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中南大学学报（医学版） 2010年第3期35卷 230-235页

作者：文甲明蒋先镇汤育新阳建福陈厚仰刘志中中南大学湘雅三医院男性病研究中心长沙410013

目的:构建原核质粒表达TDRG1重组蛋白,制备其单克隆抗体(mAb)并鉴定其生物学特性。方法:用逆转录聚合酶链反应法从成人睾丸组织中扩增TDRG1编码序列,将其克隆到pET21原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)内进行诱导表达TDRG1重组蛋白。以... 详细信息

目的:构建原核质粒表达TDRG1重组蛋白,制备其单克隆抗体(mAb)并鉴定其生物学特性。方法:用逆转录聚合酶链反应法从成人睾丸组织中扩增TDRG1编码序列,将其克隆到pET21原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)内进行诱导表达TDRG1重组蛋白。以纯化后的重组蛋白免疫BALB/C小鼠,利用杂交瘤细胞融合技术制备单克隆抗体(mAb)。ELISA法检测杂交瘤细胞分泌mAb的效价和类型,Western印迹和免疫组织化学染色鉴定mAb的特异性。结果:成功构建了pET21/TDRG1原核表达质粒并获得纯度较高的重组蛋白。筛选出2株能稳定分泌抗TDRG1的单克隆抗体杂交瘤细胞系,其效价比高达1∶1.6×106,免疫球蛋白类型均为IgG1类。Western印迹和免疫组织化学染色显示该mAb能特异结合成人睾丸组织中的TDRG1蛋白。结论:所获得的重组TDRG1蛋白纯度高,免疫抗原性强,并成功制备了抗TDRG1的单克隆抗体。

关键词：睾丸基因 TDRG1重组蛋白单克隆抗体

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人睾丸特异表达基因TDRG1 shRNA表达载体的构建及其表达

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中南大学学报（医学版） 2012年第10期37卷 979-982页

作者：彭圣林阳建福陈厚仰郭小亮李东杰周华波甘宇蒋先镇汤育新中南大学湘雅三医院泌尿外科长沙410013

目的:构建人睾丸基因TDRG1的shRNA表达质粒,并研究其在NTERA-2细胞中的表达。方法:设计合成有短发夹结构靶位TDRG1基因的寡核苷酸,经退火成双链,克隆至载体pGPU6/GFP/Neo中,构建TDRG1shRNA表达载体,得到重组质粒TDRG1-shRNA486,TDRG1-sh... 详细信息

目的:构建人睾丸基因TDRG1的shRNA表达质粒,并研究其在NTERA-2细胞中的表达。方法:设计合成有短发夹结构靶位TDRG1基因的寡核苷酸,经退火成双链,克隆至载体pGPU6/GFP/Neo中,构建TDRG1shRNA表达载体,得到重组质粒TDRG1-shRNA486,TDRG1-shRNA738,TDRG1-shRNA921和一个阴性对照,使用Lipofectamine 2000转染shRNA至NTERA-2细胞,应用RT-PCR法检测转染后NTERA-2细胞TDRG1 mRNA的表达水平。结果:经测序证实,插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致。同时筛选到转染TDRG1-shRNA486的NTERA-2细胞TDRG1基因的mRNA表达水平明显抑制。结论:成功构建了人类睾丸基因TDRG1的shRNA表达载体,TDRG1-shRNA在NTERA-2细胞内成功表达。

关键词：睾丸基因 TDRG1 RNAi shRNA NTERA-2细胞

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人睾丸特异性基因TDRG1在恒河猴中同源序列的生物信息学分析及实验验证

人睾丸特异性基因TDRG1在恒河猴中同源序列的生物信息学分析及实...

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作者：陈厚仰中南大学

学位级别：硕士

目的：克隆人睾丸特异基因TDRG1在恒河猴中的同源基因序列,分析该基因在恒河猴多种组织中的表达谱,为深入研究TDRG1基因功能寻找动物模型。方法：以人TDRG1基因全长序列作为查询序列,利用BLASTN软件检索恒河猴基因组数据库,查询到的同... 详细信息

目的：克隆人睾丸特异基因TDRG1在恒河猴中的同源基因序列,分析该基因在恒河猴多种组织中的表达谱,为深入研究TDRG1基因功能寻找动物模型。方法：以人TDRG1基因全长序列作为查询序列,利用BLASTN软件检索恒河猴基因组数据库,查询到的同源序列,运用RT-PCR、Northern blot、Real-time、免疫组化等实验初探TDRG1同源基因在恒河猴睾丸组织中以及在恒河猴全身多组织中的表达。结果：生物信息学分析表明恒河猴基因组中检索到与TDRG1同源序列,同源性达94%。RT-PCR验证了恒河猴睾丸中的同源序列;Northern Blot分析了TDRG1在恒河猴组织中同源基因表达的表达谱,结果显示只在恒河猴睾丸组织表达阳性,其余组织表达阴性;Real-time PCR结果提示TDRG1在恒河猴睾丸中同源基因有表达,但在恒河猴肾脏、膀胱、肝脏等组织中无表达;免疫组化结果显示抗人TDRG1单克隆抗体能特异结合恒河猴睾丸中的同源蛋白,而在其他组织中无TDRG1同源蛋白的表达。结论：TDRG1基因在恒河猴睾丸中有同源基因表达,为今后建立转基因或基因敲除动物模型提供了理论和实验依据。

关键词：睾丸基因 TDRG1 同源序列恒河猴

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人睾丸特异表达基因TDRG1 shRNA表达载体的构建及其表达

人睾丸特异表达基因TDRG1 shRNA表达载体的构建及其表达

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作者：彭圣林中南大学

学位级别：硕士

目的：构建靶向人睾丸基因TDRG1的shRNA重组质粒表达载体,并研究其在人恶性畸胎瘤细胞(NTERA-2)的表达。筛选出高效且特异性抑制TDRG1基因表达的重组质粒表达载体,为下一步研究TDRG1基因对睾丸肿瘤生物学行为的作用奠定基础。方法：设... 详细信息

目的：构建靶向人睾丸基因TDRG1的shRNA重组质粒表达载体,并研究其在人恶性畸胎瘤细胞(NTERA-2)的表达。筛选出高效且特异性抑制TDRG1基因表达的重组质粒表达载体,为下一步研究TDRG1基因对睾丸肿瘤生物学行为的作用奠定基础。方法：设计合成有短发夹结构靶位TDRG1基因的寡核苷酸,经退火成双链,克隆至载体pGPU6/GFP/Neo中,构建了TDRG1-shRNA表达载体,得到重组质粒TDRG1-shRNA486, TDRG1-shRNA738, TDRG1-shRNA921和一个阴性对照,转化入JM109大肠杆菌,抽提质粒,进行酶切和测序鉴定,分别使用LipofectamineTM2000介导转染重组质粒shRNA至人恶性畸胎瘤细胞中,再应用Real Time-PCR法检测转染后人恶性畸胎瘤细胞TDRG1mRNA的表达水平。结果：酶切结果表明,所有质粒均为阳性重组质粒,经基因测序证实,插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致。同时筛选到转染TDRG1-shRNA486的人恶性畸胎瘤细胞TDRG1基因的mRNA表达水平明显抑制(p基因mRNA抑制效率为84.89%。结论：成功构建了人睾丸特异性表达基因TDRG1的shRNA表达载体,三组TDRG1-shRNA均可在NTERA-2细胞内成功表达,而其中TDRG1-shRNA486抑制目的基因的效果最好。图14副,表12个,参考文献41篇。

关键词：睾丸基因 TDRG1 RNAi shRNA NTERA-2细胞

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