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根癌农杆菌介导丝状真菌遗传转化因素的研究进展

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微生物学杂志 2007年第6期27卷 88-91页

作者：张震杜新法柴荣耀孙国昌浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所浙江杭州310021

根癌农杆菌介导的丝状真菌遗传转化体系,是当前研究真菌基因组学的有力工具,广泛运用于真菌随机插入突变体库的构建和基因打靶。概述了根癌农杆菌介导的丝菌转化的大致过程,转化效率的影响因素。

关键词：根癌农杆菌真菌转化转化效率影响因素

利用真菌发酵生产ω-3多不饱和脂肪酸的研究进展

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贵州科学 2002年第3期20卷 59-65页

作者：朱国胜刘作易梁宗琦雷邦星贵州大学生物技术学院真菌资源研究室贵州贵阳550025 贵州赤天化股份有限公司科研中心贵州贵阳550025

综述了ω - 3多不饱和脂肪酸 (Polyunsaturatedfattyacids,PUFAs)代谢和生理功能 ,真菌PUFAs的合成转化及关键酶的研究 ,真菌生产ω - 3PUFAs优化的发酵条件及转化技术 ,展示了广阔的前景并归纳了产ω - 3PUFAs的真菌资源 ,提出了存在... 详细信息

综述了ω - 3多不饱和脂肪酸 (Polyunsaturatedfattyacids,PUFAs)代谢和生理功能 ,真菌PUFAs的合成转化及关键酶的研究 ,真菌生产ω - 3PUFAs优化的发酵条件及转化技术 ,展示了广阔的前景并归纳了产ω - 3PUFAs的真菌资源 ,提出了存在的问题及ω - 3PUFAs产量提高的可能途径及高产菌种选育方法。

关键词：真菌发酵生产 ω-3PHFAS 多不饱和脂肪酸真菌转化

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梓醇转化菌株筛选及其转化产物的分离鉴定

西北农林科技大学学报（自然科学版） 2018年第4期46卷 128-136页

作者：王红阳王明道邢岩聂慧慧洪冲陈红歌河南农业大学农业部农业微生物酶工程重点实验室河南郑州450002

【目的】筛选对梓醇具有转化能力的真菌菌株,并对转化产物进行生物学活性测定及分离鉴定。【方法】用PDA固体培养基从地黄重茬土壤样品中分离纯化具梓醇转化能力的真菌菌株,对目标菌株进行形态学观察和分子生物学鉴定;以白菜、萝卜和芝... 详细信息

【目的】筛选对梓醇具有转化能力的真菌菌株,并对转化产物进行生物学活性测定及分离鉴定。【方法】用PDA固体培养基从地黄重茬土壤样品中分离纯化具梓醇转化能力的真菌菌株,对目标菌株进行形态学观察和分子生物学鉴定;以白菜、萝卜和芝麻种子为材料,蒸馏水为对照,测定在发酵液体积分数为25%,50%,75%和100%时,3种种子的发率和幼苗根长、苗高及鲜质量等指标,分析梓醇的真菌转化产物对植物生长发育的影响;利用薄层层析法和GC-MS法对转化产物进行分离、纯化及鉴定。【结果】从地黄重茬土壤样品中筛选出1株对梓醇转化能力强的菌株(33号菌株),经形态学和分子生物学鉴定,确定该菌为日本曲霉棘孢变种(Aspergillus japonicus Saito ***)。该菌转化梓醇发酵液产物对白菜、萝卜种子发芽率影响不大,但发酵液体积分数为100%时芝麻种子发芽率由92%降至12%,抑制作用显著。与空白对照相比,随发酵液体积分数增加,3种作物幼苗的根长、苗高和鲜质量均受到不同程度的抑制作用;当发酵液体积分数为100%时,白菜种子的根长、苗高和鲜质量分别降低了82.8%,30.0%,22.7%,萝卜种子分别降低了31.2%,90.9%,54.5%,芝麻种子分别降低了75.6%,71.4%,64.7%。梓醇转化产物中发挥抑制作用的物质最终被确定为2-癸烯酸甲酯。【结论】从地黄重茬土壤中筛选获得1株具梓醇转化能力的菌株,其转化产物具有抑制植物幼苗生长的作用,发挥抑制作用的物质为2-癸烯酸甲酯。

关键词：地黄梓醇真菌转化生物活性抑制作用

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卡那霉素抗性基因在三孢布拉霉菌种中的表达

工业微生物 2002年第4期32卷 24-27页

作者：单志萍陆茂林孟妤胡幼敏江苏省微生物研究所无锡214063

利用一个带有自主复制子 ,但缺失自身启动子的源于转座子Tn - 5的卡那霉素抗性基因的质粒PVB32 ,在大肠杆菌中克隆丝状真菌三孢布拉霉DNA中有启动子功能的DNA片段 ;通过原生质体转化 ,获得了三孢布拉霉对卡那霉素抗性的表达 ,且抗性表... 详细信息

利用一个带有自主复制子 ,但缺失自身启动子的源于转座子Tn - 5的卡那霉素抗性基因的质粒PVB32 ,在大肠杆菌中克隆丝状真菌三孢布拉霉DNA中有启动子功能的DNA片段 ;通过原生质体转化 ,获得了三孢布拉霉对卡那霉素抗性的表达 ,且抗性表现稳定 ,可通过孢子无性繁殖稳定遗传下去。

关键词：卡那霉素抗性基因三孢布拉霉菌种表达真菌转化 β-胡萝卜素

尖孢镰刀菌转化表达松材线虫Bx-apa-2和Bx-apm-2基因dsRNA以及饲喂法介导的RNAi研究

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西南林业大学学报（自然科学） 2022年第3期42卷 72-79页

作者：王猛宋士林王旭田越张正敏胡世冉成新跃聊城大学生命科学学院山东聊城252059 北京师范大学生命科学学院北京100875 中国检验检疫科学研究院北京100176

通过使用饲喂法介导的RNAi技术,对松材线虫Bx-apa-2和Bx-apm-2基因进行了研究。结果表明:线虫通过取食相应真菌转化体,可以实现持续性的RNA干扰,并造成靶基因的显著性下调。干扰Bx-apa-2基因,线虫主要表现出细小的表型;干扰Bx-apm-2基因... 详细信息

通过使用饲喂法介导的RNAi技术,对松材线虫Bx-apa-2和Bx-apm-2基因进行了研究。结果表明:线虫通过取食相应真菌转化体,可以实现持续性的RNA干扰,并造成靶基因的显著性下调。干扰Bx-apa-2基因,线虫主要表现出细小的表型;干扰Bx-apm-2基因,雌虫主要表现出细小的表型,而雄虫则表现出短粗的表型;同时干扰Bx-apa-2和Bx-apm-2基因,线虫主要表现出更为显著的短粗表型。因此,研究结果进一步证明了饲喂法介导的RNAi可以显著性的抑制松材线虫靶基因的表达,并对线虫的表型产生明显的影响。

关键词：松材线虫 RNA干扰衔接蛋白2 真菌转化

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稻瘟病菌一个新抗药性标记基因的应用研究

稻瘟病菌一个新抗药性标记基因的应用研究

作者：朱小蕾安徽农业大学

学位级别：硕士

稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)是生产中最具破坏性的致病真菌之一,每年可造成10%-30%的粮食产量损失。随着稻瘟病菌及其宿主水稻全基因组序列测序工作的完成,加快了对病原菌致病性相关基因的研究进程,同时也为研究宿主-病原菌相互作用... 详细信息

稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)是生产中最具破坏性的致病真菌之一,每年可造成10%-30%的粮食产量损失。随着稻瘟病菌及其宿主水稻全基因组序列测序工作的完成,加快了对病原菌致病性相关基因的研究进程,同时也为研究宿主-病原菌相互作用提供了理论基础。从分子水平解析稻瘟病菌致病及变异机制对有效防控该病害的发生及发展具有重要的理论与实践意义。目前,稻瘟病菌主要通过基因敲除、过表达和荧光蛋白融合等方法来进行基因功能研究。但是,大部分基因重组整合位点往往是随机的,由此带来的位置效应可能会干扰基因自身或是相关功能基因的表达。本研究利用紫外线(UV)对稻瘟菌进行辐射突变,获得一株萎锈灵抗性菌株,经测序发现,该突变菌株琥珀酸脱氢酶B亚基(sdi1)第245位氨基酸发生突变。利用该点突变(H245L)作为筛选标记,对已知载体pCAMBIA1300进行改造,使其成为具有萎锈灵抗性筛选标记,并能定点插入Mosdi1位点的重组载体pMoC-eGFP。通过农杆菌介导的转化方法得到pMoC-eGFP定点重组的突变体,对抗性菌株进行PCR及Southern杂交验证,表明该载体定点、单拷贝整合至基因组Mosdi1位点的效率高。实验结果表明,突变株在产孢量、孢子形态、生长速率等方面与野生型菌株相比未发生明显改变,同时,突变体对大麦和水稻(敏感品种CO-39)的致病性也未发现明显的变化。因此,可以将Mosdi1位点作为目的基因整合位点,以实现目的基因在稻瘟菌株中的稳定表达。此外,该载体包含酵母重组区,可以不依赖限制性酶切位点,实现多个DNA片段的一步连接。与传统基因回补及定位研究方法相比,该系统快速、高效等优点,对稻瘟病菌基因功能研究具有重要的意义。目前,本实验室利用该定点整合系统,完成了稻瘟菌Morak1、Mopmt2及Mokhd4三个基因的定点回补及定位载体构建工作。上述部分菌株进行Southern杂交及半定量RT-PCR验证,表明突变体中目的基因均以单拷贝形式整合在Mosdi1位点下游。以上结果进一步表明,在上述系统的帮助下,可高效、快速完成靶标基因回补转化子及定位菌株的构建,对稻瘟病菌基因功能研究起到重要的推动作用。

关键词： Mosdi1 标记基因定点整合真菌转化酵母重组

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小檗碱抑制桃褐腐病菌的作用靶标鉴定

小檗碱抑制桃褐腐病菌的作用靶标鉴定

作者：孙忠义北京化工大学

学位级别：硕士

桃褐腐病菌Monilinia fructicola可引起桃树等植物发生褐腐病(Brown rot disease),造成农业经济损失。目前,主要依赖化学杀菌剂防治桃褐腐病菌,化学防治污染环境且易产生耐药菌株。生物源农药防治环境友好且抗菌效果理想,被广泛关注。... 详细信息

桃褐腐病菌Monilinia fructicola可引起桃树等植物发生褐腐病(Brown rot disease),造成农业经济损失。目前,主要依赖化学杀菌剂防治桃褐腐病菌,化学防治污染环境且易产生耐药菌株。生物源农药防治环境友好且抗菌效果理想,被广泛关注。小檗碱(Berberine,BBR)是从传统中药黄连Coptis chinensis中提取的一种生物源农药,抑制桃褐腐菌效果显著(EC50=8μg/mL),但小檗碱抑制桃褐腐菌的机理未明。本研究将从以下四个方面,寻找小檗碱作用的靶标蛋白,探究小檗碱抑制桃褐腐菌的机理:(1)设计并成功合成了一种可点击的小檗碱探针,该探针包含炔基抓手,可在小檗碱与靶标蛋白结合后,通过Click反应,与报告基团生物素结合,以进行靶标蛋白富集。利用此探针,尝试对桃褐腐菌的蛋白靶标进行垂钓,探索反应条件,并对此探针所需中间体rBBR,BBR0的反应条件进行优化。利用响应面法优化了微波合成rBBR反应条件,微波温度190℃,微波时间7min,料液比为1:30时,rBBR产率最大。探索出使用NaH作为缚酸剂,BBR0合成效果最好。(2)为增强探针与靶标蛋白的结合亲和性,设计了一种可点击的二苯甲酮类小檗碱光亲和探针,该探针包含炔基抓手和二苯甲酮光亲和基团。其中,二苯甲酮光亲和基团可在350 nm波长光的照射下,与蛋白质C-H键之间形成稳定的共价键,保证探针与靶标蛋白的亲和性。探索了此探针所需中间体的合成方法,成功合成了 BBR1、BBR2、BBR3、A1、A2和C1。探究了两条BBR2合成路径,其中以1,2-二溴乙烷为反应物,BBR2产量较高且成本较低。A2为白色晶体,采用乙酸乙酯/石油醚重结晶的方法纯化,实验效率较高。(3)利用DARTS技术,寻找小檗碱对枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(G+)、肺炎克雷伯杆菌Klebsiella pneumoniae(G-)和酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae(Fungi)的靶标蛋白,探索酶解时间和酶添加量对此实验的影响,其中酶解时间15 min,蛋白酶与菌体蛋白浓度比例为1:250-1:1250时,电泳条带较好。(4)为验证候选靶标烯醇化酶(Enolase,ENO)功能,成功将载体pBI2300-ENO-HPH 转化至农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中,探究农杆菌介导的桃褐腐菌转化体系,对转化过程的共培养温度、共培养时间、诱导剂浓度和农杆菌浓度等条件进行了优化。

关键词：小檗碱桃褐腐菌探针 DARTS 靶标蛋白真菌转化