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猪地方流行性肺炎减毒疫苗耐热剂型的初步研究

猪地方流行性肺炎减毒疫苗耐热剂型的初步研究

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作者：邹莹南京农业大学

学位级别：硕士

猪地方流行性肺炎是由猪肺炎支原体引起的慢性呼吸系统疾病,又称猪支原体肺炎或猪喘气病。该病感染不分季节,感染率极高,育肥患病猪和成年患病猪一般表现为隐性或慢性感染,母猪在妊娠后期可急性发作。病原的毒力因素主要存在于细胞膜表... 详细信息

猪地方流行性肺炎是由猪肺炎支原体引起的慢性呼吸系统疾病,又称猪支原体肺炎或猪喘气病。该病感染不分季节,感染率极高,育肥患病猪和成年患病猪一般表现为隐性或慢性感染,母猪在妊娠后期可急性发作。病原的毒力因素主要存在于细胞膜表面,在其定殖于呼吸道纤毛上皮后逐渐引起双侧对称性肺肉变,表现在临床症状上为严重程度不一的气喘。该病会导致猪饲料转化率低且继发他病时可致猪大量死亡,造成重大的经济损失。改善饲养管理结合全面免疫接种是净化猪地方流行性肺炎的关键技术。目前国内市场上供应的相关疫苗有各类进口灭活苗和国产减毒活疫苗,灭火苗价格昂贵、免疫程序较繁琐,购买不多。活疫苗均为冻干疫苗,需在—15℃及以下温度保存,经常面临无冷链运输和冷链中断疫苗失活的问题,故使用率也不高。本试验通过开发新型保护剂和优化真空冷冻干燥、真空泡沫干燥工艺,以期研制出可以在室温下稳定保存的猪地方流行性肺炎活疫苗。研究使用的主要试验方法有耐热保护剂配方、干燥程序参数的设计,配方的筛选,病原损伤机理验证和干燥程序参数的优化。制品评价的主要方法有外观形态筛选、37℃耐热性能粗测、残余水分测定、物理性质检测和保存期试验。本研究制备的疫苗外观合格,耐热性能良好,为进一步研究可室温存放的活疫苗提供了前期基础。试验Ⅰ猪地方流行性肺炎活疫苗耐热保护配方筛选耐热保护剂的应用不仅可以降低干燥工艺对抗原活性造成的损伤,更多是为了增加疫苗制备后的稳定性,延长在储存温度下的保存期。本章试验首先根据前期研究挑选出D6、D8两个冷冻干燥耐热保护配方,设计出 P1、P3、P6、P7、P8、T3、Z1、Z2、Z3、Z4、W1、W2、W3、W4、W5十五个泡沫干燥耐热保护配方。然后以弱化的猪肺炎支原体为研究对象,以耐热性能粗测结果(疫苗效价在37℃下存放10天后的耐热损失)作为主要依据,结合对疫苗外观形态和残余水分含量的评价,对上述配方进行初步筛选,得到基础配方D6、P7和Z4。再对基础配方进行单因素加减,配伍成D6、D6-1～D6-10十一个冻干耐热保护配方和不同高、中、低三个pH值组(pH6.4、6.7、7.2)P7、P7-1～P7-4、Z4、Z4-1～Z4-4三十个泡干耐热保护配方。以相同方法评价筛选出优化的配方D6、P7、P7-3X和P7-4X,它们对应疫苗在37℃下保存10天效价耐热损失分别为0.50LgCCU50/1.0mL、0.75LgCCU50/1.0mL、0 和 0.5LgCCU50/1.0mL。试验Ⅱ猪地方流行性肺炎耐热活疫苗的制备工艺优化本章试验首先通过TEM结合效价检测发现冷冻干燥和短时高渗环境会使Mhp形变但基本不影响活性,而泡沫干燥的玻璃化过程(即发泡阶段)对Mhp的结构完整性有较大影响,以此确定了工艺优化的思路。然后从改善外观和耐热性能两方面分别优化冷冻干燥和泡沫干燥工艺。通过对冷冻干燥预冻阶段优化和泡沫干燥发泡阶段优化,疫苗外观形态合格化。通过对二次干燥(稳定性干燥)阶段的重新设计,疫苗耐热性能得到提升。优化后D6配方冻干疫苗无干燥损失,37℃下存放10天耐热损失仅0.375 LgCCU50/***,P7-3X泡干疫苗干燥损失0.5 LgCCU50/1.0mL,37℃下存放30天无耐热损失。试验Ⅲ猪地方流行性肺炎耐热活疫苗的稳定性试验本试验首先对自制备的D6配方冷冻干燥耐热疫苗和P7配方泡沫干燥耐热疫苗进行了物理性质的检测(DSC、XRD、SEM),以验证是否达到理想剂型,并从物理性质反面对疫苗质量进行的初步评估。然后验证工艺的重复性,并以效价下降1.0LgCCU50/1.0mL为标准测定疫苗在较高存放温度下的保存期。物理检测结果表明,所得疫苗均为无定形态,Tg显著高于室温,性质稳定。保存期试验得到D6配方疫苗37℃保存期超过20天,在45℃下为12天。经典程序下的P7配方疫苗37℃保存期超出15天,45℃保存期超出9天,而15℃下超出59天无效价损失。SDⅣ程序下P7-3X配方疫苗在37℃存放59天耐热损失仅1.0LgCCU50/1.0mL,结果显著优于商品疫苗支必宁。

关键词：猪地方流行性肺炎真空泡沫干燥真空冷冻干燥耐热活疫苗

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