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直接测序法检测结肠癌K-ras基因的灵敏度确认及评估

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山东医药 2011年第11期51卷 31-33页

作者：张树鹏赖仁胜林路加谢玲杜益群吴晓斌赵苏苏南京中医药大学南京210029 南京中医药大学附属医院江苏省中医院新加坡默克雪莱诺公司亚太区肿瘤临床开发部

目的探讨直接测序法检测K-ras基因的灵敏度及可行性。方法用已知K-ras基因突变型及野生型细胞株DNA按比例混合,用直接测序法检测K-ras基因突变情况,对实验敏感度进行评估。结果正反向测序结果均显示,含突变型K-ras基因DNA 5%的5个复孔中... 详细信息

目的探讨直接测序法检测K-ras基因的灵敏度及可行性。方法用已知K-ras基因突变型及野生型细胞株DNA按比例混合,用直接测序法检测K-ras基因突变情况,对实验敏感度进行评估。结果正反向测序结果均显示,含突变型K-ras基因DNA 5%的5个复孔中,均未能明确检出突变,而含突变型基因DNA≥10%的所有样本及其复孔都检测出了突变;突变型的基因碱基T峰与野生型的对应碱基G峰的比例,各组间有明显差异(P均直接测序法检测突变型DNA,当敏感度为10%时,特异性达到100%,且电泳图上突变峰与野生峰的高低比例可对细胞比例进行半定量评估,可以满足临床检测与研究。

关键词：肠肿瘤基因检测直接测序法灵敏度

应用直接测序法对食管癌组织中MT-2A基因突变状况的研究

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应用直接测序法对食管癌组织中MT-2A基因突变状况的研究

作者：张翼飞河北医科大学

学位级别：硕士

目的：河北省中南部食管癌的发病率居世界之首，食管癌对放疗和化疗均不敏感，因此目前的治疗措施以手术为主。因此，通过各种基础研究，探索食管癌的病因和发病机制，有助于食管癌的早发现、早诊断、早治疗，同时在评估食管癌患者的预... 详细信息

目的：河北省中南部食管癌的发病率居世界之首，食管癌对放疗和化疗均不敏感，因此目前的治疗措施以手术为主。因此，通过各种基础研究，探索食管癌的病因和发病机制，有助于食管癌的早发现、早诊断、早治疗，同时在评估食管癌患者的预后方面，都有着积极的意义。MT是细胞放化疗"解毒"的主要防线，在食管癌中明显高表达，且不同的金属硫蛋白（Metallothineins, MTs）亚型呈现不同的高表达规律。种种迹象表明，这一高表达很可能与基因突变有关，本研究选取食管癌患者，手术获得其肿瘤及正常组织对照，提取DNA，对MT-2A的基因的三个外显子区进行聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction, PCR）扩增，获得相关目的基因的相关基因序列。通过直接测序法得到扩增基因序列，而后将所得结果进行分析，并同人类基因组计划基因比对，寻找有无目的基因突变点存在，以研究MT蛋白编码区是否存在能够导致编码蛋白改变的基因突变。方法：1新鲜食管癌组织和正常食管粘膜组织的获得。收集2010年5月-2011年12月在河北医科大学第四医院胸外科手术的36例食管癌患者的食管癌标本和癌旁正常组织。其中男性24例，女性12例，年龄范围在37-71岁，平均年龄63岁。手术获得新鲜食管癌组织，选取距癌缘5cm以上的食管“正常”粘膜组织作为正常对照。采集组织过程在低温环境下进行，采集后标号并投入液氮保存备用。待术后病理证实为食管鳞状细胞癌的标本入组研究。 2将所采集组织切割大小约0.5×0.5×0.5mm的组织制作蜡块。将蜡块切片后行HE染色，确定采集标本为所取组织。 3组织DNA提取。切割部分标本行HE染色后，剩余标本采用饱和NaCl法提取组织DNA。将所提取DNA用去离子水溶解，应用分光光度计获得其浓度及纯度-20℃保存备用。 4引物设计。应用NCBI查询获得MT-2A外显子区域DNA序列，委托上海生工代为设计引物，经Blast确定引物特异性符合实验要求后合成引物。 5目的基因的扩增。根据引物合成报告单推荐退火温度上下浮动2-3℃进行预实验摸索最佳退火温度。根据预实验所得条件进行目的基因的PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳确认扩增效果并判断基因突变可能。 6目的基因的直接测序和结果分析。PCR扩增后得到目的基因经琼脂糖凝胶电泳确认后送生工生物工程（上海）有限公司，委托其对扩增产物进行正反链同时测序，在两个序列完全吻合情况下，能够确保100%可靠。最终得到扩增片段的具体序列。而后将所得结果进行分析，并同人类基因组计划基因比对，寻找有无目的基因突变点存在。结果：1所有临床采集标本经HE染色确认，食管癌组织均为食管鳞癌组织，“正常”食管粘膜组织均不含食管癌组织成分。 2肿瘤组织与正常组织DNA经PCR后，所得产物电泳后均可出现目的条带，条带单一清晰，位置一致，说明各组织DNA中的引物设计区域无突变存在，上下游引物区间未有插入或缺失基因片段。 3经基因测序检测，全部食管癌组织和正常组织标本中均未发现MT-2A的DNA外显子区域存在碱基点突变表现。 4发现MT-2A外显子1上游存在一个A/G多态位点，在所有36例患者中，31例不存在该多态位点，5例存在该多态位点，且在癌组织和正常组织中均存在该多态位点。比对人类基因组计划基因库后，证实该多态位点存在。同NCBI数据对比，应用卡方检验分析证实两者无差别（P=0.098）。结论：食管癌患者的食管癌组织中MT-2A的DNA序列呈现出高度保守的现象，即在食管癌组织中未发现能够导致MT-2A编码蛋白改变的DNA突变存在。由此我们认为造成食管癌组织中MT-2A蛋白的蓄积的原因可能是其降解下调造成的，其具体原因有待进一步实验解释。而外显子1的上游区域突变位点对于MT-2A基因的转录、MT-2A蛋白质表达是否有影响，以及其与患者预后之间有无关联仍需进行深入研究。

关键词：食管癌金属硫蛋白直接测序法基因突变多态性

直接测序法与克隆测序法在单核苷酸多态性检测中的比较

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贵阳医学院学报 2006年第1期31卷 18-20页

作者：张婷单可人李毅何燕齐晓岚赵艳谢渊吴昌学任锡麟官志忠贵阳医学院分子生物学重点实验室贵州贵阳550004

目的：了解PCR产物直接测序法与克隆测序法在单核苷酸多态性（SNP）检测上的差别。方法：对2型糖尿病患者的载脂蛋白J外显子2基因及旁侧进行聚合酶链反应（PCR）扩增，分别对其产物进行直接测序和克隆测序。结果：在样本的检测中，PCR... 详细信息

目的：了解PCR产物直接测序法与克隆测序法在单核苷酸多态性（SNP）检测上的差别。方法：对2型糖尿病患者的载脂蛋白J外显子2基因及旁侧进行聚合酶链反应（PCR）扩增，分别对其产物进行直接测序和克隆测序。结果：在样本的检测中，PCR产物直接测序法所测序列与43～60bp以后克隆测序相同；检出一个突变位点并与GenBank（DQ012938）发表序列一致。结论：PCR产物直接测序法和克隆测序法都是检测SNP的有效方法，但前者不仅特异性强，敏感度高，而且比克隆测序方法更为快速简便，节省材料。

关键词：载脂蛋白类多态性单核苷酸糖尿病非胰岛素依赖型聚合酶链反应直接测序法克隆测序法

直接测序法检测结肠癌患者K-ras基因的灵敏度及其临床价值

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中国现代医生 2018年第17期56卷 128-131页

作者：杨丽君孙倩万晓晨浙江医院检验科浙江杭州310013

目的探讨结肠癌患者应用直接测序法测定K-ras基因的灵敏度及其临床价值。方法选取我院2016年2月～2017年4月收治的结肠癌患者80例,随机分为研究组和对照组两组,研究组患者通过直接测序法、对照组患者通过sanger测序法检测患者体内的K-ra... 详细信息

目的探讨结肠癌患者应用直接测序法测定K-ras基因的灵敏度及其临床价值。方法选取我院2016年2月～2017年4月收治的结肠癌患者80例,随机分为研究组和对照组两组,研究组患者通过直接测序法、对照组患者通过sanger测序法检测患者体内的K-ras基因突变情况,分析K-ras基因突变率与患者肿瘤大小、肿瘤部位、患者年龄等一般资料之间的相关性。结果研究组患者测定K-ras基因突变的灵敏度明显高于对照组(P直接测序法检测结肠癌患者K-ras基因的突变情况具有较高的灵敏度,直接测序法的检出率与患者的肿瘤大小、肿瘤分化程度以及患者的年龄等存在较强的相关性,对于临床上结肠癌等恶性肿瘤疾病的诊断具有较强的应用价值,值得临床上广泛推荐使用。

关键词：结肠癌直接测序法 K-ras基因灵敏度临床价值

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直接测序法证明ABO基因变异1例

中国法医学杂志 2003年第1期18卷 52-53页

作者：朱晓君刘雅诚马万山唐晖程丽北京市公安局法医检验鉴定中心北京100085 四川大学基础与法医学院四川成都610041

1案情介绍2002年6月,北京市某网吧发生纵火案,造成24人死亡.因尸体严重炭化,失去外貌辨认条件,均需进行DNA检验确定尸源.

关键词：直接测序法 ABO基因变异 STR RFLP 序列分析

质谱法与直接测序法检测HBV P基因耐药突变的比较研究

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质谱法与直接测序法检测HBV P基因耐药突变的比较研究

作者：肖婷中南大学

学位级别：硕士

目的：用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS)和PCR产物直接测序法两种方法检测乙型肝炎病毒P基因耐药位点的突变情况,并进行比较分析,进一步证实MALDI-TOF MS是一种快速、早期、准确发现核苷(酸)类药物治疗后耐药位点的... 详细信息

目的：用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS)和PCR产物直接测序法两种方法检测乙型肝炎病毒P基因耐药位点的突变情况,并进行比较分析,进一步证实MALDI-TOF MS是一种快速、早期、准确发现核苷(酸)类药物治疗后耐药位点的检测方法。方法：1、病例来源：(1)研究组：收集90例服用拉米夫定等核苷(酸)类药物治疗1年以上,HBV-DNA仍大于500copies/ml的慢性乙型病毒性肝炎患者血清,并根据核苷(酸)类药物用药情况分为6个组。(2)对照组：同时收集10名HBsAg阳性时间超过6个月,肝功能正常,HBV-DNA>1×105 copies/ml,始终未予抗病毒治疗的慢性乙型病毒性肝炎患者的血清作为对照组。2、检测方法：(1)采用MALDI-TOF MS检测HBV P基因已知11个变异位点的变异情况;基于SEQUENON公司质谱仪及配套芯片-试剂盒技术,通过TYPE4.0软件分析结果。(2)PCR产物直接测序法采用ABI3730XL测序仪,通过SequenceNavigator软件分析得出序列。结果：1、两种方法检出结果比较：在服用拉米夫定等核苷(酸)类药物的90例病例血清中,MALDI-TOF MS测得53例耐药变异的病例,共86个耐药突变位点,PCR产物直接测序法仅检测出19例耐药变异的病例,共29个耐药突变位点,MALDI-TOF MS检出数明显高于直接测序法,两者间的差异有统计学意义(P法均没有发现已知的耐药变异位点。2、两种方法检测DNA的灵敏性比较：HBV-DNA水平在500-1000copies/ml的12例血清中,MALDI-TOF MS测得6例出现耐药变异位点,检出率50%,而PCR产物直接测序法在此病毒水平下未检出耐药变异位点;在相同的HBV-DNA水平下,MALDI-TOF MS变异检出数(率)均高于PCR产物直接测序法,两者间的差异有统计学意义(P直接测序法;2、MALDI-TOF MS对已知耐药位点的检出的DNA灵敏性高于PCR产物直接测序法。3、MALDI-TOF MS准确性高,检测到已知耐药位点和实际用药耐药位点的相符率高。4、MALDI-TOF MS是为服用核苷(酸)类药物治疗效果不佳或者反弹的患者提供早期、灵敏、准确的发现已知南药位点的检测方法,可以为临床医生及时更改治疗方案提供帮助。

关键词：乙型肝炎病毒基因突变直接测序法质谱法核苷(酸)类药物

直接测序法和ARMS法检测非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因突变的比较

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中国肺癌杂志 2014年第8期17卷 606-611页

作者：李辰晨吴建中王卓冯继锋南京医科大学附属江苏省肿瘤医院临床肿瘤实验中心南京210009 南京医科大学附属江苏省肿瘤医院内科南京210009

背景与目的以表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)为靶点治疗非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是现在治疗肺癌的前沿手段,因此检测EGFR是否突变成为治疗肺癌的关键一步。本研究旨在探讨直接测序法... 详细信息

背景与目的以表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)为靶点治疗非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是现在治疗肺癌的前沿手段,因此检测EGFR是否突变成为治疗肺癌的关键一步。本研究旨在探讨直接测序法和ARMS法检测NSCLC患者的EGFR基因突变情况及检出率。方法收集自2012年4月-2013年6月本中心接受进行EGFR基因突变检测的NSCLC患者,分别用直接测序法和ARMS法对这些患者的肿瘤组织标本进行检测,检测其中EGFR基因第18-21外显子的突变情况,并比较两者方法的优劣。结果在该451例两种方法均检测的患者中,两种方法均检测到突变且突变结果一致者127例,结果不一致者5例,均无突变者186例,直接测序法检测到突变而ARMS法未检测到突变者50例,反之83例。50例中有33例为ARMS法29种突变之外的突变。直接测序法检测的突变率为40.4%,ARMS法检测的突变率为47.7%,ARMS法的突变检出率明显高于直接测序法(P法的突变检出率59.80%明显高于直接测序法41.67%(P法无统计学差异(P=0.083)。结论直接测序法和ARMS法检测EGFR基因突变基本一致,ARMS法更为灵敏,且操作方便快捷,但是价格昂贵。对于肿瘤组织含量较少的样本中,ARMS法更为敏感,明显优于直接测序法。直接测序法可以检测到ARMS试剂盒内不包含的少见突变。结合两种方法检测结果更为可靠全面。

关键词： EGFR基因突变直接测序法 ARMS法肺肿瘤

INNO-LiPA和直接测序法检测HBV耐药突变的比较

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热带医学杂志 2012年第7期12卷 793-795,802页

作者：郑慧珂周彬何海棠吕国涛刘美三孙剑侯金林南方医科大学南方医院感染内科广东广州510515

目的比较INNO-LiPA HBV DRv2和直接测序法检测HBV耐药突变的准确性和灵敏性。方法选取41例接受阿德福韦或聚乙二醇干扰素α-2a救援治疗并在治疗过程中(治疗48周和72周时)进行INNO-LiPA HBV DRv2耐药检测的拉米夫定耐药患者,共收集到101... 详细信息

目的比较INNO-LiPA HBV DRv2和直接测序法检测HBV耐药突变的准确性和灵敏性。方法选取41例接受阿德福韦或聚乙二醇干扰素α-2a救援治疗并在治疗过程中(治疗48周和72周时)进行INNO-LiPA HBV DRv2耐药检测的拉米夫定耐药患者,共收集到101份足量的血清,采用直接测序法进行拉米夫定和阿德福韦耐药检测。分析HBV聚合酶第80、173、180、181、204和236位点的耐药突变情况,并与INNO-LiPA耐药检测的结果进行对比。结果 INNO-LiPA HBV DRv2和直接测序法检测204位点耐药结果对比,完全符合率为73.8%(62/84),部分符合率为23.8%(20/84),总体符合率达到97.6%(82/84)。其他位点总体符合率也多在95%以上。另外INNO-LiPA比直接测序法有更高的灵敏度,对混合感染的检出率(46.4%)明显高于直接测序法(23.8%),其总体耐药检出率也高于直接测序法。结论 INNO-LiPA方法在灵敏度和准确性上均优于直接测序法,而且操作简便、快捷,能够提供更多的信息量,在科研和临床上都有很好的应用前景。

关键词：乙型病毒性肝炎耐药突变线性探针技术直接测序法

荧光定量分型PCR法与直接测序法检测HBV-DNA水平的应用价值比较

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中外医疗 2014年第30期33卷 34-35页

作者：刘青黄河中心医院检验科河南郑州450003

目的比较荧光定量分型PCR法与直接测序法检测HBV-DNA水平的应用价值。方法选取该院2012年1月—2013年12月收治的126例符合入选标准的HBV患者,分别采用荧光定量分型PCR法与直接测序法检测HBV-DNA水平,对HBV-DNA基因分型结果进行比较分析... 详细信息

目的比较荧光定量分型PCR法与直接测序法检测HBV-DNA水平的应用价值。方法选取该院2012年1月—2013年12月收治的126例符合入选标准的HBV患者,分别采用荧光定量分型PCR法与直接测序法检测HBV-DNA水平,对HBV-DNA基因分型结果进行比较分析。结果 126份样本只检测出3种基因分型(B型、C型、B/C混合型),其中B型占明显优势。荧光定量分型PCR法B/C混合型检出率明显高于直接测序法(P法的一致性较好(Kappa>0.75);TA克隆结果与荧光定量分型PCR法一致。结论荧光定量分型PCR法检测HBV-DNA水平应用价值较直接测序法高,值得临床推广应用。

关键词：荧光定量分型PCR法直接测序法 HBV-DNA