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基于表面增强拉曼光谱分析技术的真菌检测鉴别研究

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基于表面增强拉曼光谱分析技术的真菌检测鉴别研究

作者：李世芳重庆大学

学位级别：硕士

真菌在自然环境和人造环境中无处不在,它们对人类活动和健康具有巨大而深远的影响,其中有害真菌会对公众和经济健康构成重大威胁。临床上真菌感染已成为常见的感染性疾病之一,死亡率高达30%～60%。所以对真菌的检测鉴别方法研究受到广... 详细信息

真菌在自然环境和人造环境中无处不在,它们对人类活动和健康具有巨大而深远的影响,其中有害真菌会对公众和经济健康构成重大威胁。临床上真菌感染已成为常见的感染性疾病之一,死亡率高达30%～60%。所以对真菌的检测鉴别方法研究受到广泛关注。表面增强拉曼散射(SERS)能够产生高于拉曼效应10～10倍的增强信号,达到单分子检测所需的灵敏度。SERS技术因其具有快速、步骤简单、成本低、结果准确且样本损失较小等优点,近年来在生物医学领域中致病菌检测方面逐渐展现出巨大的应用潜力。本文研究工作及结果如下:(1)PDMS/Ag SERS基底的制备及真菌的SERS鉴别。通过化学自组装法将纳米银溶胶颗粒组装到PDMS表面,得到了PDMS/Ag SERS基底。基底具有较好的均一性和重复性,以罗丹明6G(R6G)为探针分子,对基底的SESR效能进行了测试,研究结果表示PDMS/Ag基底能检测到10 M的R6G溶液,其表观增强因子为3.88×10。在该基底上对白色念珠菌和烟曲霉进行了SERS测试,实验结果显示,在400～710 cm范围的拉曼信号被PDMS的拉曼峰掩盖而未能探测到有效信号,其仅能探测到白色念珠菌/烟曲霉在710～1700 cm范围的部分特征信号。针对收集的SERS谱图,实验采用主成分分析和线性判别结合(PCA-LDA)的分类模型,对白色念珠菌和烟曲霉进行了分类,PCA-LDA模型对于这两种真菌的分类正确率为97.5%,盲样测试正确率为90%。(2)Au NCs@Ni foam基底的制备及真菌的SERS检测。利用Au/Au(0.99V)的电极电位大于Ni/Ni(-0.25V)的电极电位,Ni与Au发生化学置换反应,通过调控CTAB的浓度和反应时间,使金在三维镍泡沫上生长形成独特的纳米锥结构作为SERS基底;通过优化发现,在20 mg/m L的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)存在下反应6 h获得的Au NCs@Ni foam基底具有较高的检测灵敏度,对R6G的检测极限达到10 M,表现增强因子为3.01×10,并且具有良好的均一性和重现性。进而在Au NCA@Ni foam纳米复合SERS基底上进行了白色念珠菌和烟曲霉SERS测试,通过图谱分析发现,发现白色念珠菌和烟曲霉在400?1700 cm波长范围内存在不同的拉曼信号峰,这些拉曼光谱信号主要体现为核酸、磷脂、蛋白质、碳水化合物和多糖的典型振动带的信息。针对收集的SERS谱图,实验采用PCA-LDA分类模型,对白色念珠菌和烟曲霉进行了分类,其分类正确率及盲样测试正确率都为100%。(3)基于SERS标签对白色念珠菌的定量检测。白色念珠菌是真菌感染中最常见的条件性真菌,它引起的念珠菌血症具有较高的死亡率,对白色念珠菌的高灵敏检测对临床诊断具有重要的意义。实验采用两步计时电流沉积技术制备了具有优异均一性和检测重现性的ITO-Ag纳米复合基底,通过Ag-S共价键将含巯基和羧基的11-巯基十一烷酸(MUA)分子链接在基底上,进行羧基功能化修饰,然后通过氨基与羧基间的共价键将白色念珠菌抗体固定在ITO-Ag基底上形成“ITO@nano-Ag-COOH-antibody”纳米复合SERS基底,用于白色念珠菌的捕获;采用Lee and Meisel法制备了纳米银溶胶,以纳米Ag颗粒作为增强介质,制备了抗体功能化的SERS标签(Ag@4-MBA@Antibody);通过形成Ag@4-MBA@Antibody标签/白色念珠菌/ITO@nano-Ag-COOH-antibody的“三明治”夹心复合物结构,对白色念珠菌进行定量检测。在浓度为10～10 CFU/L范围内,白色念珠菌浓度与表面增强拉曼散射信号强度呈良好的线性关系,对白色念珠菌的实际最低检出限为10 CFU/m L。本测试方法为白色念珠菌的定量检测提供了一种普适性的高效测试新途径。

关键词：真菌检测复合纳米增强微结构表面增强拉曼光谱多元统计分析

基于（1,3）-β-D-葡聚糖适配体荧光成像真菌检测研究

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基于（1,3）-β-D-葡聚糖适配体荧光成像真菌检测研究

作者：左鹏飞武汉大学

学位级别：硕士

随着威胁人类健康的真菌病原体数量不断增加以及感染率攀升,真菌感染已引起人们广泛关注。根据真菌所侵入组织深浅程度的不同,真菌感染主要分为浅部真菌感染与深部真菌感染。针对浅部真菌感染的检测方法主要有直接镜检法、真菌培养法以... 详细信息

随着威胁人类健康的真菌病原体数量不断增加以及感染率攀升,真菌感染已引起人们广泛关注。根据真菌所侵入组织深浅程度的不同,真菌感染主要分为浅部真菌感染与深部真菌感染。针对浅部真菌感染的检测方法主要有直接镜检法、真菌培养法以及新发展的分子诊断技术。这些检测方法当中,真菌培养法耗时长,分子诊断技术还未大规模应用,而镜检法中的荧光增白剂染色法,由于能简单快速地对真菌样本进行荧光成像,已广泛应用于真菌临床检测。但是该法存在特异性不足的问题。因此,需要开发特异性的真菌荧光成像检测方法。适配体作为人工体外筛选合成的单链核酸序列,能够以极高的特异性与靶标小分子、蛋白质、甚至细胞结合,在生物分析中具有很广阔的应用前景。借助靶向真菌细胞壁特征结构物质(1,3)-β-D-葡聚糖的适配体,能够实现真菌的特异性检测;但仅通过荧光染料修饰的适配体靶向真菌进行荧光成像,可能会因灵敏度较低,造成对检测结果的误判,所以在提高特异性的同时,还需要提高检测方法的灵敏度。基于此,本论文利用(1,3)-β-D-葡聚糖适配体特异性靶向真菌,并通过对适配体进行修饰,分别引入酶促酪胺信号放大技术以及基于无酶核酸扩增的杂交链式反应,构建了具有特异性、高灵敏度的真菌荧光成像检测方法。主要研究内容如下:(1)将(1,3)-β-D-葡聚糖适配体与酪胺信号放大技术相结合,开展真菌荧光成像检测研究。首先,借助点击化学反应,实现了(1,3)-β-D-葡聚糖适配体与辣根过氧化物酶的偶联;通过适配体特异性靶向真菌生物标志物(1,3)-β-D-葡聚糖,使得辣根过氧化物酶标记在真菌的细胞壁表面;加入生物素酪胺以及过氧化氢,在辣根过氧化物酶的催化作用下,生物素酪胺转变成酪胺自由基,与辣根过氧化物酶临近的细胞壁蛋白以及辣根过氧化物酶共价偶联,让生物素富集在真菌细胞壁表面;后续引入Cy3荧光染料标记的链霉亲和素,利用链霉亲和素与生物素的特异相互作用,让大量的Cy3标记在真菌细胞壁上,荧光信号得到增强,实现了高达6倍的荧光信号放大,可以在荧光显微镜下清晰观察到真菌的存在以及形态特征,为真菌检测提供形态学信息以及诊断信息。(2)前一章工作利用辣根过氧化物酶对酪胺底物进行催化,实现荧光信号放大。但是,蛋白酶易受到外在环境因素影响,使酶的活性降低,影响检测的准确性和重现性。鉴于此,本工作将(1,3)-β-D-葡聚糖适配体与基于无酶核酸扩增的杂交链式反应相结合,建立了一种无酶、便捷的高灵敏真菌荧光成像检测方法。通过(1,3)-β-D-葡聚糖适配体特异性靶向真菌细胞壁,将修饰在适配体一端的引发链标记在真菌细胞表面并引发杂交链式反应,使发夹探针交替杂交形成双链DNA产物,并携带上大量的ROX荧光染料,实现了5倍左右的荧光信号放大。该法在无酶催化及温和的条件下,能够更便捷、清楚地观察到真菌的形貌,进行高灵敏度的真菌荧光成像检测。

关键词：真菌检测 (1,3)-β-D-葡聚糖适配体荧光成像酪胺信号放大技术杂交链式反应

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博物馆空调系统微生物真菌污染检测研究

沈阳建筑大学学报（自然科学版） 2017年第1期33卷 152-158页

作者：李慧星孙昊冯国会杨婉凝沈阳建筑大学市政与环境工程学院辽宁沈阳110168

目的保证博物馆空调系统洁净运行,为博物馆及其文物提供洁净的空气环境.方法利用空气采样器对某博物馆空调系统中微生物-真菌浓度检测,研究分析真菌污染物的分布.结果测试表明,机组内积尘平均含量为16.71 g·m-2,多数展柜空气中真菌浓... 详细信息

目的保证博物馆空调系统洁净运行,为博物馆及其文物提供洁净的空气环境.方法利用空气采样器对某博物馆空调系统中微生物-真菌浓度检测,研究分析真菌污染物的分布.结果测试表明,机组内积尘平均含量为16.71 g·m-2,多数展柜空气中真菌浓度低于标准值,个别展柜空气中真菌浓度超标,达到600 cfu·m-3,为标准值(500 cfu·m-3)的1.2倍,其中青霉菌、曲霉菌为主要菌种;适宜的温度和较高的湿度均导致真菌污染物的快速滋生,且湿度对真菌污染物浓度影响程度较大.结论通过分析博物馆空气中真菌污染物主要来源,提出控制真菌的手段应采用优先控制湿度和微波法复合有效控制中央空调系统微生物真菌污染.

关键词：博物馆空调系统微生物污染真菌检测

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荧光染色法在真菌检测中的应用

中文科技期刊数据库（引文版）医药卫生 2022年第7期 0070-0072页

作者：梅倩云常州市第一人民医院检验科江苏常州213000

探讨KOH湿片法、真菌培养法和荧光染色法在真菌检测中的应用。方法本次研究进行观察分析,总计选取我院送检的浅部真菌感染皮损样本100例,包括皮屑57例、甲屑25例和毛发18例,所有样本一式三份,一份用于KOH湿片法,一份用于荧光染色法,一... 详细信息

探讨KOH湿片法、真菌培养法和荧光染色法在真菌检测中的应用。方法本次研究进行观察分析,总计选取我院送检的浅部真菌感染皮损样本100例,包括皮屑57例、甲屑25例和毛发18例,所有样本一式三份,一份用于KOH湿片法,一份用于荧光染色法,一份用于真菌培养法。记录三种检测方法下真菌的形态特征,对比三种检测方法的总阳性率。结果荧光染色法下背景呈灰蓝,菌丝及孢子呈明亮的蓝绿,菌丝结构清晰,油脂未染色,偶尔可见植物纤维呈蓝绿,但形态一般不规则、大小粗细不等,可以辨认。荧光染色法真菌检测总阳性率(95.00%),高于KOH湿片法(75.00%)和真菌培养法(76.00%),对比有统计意义(P真菌病检测阳性率(96.00%),高于KOH湿片法(56.00%)和真菌培养法(60.00%),对比有统计意义(P真菌培养法比,荧光染色法在真菌检测中有较高的阳性率,尤其在甲屑(甲真菌病)样本中,临床上可以根据实际情况来选择。

关键词： KOH湿片法真菌培养法荧光染色法真菌检测

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基于深度学习的真菌检测研究

基于深度学习的真菌检测研究

作者：王耕西安电子科技大学

学位级别：硕士

近年来,由于抗生素及免疫抑制剂在临床中的广泛使用,真菌感染的发病率逐年上升。目前,真菌的形态学检测手段仍依赖人工,并不能满足现阶段需求。因此,有关真菌检测的研究对真菌感染的及时发现和对症治疗有重要的现实意义。目前对真菌检... 详细信息

近年来,由于抗生素及免疫抑制剂在临床中的广泛使用,真菌感染的发病率逐年上升。目前,真菌的形态学检测手段仍依赖人工,并不能满足现阶段需求。因此,有关真菌检测的研究对真菌感染的及时发现和对症治疗有重要的现实意义。目前对真菌检测的研究多采用特征工程的方法。该类方法需要针对特定真菌的形态,通过人工设计提取特征信息对真菌进行分类识别。这些传统方法无论是在精度上,还是在适用性上都无法满足人们的要求。随着深度学习的发展和计算机性能的提高,通用目标检测的精度越来越高。在此背景下,本文以真菌显微图像数据集作为研究对象,研究基于深度学习的真菌检测算法。以协助真菌感染的临床诊断,提高真菌疾病的治愈率。本文针对真菌检测的目标特性提出平衡特征金字塔网络BFF-SSD,并使用注意力机制对其特征融合部分进行增强,实验结果证明该网络能有效提升真菌目标检测的精度。首先,针对真菌数据集中的不同目标尺度差异较大的问题设计了特征融合结构BFF模块。该模块利用SSD模型多个不同尺度的卷积特征图进行两次融合。第一次通过单向融合的方式将高语义的特征信息逐层融合至高分辨率的特征层,增强各卷积层特征的语义信息;第二次通过平衡特征融合的方式关注到非相邻层级中的语义信息,再次增强特征。在真菌数据集上的实验表明,与其它检测算法相比,BFF-SSD模型增强了网络对不同尺度目标的处理能力,提高了检测性能。其次,在对特征融合后的特征冗余和噪声问题进行分析后,提出了基于混合域注意力机制的特征增强模块FEA。该模块充分利用BFF-SSD网络结构中特征融合模块的层级特性,使用高层特征来约束相邻浅层特征的学习,通过空间域和通道域两个方面自适应地强化有用的信息,抑制噪声和冗余特征,进一步增强融合后特征层的表达能力。实验结果表明,与其他注意力模块相比,FEA模块对于BFF-SSD网络的提升更大。最后,在网络的预测模块,针对真菌数据集的特点调整了BFF-SSD模型的默认框生成比例,同时改进了模型的后处理算法。实验结果表明,对于默认框和后处理算法的改进有效地提升了检测的精度。

关键词：深度学习目标检测真菌检测

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真菌检测是确诊甲癣的金标准

医师在线 2017年第15期7卷 8-9页

作者：刘光金山东省新泰市中医院

今天看了一个患者，指甲增厚，变色，甲下有碎屑，怀疑是甲癣（俗称“灰指甲”）。跟诊的学生问道：“一切指甲变形，增厚的指甲都是甲癣吗？”我的解释是：

关键词：甲癣真菌检测金标准确诊灰指甲指甲变形增厚

荧光染色技术在肺活检组织真菌检测中的应用评价

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诊断病理学杂志 2019年第11期26卷 780-781,743页

作者：汤鸿张熔熔唐威无锡市第二人民医院病理科

近年来由于环境恶化和临床上激素、抗肿瘤药物、免疫抑制剂和抗生素的广泛使用以及侵入性操作的普遍开展,肺部真菌感染的发生率显著增加且已居深部真菌感染的首位[1]。侵袭性肺真菌病(IPFD)是各类肺真菌病中危害性最大,死亡率最高[2],... 详细信息

近年来由于环境恶化和临床上激素、抗肿瘤药物、免疫抑制剂和抗生素的广泛使用以及侵入性操作的普遍开展,肺部真菌感染的发生率显著增加且已居深部真菌感染的首位[1]。侵袭性肺真菌病(IPFD)是各类肺真菌病中危害性最大,死亡率最高[2],血液病患者是高危人群[3],数量众多伴有基础疾病的老年患者是易感人群[4]。通过在肺纤维支气管镜和经皮肺活检所采集的组织标本上进行病理组织学特殊染色明确病原体是诊断真菌感染的“金标准”,对临床治疗有重要意义[5-8]。

关键词： CFW 肺活检组织真菌检测 GMS PAS

不同检查方法在口腔黏膜病真菌检测中的应用研究

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中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 2021年第2期 0214-0215页

作者：贾贵芳张芳山西医科大学口腔医院口腔黏膜科山西太原030001

探究不同检查方法对口腔真菌的检出率,并分析口腔黏膜病患者的真菌感染情况。方法:选取2017年1月至2018年10月山西医科大学口腔医院临床诊断的OLP患者114例、BMS患者104例和健康志愿者98例分别为OLP组、BMS组和健康对照组。随机使用刮... 详细信息

探究不同检查方法对口腔真菌的检出率,并分析口腔黏膜病患者的真菌感染情况。方法:选取2017年1月至2018年10月山西医科大学口腔医院临床诊断的OLP患者114例、BMS患者104例和健康志愿者98例分别为OLP组、BMS组和健康对照组。随机使用刮舌板涂片、棉拭子涂片和棉拭子培养进行真菌检测,并对比分析真菌感染的检出率及诊断效能。结果:OLP组与BMS组刮舌板涂片的阳性率均高于棉拭子涂片和棉拭子培养的阳性率;刮舌板涂片、棉拭子涂片和棉拭子培养中刮舌板涂片真菌检查的检出率高于其他两种方法;OLP组和BMS患者的真菌感染的阳性率显著高于健康对照组,刮舌板涂片诊断方法的灵敏度、阳性预测值、一致率明显高于棉拭子涂片、棉拭子培养方法(P0.05)。结论:刮舌板真菌涂片法相对于棉拭子涂片法和棉拭子培养法检出率高,且快速、简便、准确。

关键词：口腔黏膜病真菌感染真菌检测应用研究

通用PCR法在痰标本真菌检测中的临床应用价值分析

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现代生物医学进展 2018年第24期18卷 4665-4668页

作者：施瑞洁弥鹏范芸李玲李博刘文康陕西省人民医院检验科陕西西安710068

目的:探讨通用PCR法在痰标本真菌检测中的临床应用价值。方法:选择2015年9月至2017年9月本院收治的免疫力低下患者178例作为研究资料,各收集痰标本2份,其中一份用于PCR扩增,另一份经培养后若观察到真菌或可疑菌落,则提取后在此进行PCR... 详细信息

目的:探讨通用PCR法在痰标本真菌检测中的临床应用价值。方法:选择2015年9月至2017年9月本院收治的免疫力低下患者178例作为研究资料,各收集痰标本2份,其中一份用于PCR扩增,另一份经培养后若观察到真菌或可疑菌落,则提取后在此进行PCR扩增测序。比较3种方法对真菌的检出情况、真菌阳性率,与组织病理学结果进行比较,分析3种方法的诊断效能。结果:178份痰标本经平板培养可观察到107份真菌生长,其余71份未见真菌生长。挑取真菌及可疑菌落行PCR结果显示阳性、阴性分别115、63份。对痰标本直接PCR结果显示,阳性、阴性分别124、54份。PCR扩增产物测序结果显示大多是白色念珠菌感染,仅3份是曲霉菌感染。内对照扩增验证结果显示有1份阴性标本存在扩增抑制现象。3种方法的真菌阳性率:直接PCR法>痰培养后PCR法>痰培养,但组间无显著差异(P>0.05)。3种方法诊断效能总体趋势:直接PCR法>痰培养后PCR法>痰培养,其中直接PCR法与痰培养后PCR法的特异度、准确度均显著高于痰培养法(P真菌检测中的临床应用价值较高,直接PCR具有操作简单、快速等优势。

关键词：通用PCR法痰标本真菌检测