进行流式细胞术分析。***使用TNF-α和IL-10 ELISA试剂盒检测TM、PM及BMDM培养基中TNF-α和IL-10蛋白的浓度。***睾丸炎模型建立在全身麻醉后,切开下腹以暴露输精管。使用30 G针将10μl UPEC菌株生理盐水(约5×105个细菌)悬浮液双侧注射到靠近附睾尾端的输精管中。注射前在注射部位附近结扎,以防止感染顺行向尿道扩散。8.皮质酮治疗睾丸炎模型从术后第二天开始,给动物腹腔注射皮质酮(0.1mg/天)±AMPK抑制剂Compound C(0.4mg/kg)。将小鼠标准饲养条件下饲养,直到手术后第7天处死。9.H&E染色收集UPEC诱发的睾丸炎睾丸,并在固定液中固定4小时,然后石蜡包埋。切片后用苏木精和伊红染色。结果:1.皮质酮诱导BMDM向M2表型极化:皮质酮刺激的BMDM超过50%巨噬细胞表达M2标记蛋白CD206。Cd206及抗炎细胞因子Il10的mRNA在皮质酮处理组表达显著升高,同时促炎细胞因子基因Tnfa的表达降低。此外,皮质酮刺激提高BMDM的OCR水平。2.皮质酮激活AMPK并增强BMDM中的脂肪酸代谢:在皮质酮刺激后,p-AMPK显著激活。BMDM的皮质酮刺激显著增加了 FAO关键酶p-ACC、ACADM、ACADVL的表达。此外,脂肪酸代谢相关基因:Cpt1、Acc1、Acadm、Fasn 的 mRNA水平也有所上调。***抑制剂减弱BMDM和TM中M2表型:Compound C刺激逆转了BMDM中皮质酮介导的AMPK激活。Compound C刺激显著降低皮质酮刺激BMDM中的OCR水平,并显著抑制FAO相关基因Acc1、Cpt1和Acadm的表达;Compound C刺激下调BMDM中CD206的蛋白和基因水平表达。并降低了 TM中p-AMPK的激活,以及OCR水平。4.皮质酮刺激的BMDM和TM依赖AMPK介导抗炎细胞因子的产生:抗炎细胞因子Il10基因表达在LPS处理后1h和3h显著增加,并被Compound C抑制。在蛋白质水平,LPS刺激后3小时BMDM中TNF-α蛋白表达增多,Compound C进一步增强TNF-α表达,IL-10蛋白水平与基因水平变化一致。LPS刺激下,TM IL-10蛋白表达及基因表达水平显著升高,Compound C刺激逆转了 I

关键词：皮质酮睾丸巨噬细胞磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK) 脂肪酸氧化睾丸炎

竹节参总皂苷改善高脂饮食诱导的小鼠睾丸生殖功能障碍

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中国药理学通报 2019年第10期35卷 1375-1380页

作者：马琼艳张长城杨思琪尤旭杨圆张艳叶勇袁丁赵海霞三峡大学医学院

目的探讨竹节参总皂苷(saponins of Panax Japonicus,SPJ)改善高脂饮食诱导的小鼠睾丸生殖功能障碍的作用及机制。方法采用血球计数板于光镜下进行精子计数,伊红Y染色法检测精子存活率;苏木精伊红(HE)染色法检测小鼠睾丸组织形态;TUNEL... 详细信息

目的探讨竹节参总皂苷(saponins of Panax Japonicus,SPJ)改善高脂饮食诱导的小鼠睾丸生殖功能障碍的作用及机制。方法采用血球计数板于光镜下进行精子计数,伊红Y染色法检测精子存活率;苏木精伊红(HE)染色法检测小鼠睾丸组织形态;TUNEL法检测睾丸生精细胞的凋亡;Westernblot法检测睾丸组织内p-NF-κB及其下游炎症因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β)的蛋白表达水平;免疫荧光法检测睾丸巨噬细胞数量。结果SPJ可减轻高脂饮食小鼠的体质量,提高睾丸和附睾的质量及其指数,提高精子存活率和精子数量,改善生精小管形态并减轻生精细胞的凋亡,明显下调p-NF-κB、TNF-α和IL-1β的蛋白表达水平,减少睾丸巨噬细胞的数量。结论SPJ对高脂饮食小鼠睾丸生殖功能障碍有明显改善作用,其机制可能与减轻巨噬细胞浸润,抑制NF-κB通路介导的睾丸炎症有关。

关键词：竹节参总皂苷高脂饮食睾丸炎症 NF-κB 睾丸巨噬细胞生殖障碍

PK2通过CaSR激活NLRP3炎性小体在睾丸炎中的作用与机制研究

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PK2通过CaSR激活NLRP3炎性小体在睾丸炎中的作用与机制研究

作者：苏钰芳华中科技大学

学位级别：硕士

【目的】探究在UPEC诱导的大鼠睾丸炎模型中,TM中CaSR的表达情况。【方法】从湖北省疾控中心购买250-300kg的Wistar雄性大鼠构建UPEC睾丸炎模型,收集其睾丸组织、睾丸间质液和血液标本。首先,用LB无抗生素细菌培养基摇UPEC菌液过夜,酶... 详细信息

【目的】探究在UPEC诱导的大鼠睾丸炎模型中,TM中CaSR的表达情况。【方法】从湖北省疾控中心购买250-300kg的Wistar雄性大鼠构建UPEC睾丸炎模型,收集其睾丸组织、睾丸间质液和血液标本。首先,用LB无抗生素细菌培养基摇UPEC菌液过夜,酶标仪检测UPEC菌液浓度;从大鼠两侧输精管逆行注射菌液后缝合伤口。等量的生理盐水注射作为对照组。7天后确认UPEC睾丸炎模型是否构建成功,实验方法有UPEC基因PAPC及菌落的鉴定,睾丸HE染色,以及电镜下寻找睾丸中UPEC细菌。确认模型构建成功后,取新鲜的睾丸分离出TM,鉴定细胞的纯度,检测巨噬细胞内CaSR的表达情况。【结果】模型构建7天后,UPEC组大鼠睾丸匀浆中明显含有UPEC细菌PAPC基因;且将UPEC组睾丸匀浆涂平板后,次日肉眼可见大量UPEC细菌菌落生成,而对照组平板无细菌菌落生长。电镜下在UPEC感染组大鼠睾丸间质中发现UPEC细菌。肉眼可见UPEC感染组Wistar大鼠睾丸体积与质量较生理盐水对照组相比均减少;精子前向运动率和精子总数与生理盐水对照组相比均降低,精子质量明显受到影响。在睾丸组织中,结果显示,CaSR在正常的大鼠睾丸组织中表达,且感染UPEC后CaSR m RNA与蛋白水平明显升高。TM的RT-PCR与WB结果同样显示,CaSR在UPEC感染组TM中大量表达。【结论】UPEC大鼠睾丸炎模型构建成功;无论是在基因水平还是蛋白水平,UPEC促进CaSR在TM中表达增加。【目的】本部分在UPEC促进CaSR在睾丸巨噬细胞表达增加的基础上,我们进一步研究CaSR在睾丸炎机制中的作用,探索了感染性睾丸炎的天然免疫机制。【方法】构建UPEC大鼠睾丸炎模型,分为生理盐水对照组,UPEC感染组,CaSR抑制剂NPS2143阴性对照组以及UPEC+NPS2143抑制剂组。第一天我们按照第一部分的实验方法构建生理盐水对照组大鼠10只,UPEC感染组20只。次日取10只UPEC感染组大鼠,在睾丸原位注射CaSR抑制剂NPS-2143以构建UPEC+NPS2143抑制剂组。然后在10只生理盐水对照组及10只UPEC感染组大鼠睾丸中原位注射等体积的DMSO（NPS-2143溶剂）,另构建10只NPS-2143阴性对照组。通过HE染色观察睾丸组织学变化;取附睾尾部精子分析精子总数及前向运动;运用质谱的方法检测各组大鼠血清中睾酮的水平并进行分析;我们通过fluo4-am荧光标记的流式法和酶标仪法检测各组大鼠巨噬细胞内钙离子的情况;通过ELISA方法检测睾丸间质液与原代TM上清液中IL-1β的分泌情况;然后,在体外实验中,先分离出正常的大鼠睾丸巨噬细胞,再在细胞培养基中用细菌UPEC体外刺激0min、30min、60min、120min,检测刺激后TM中CaSR与NLRP3的基因表达水平。同时在体内实验中,分离出原代TM并检测TM中CaSR与NLRP3 m RNA表达水平;运用Western Blot实验方法检测原代睾丸巨噬细胞中NLRP3蛋白和Caspase-1蛋白的表达情况。【结果】UPEC感染组睾丸组织切片表现出明显的炎性损伤,包括生精上皮排列不规则且层数减少以及间质中免疫细胞的浸润;值得一提的是,UPEC+NPS-2143抑制剂组大鼠睾丸的炎性损伤有所缓解;NPS-2143阴性对照组较生理盐水对照组未见明显的变化。UPEC感染后大鼠精子总数与精子前向运动率与对照组相比明显下降,而使用CaSR抑制剂NPS-2143后精子总数与精子前向运动率有所提高。正常情况下,大鼠血清中睾酮的水平约为4.5ng/m L,UPEC感染后大鼠睾酮的水平约下降3倍,经过CaSR抑制剂NPS-2143干预后,与UPEC感染组相比睾酮的水平约升高了1倍。体内实验流式结果显示,与对照组相比,UPEC组原代巨噬细胞胞浆内含有大量的钙离子内流（P＜0.01）,使用CaSR抑制剂NPS-2143后钙离子内流减少（P＜0.05）。酶标仪检测巨噬细胞胞浆钙离子水平的结果显示UPEC+NPS-2143组中钙离子的水平较UPEC感染组相比下降（P＜0.05）。体外实验结果显示,细菌UPEC体外刺激的最佳时间是60min,UPEC刺激后TM中CaSR与NLRP3的基因水平均明显升高。Western Blot结果显示,UPEC感染后大鼠睾丸原代巨噬细胞中NLRP3的蛋白水平明显增加,而CaSR抑制剂可以抑制NLRP3蛋白的表达。【结论】异常增高的CaSR是造成UPEC睾丸炎性损伤的重要因素之一,对精子活力、精子总数、睾丸结构以及血清睾酮的水平产生负面影响,然而CaSR抑制剂NPS-2143可以在一定程度上缓解这些炎性损伤;在UPEC感染后,睾丸巨噬细胞内CaSR可能通过促进钙离子内流激活NLRP3炎性小体通路。【目

关键词： UPEC睾丸炎 CaSR 睾丸巨噬细胞精子质量睾酮 NPS-2143 精子活力 UPEC IL-1β PK2

TGF-β/SMAD信号通路在双酚A诱导细胞凋亡中的作用

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TGF-β/SMAD信号通路在双酚A诱导细胞凋亡中的作用

作者：范峥沈阳医学院

学位级别：硕士

目的双酚A(BPA)为一种应用广泛的环境内分泌干扰物,可通过多种途径进入人体,对神经、生殖及免疫系统造成损伤。研究表明BPA可以诱导免疫细胞发生凋亡,进而影响机体正常的免疫功能。睾丸巨噬细胞(TM)为一类存在于睾丸间质中的免疫细胞,... 详细信息

目的双酚A(BPA)为一种应用广泛的环境内分泌干扰物,可通过多种途径进入人体,对神经、生殖及免疫系统造成损伤。研究表明BPA可以诱导免疫细胞发生凋亡,进而影响机体正常的免疫功能。睾丸巨噬细胞(TM)为一类存在于睾丸间质中的免疫细胞,对维持整个睾丸内环境起重要作用。本研究以大鼠TM细胞为靶细胞,以脂多糖(LPS)作为激活剂,建立BPA暴露模型,应用基因表达谱芯片技术,探讨BPA对TM细胞基因表达的影响。在此基础上,分别建立BPA暴露体内和体外模型,选择BPA上调最明显的TGF-β/SMAD信号通路,探讨其在BPA诱导大鼠细胞凋亡中的作用,为进一步研究BPA的免疫生殖毒作用机制提供理论依据。方法原代提取大鼠TM细胞,以50μg/ml LPS为激活剂,1 00μmol/L BPA作用于TM细胞24h,应用基因表达谱芯片技术,筛选影响最为明显的基因及信号通路;以50μg/ml LPS为激活剂,100μmol/L BPA作用TM细胞4h和24h,应用流式细胞仪检测作用24h后TM细胞凋亡水平,应用RT-PCR检测作用4h后TM细胞TGF-β2、TGF-β3、SMAD6、SMAD7、BAX和BCL-2基因表达水平。建立大鼠孕期BPA暴露模型,分别设立对照组(玉米油),BPA染毒组(25、50、100 mg/kg),从孕期第15天开始至出生后第21天灌胃染毒,每天1次,分别在出生后22天和出生后44天取雄性仔鼠睾丸,附睾,肝脏,肾脏,肾上腺,称重并于-80℃冻存。计算并比较各脏器脏器系数,应用TUNEL染色检测睾丸组织凋亡水平,应用RT-PCR检测TGF-β2、TGF-β3、SMAD6、SMAD7、BAX和BCL-2基因表达水平。应用Western Blot检测BAX和BCL-2蛋白表达水平。结果1.基因芯片结果显示与对照组比较,激活剂上调了29个基因的表达,降低了3525个基因的表达。与激活剂组比较,100 μmol/LBPA使184个基因表达升高,154个基因表达降低。BPA影响了如巨噬细胞分泌因子、免疫功能调节、抗原递呈及细胞凋亡等生物学过程。BPA上调最为明显的信号通路依次为TGF-beta signaling pathway、Rheumatoid arthritis(RA)、Inflammatory bowel disease(IBD)、Hippo signaling pathway、Graft-versus-host disease等,下调最为明显的信号通路依次为Rheumatoid arthritis、Amoebiasis、TNF signaling pathway、Pertussis、Jak-STAT signaling pathway等。2.与激活剂组比较,l0Oμmol/LBPA作用24h对TM细胞早期凋亡,晚期凋亡和总凋亡水平无明显影响(P>0.05)。作用TM细胞4h,与激活剂组比较,10Oμmol/LBPA可显著上调BAX基因表达,下调BCL-2基因表达(P0.05)。3.与对照组比较,出生后22天50 mg/kg BPA组肾上腺及100 mg/kg BPA组肾脏脏器系数显著升高,其它脏器脏器系数无明显变化(P>0.05)。与对照组比较,出生后44天25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg BPA组仔鼠睾丸脏器系数显著下降(P0.05)。出生后22天睾丸组织经TUNEL染色发现,与对照组比较,25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg BPA组中均出现较多棕染凋亡细胞,PCR结果显示各组BAX基因表达无明显变化,100 mg/kg BPA组BCL-2基因表达升高(P睾丸组织BAX和BCL-2基因表达均升高(P睾丸组织TGF-β2、TGF-β3基因表达升高(P细胞基因表达。2.体外研究表明BPA可能通过抑制TGF-β/SMAD信号通路,诱导TM细胞凋亡。而体内研究表明孕期BPA暴露可能通过激活TGF-β/SMAD信号通路,诱导睾丸细胞凋亡,对睾丸造成损伤,影响睾丸发育。综上

关键词：双酚A 睾丸巨噬细胞凋亡 TGF-β/SMAD BAX BCL-2