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人白细胞介素12双亚基共表达真核载体的构建

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湖南医科大学学报 2003年第4期28卷 338-342页

作者：羊东晔卢放根赵水平汤熙翔刘小伟吴小平中南大学湘雅二医院消化内科长沙410011 中南大学湘雅二医院心内科长沙410011 生生基因药物研究所长沙410008

目的 :为满足基因治疗的需要构建人白细胞介素 12 (hIL 12 )双亚基共表达质粒。方法 :先从人胚肾组织的逆转录产物中用PCR方法扩增出它的两个亚基P4 0 和P3 5的cDNA全长 ,分别克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+/ )中构建单亚基质粒———P(... 详细信息

目的 :为满足基因治疗的需要构建人白细胞介素 12 (hIL 12 )双亚基共表达质粒。方法 :先从人胚肾组织的逆转录产物中用PCR方法扩增出它的两个亚基P4 0 和P3 5的cDNA全长 ,分别克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+/ )中构建单亚基质粒———P(+) /P4 0 和P( ) /P3 5,然后再将二者串联克隆入真核表达载体 pcDNA3.1(+)中得到P(+) /IL 12质粒。脂质体转染HepG2后 2 4,48hELISA检测细胞培养上清内hIL 12蛋白质表达。结果 :P(+) /IL 12质粒经酶切和测序证明两亚基连接方向正确 ,序列无突变 ;ELISA检测细胞上清结果证实可表达hIL 12蛋白质。结论 :成功构建P4 0 和P3 5双亚基真核共表达质粒———P(+) /IL 12 ,为模拟hIL 12生理表达方式 ,简化hIL 12基因治疗操作奠定了基础。

关键词：人白细胞介素12 双亚基表达真核载体克隆

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反义VEGF165真核载体的构建

第二军医大学学报 2003年第1期24卷 108-109页

作者：王建华吴岳嵩黄盛东姜春鹏广州军区总医院骨科广州510010 第二军医大学长海医院骨科长海医院胸心外科实验室东北林业大学免疫学教研室

以质粒 pc DNA3.1为载体 ,将血管内皮基因 (VEGF) 16 5 c DNA片段反向插入得到反义 VEGF16 5真核表达载体 ,经过酶切电泳和基因测序证实获得的载体插入方向正确。

关键词：真核载体构建血管内皮生长因子反义核酸

人Lipocalin型前列腺素D合成酶真核载体的构建及酵母表达菌株的建立

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中华男科学杂志 2003年第2期9卷 111-114页

作者：高云黄宇烽夏欣一马百坤南京医科大学免疫学与病原生物学学系江苏南京210029 南京军区南京总医院生殖遗传研究室江苏南京210002

目的 :在毕赤酵母中表达人睾丸Lipocalin型前列腺素D合成酶 (L PGDS) ,以利于生物学功能及临床应用研究。　方法 :用PCR的方法从质粒pGEX 2T htL PGDS上扩增出人睾丸L PGDS基因编码序列 ,构建该基因的酵母表达质粒 ;将表达质粒电转化毕... 详细信息

目的 :在毕赤酵母中表达人睾丸Lipocalin型前列腺素D合成酶 (L PGDS) ,以利于生物学功能及临床应用研究。　方法 :用PCR的方法从质粒pGEX 2T htL PGDS上扩增出人睾丸L PGDS基因编码序列 ,构建该基因的酵母表达质粒 ;将表达质粒电转化毕赤酵母 ,甲醇诱导L PGDS的表达。　结果 :PCR扩增的L PGDS成熟肽基因编码序列克隆T载体后 ,经测序证明与所报道的人睾丸L PGDScDNA完全一致。对培养上清进行SDS PAGE分析显示 ,在相对分子质量为 2 70 0 0处有重组蛋白的表达 ,与理论值完全一致。　结论 :人Lipocalin型前列腺素D合成酶在毕赤酵母中获得了高效。

关键词：人Lipocalin型前列腺素D合成酶真核载体临床应用毕赤酵母

人Foxp3基因真核载体的构建及在CD4^+CD25^-T细胞中的表达和功能

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实用医学杂志 2011年第18期27卷 3279-3282页

作者：彭克军王秋林张庆莲段佳慧郑崛村成都医学院检验医学院 610083 成都医学院第一附属医院心内科 610500

目的:构建人Foxp3基因的真核表达载体并转染人CD4+CD25-T细胞,观察其在CD4+CD25-T细胞中的表达及功能。方法:构建人Foxp3基因pEGFP-N1真核表达载体,经酶切及双向测序鉴定基因序列的正确性。通过电穿孔法将重组载体转入人CD4+CD25-T细胞... 详细信息

目的:构建人Foxp3基因的真核表达载体并转染人CD4+CD25-T细胞,观察其在CD4+CD25-T细胞中的表达及功能。方法:构建人Foxp3基因pEGFP-N1真核表达载体,经酶切及双向测序鉴定基因序列的正确性。通过电穿孔法将重组载体转入人CD4+CD25-T细胞中,利用荧光显微镜及流式细胞术检测转染效率,采用3H-TdR掺入法检测转染细胞对单个核细胞增殖能力的影响。结果:酶切及测序鉴定pEGFP-N1-Foxp3重组质粒基因序列完全正确,转染的CD4+CD25-T细胞Foxp3阳性表达率为23.7%,并显著抑制了单个核细胞的增殖能力。结论:成功构建了pEGFP-N1-Foxp3真核表达载体,并使转染的CD4+CD25-T细胞具有调节性T细胞的功能。

关键词： Foxp3 真核载体转染 CD4+CD25-T细胞

PLptn真核载体的构建表达及其趋化活性测定

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中国兽医杂志 2010年第7期46卷 22-24页

作者：柳超蒋朋飞曹金锁张德礼西北农林科技大学动物医学院病毒免疫与生物信息研究室陕西杨凌712100

趋化因子是一种能够趋化和活化白细胞的细胞因子,在炎症和免疫反应中发挥着重要的作用,现在发现的趋化因子有CXC,CC,CX3C和C共四族。淋巴细胞趋化因子(Lptn)为趋化因子C家族成员,[第一段]

关键词：趋化因子真核载体活性测定细胞因子免疫反应淋巴细胞白细胞炎症

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SV40病毒T抗原真核载体的构建与表达

中华医院感染学杂志 2006年第3期16卷 256-259页

作者：王鹰邓军杨希川郝飞第三军医大学西南医院重庆400038

目的设计、构建SV40病毒T抗原真核表达载体,并导入真核细胞进行表达鉴定。方法采用重叠延伸拼接法,从pUC19-SV40载体中亚克隆切除内含子的SV40病毒T抗原基因全长片段,EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后定向克隆至pEGFP-N1真核表达载体上,酶切鉴定... 详细信息

目的设计、构建SV40病毒T抗原真核表达载体,并导入真核细胞进行表达鉴定。方法采用重叠延伸拼接法,从pUC19-SV40载体中亚克隆切除内含子的SV40病毒T抗原基因全长片段,EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后定向克隆至pEGFP-N1真核表达载体上,酶切鉴定重组质粒;用脂质体转染的方法将构建的载体导入原代培养的正常人成纤维细胞进行表达,检测SV40病毒T抗原基因在成纤维细胞内的表达。结果SV40病毒T抗原基因成功克隆至pEGFP-N1真核表达载体中;转染成纤维细胞提取基因组DNA及总RNA,分别经PCR和RT-PCR反应扩增出288 bp的特异性片段。结论本试验构建的SV40病毒T抗原重组质粒为利用SV40T抗原进行真核细胞研究提供了稳定、可靠的分子工具。

关键词： SV40病毒 T抗原真核载体表达

蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B真核载体的构建及对K562细胞的影响

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广东医学 2005年第10期26卷 1353-1355页

作者：郭天剑杜庆锋周淑芸南方医科大学南方医院血液科广州510515

目的初步研究作为p210负性调控物的PTP1B,探讨其对K562细胞凋亡、红系分化的影响。方法应用RT-PCR法克隆PIP1B全长cDNA序列并定向亚克隆于真核表达载体pcDNA3.0,应用脂质体转染技术使PTP1B在K562细胞中过表达。结果PTP1B在K562细胞中出... 详细信息

目的初步研究作为p210负性调控物的PTP1B,探讨其对K562细胞凋亡、红系分化的影响。方法应用RT-PCR法克隆PIP1B全长cDNA序列并定向亚克隆于真核表达载体pcDNA3.0,应用脂质体转染技术使PTP1B在K562细胞中过表达。结果PTP1B在K562细胞中出现超表达并具有较高PIP活性。转染48 h后,K562 细胞凋亡不明显,Annexin V-PI双标后FAcs分析细胞凋亡率为7.54%,与转染空载体(6.44%)相比,差异无显著性。PTP1B基因转染后细胞出现明显红系分化,联苯胺染色细胞阳性率(28.67±1.25)%,GPA表达率为43.15%, 与转染空载体组(3.34±1.25)%和12.88%比较显著提高。结论应用RT-PCR法可以成功克隆出PTP1B基因全长cDNA序列,脂质体法能有效地将pcDNA3-PTP1B转入K562细胞并表达。PTP1B能诱导K562细胞出现明显红系分化,但对细胞的凋亡无明显影响。

关键词：慢性髓性白血病 K562细胞株蛋白酪氨酸磷酸酶红系分化 K562细胞凋亡 PTP1B 真核载体脂质体转染技术 RT-PCR法 cDNA序列

新孢子虫NcGRA7与NcGRA2串联基因的真核载体构建与体外瞬时表达

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中国兽医学报 2018年第9期38卷 1731-1734页

作者：金春梅胡楠蔡锦顺于龙政延边大学农学院动物医学系

本研究为构建新孢子虫NcGRA7与NcGRA2串联基因的真核表达载体,以SOE-PCR技术得到新孢子虫NcGRA7-NcGRA2串联基因,并先克隆到pMD-19T载体上,经测序未发现移码后,再克隆到pDNA3.1载体上,用IFA进行体外瞬时表达的鉴定。结果表明,pDNA3.1-Nc... 详细信息

本研究为构建新孢子虫NcGRA7与NcGRA2串联基因的真核表达载体,以SOE-PCR技术得到新孢子虫NcGRA7-NcGRA2串联基因,并先克隆到pMD-19T载体上,经测序未发现移码后,再克隆到pDNA3.1载体上,用IFA进行体外瞬时表达的鉴定。结果表明,pDNA3.1-NcGRA7-NcGRA2串联基因的真核表达载体构建成功,在体外真核细胞内能表达外源蛋白。

关键词：新孢子虫串联基因真核载体

布鲁氏菌Omp19基因真核载体的构建及对细胞免疫的影响

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中国病原生物学杂志 2016年第2期11卷 122-125页

作者：印双红张俊波王浩黄啸冉辉罗静陆安法郭飞陈创夫铜仁学院护理学院贵州铜仁554300 铜仁学院生物与农林工程学院贵州铜仁554300 石河子大学医学院新疆石河子832000 铜仁市动物疫病防控中心贵州铜仁554300 石河子大学动物科技学院新疆石河子832000

目的了解羊种布鲁氏菌Omp19基因在真核细胞中的表达和对细胞免疫的影响。方法根据GenBank公布的羊布鲁氏菌16M株外膜蛋白Omp19基因序列设计1对引物,以其全基因组为模板进行扩增,Omp19基因扩增片段连接pMD18-T载体,转染及测序鉴定正确后... 详细信息

目的了解羊种布鲁氏菌Omp19基因在真核细胞中的表达和对细胞免疫的影响。方法根据GenBank公布的羊布鲁氏菌16M株外膜蛋白Omp19基因序列设计1对引物,以其全基因组为模板进行扩增,Omp19基因扩增片段连接pMD18-T载体,转染及测序鉴定正确后进行双酶切,构建重组质粒pLEX-MSC-Omp19,转染巨噬细胞RAW264.7中,用Western blot分析Omp19基因在巨噬细胞内的表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测转染Omp19基因的细胞干扰素-γ(IFN-γ)和IL-6分泌的影响。结果获得534bp目的基因片段并成功构建Omp19真核表达载体,Omp19基因在巨噬细胞内成功表达,表达蛋白Omp19可显著提高细胞分泌IFN-γ和IL-6水平(P<0.01)。结论 Omp19基因表达产物在细胞内具有免疫原性,能提高细胞免疫水平,可作为亚单位疫苗候选基因。

关键词：布鲁氏菌 omp19基因真核载体细胞免疫