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伯克霍尔德菌脂肪酶LipA盖子结构置换对其底物特异性的影响

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伯克霍尔德菌脂肪酶LipA盖子结构置换对其底物特异性的影响

作者：叶菲福建师范大学

学位级别：硕士

为了探究脂肪酶盖子结构域对其催化底物特异性的影响,本研究将Burkholderia sp. ZYB002菌株脂肪酶LipA活性中心上方的α-螺旋盖子结构,分别与Ophiostoma piceae胆固醇酯酶(OPE)、 Candida rugosa脂肪酶Lip2和C. rugosa脂肪酶Lip3的对应... 详细信息

为了探究脂肪酶盖子结构域对其催化底物特异性的影响,本研究将Burkholderia sp. ZYB002菌株脂肪酶LipA活性中心上方的α-螺旋盖子结构,分别与Ophiostoma piceae胆固醇酯酶(OPE)、 Candida rugosa脂肪酶Lip2和C. rugosa脂肪酶Lip3的对应结构域进行置换,构建出五个脂肪酶LipA的突变体,并进行了脂肪酶突变体的纯化及酶学性质的初步分析。具体实验结果如下：1、以Burkholderia cepacia脂肪酶LipA的3D结构模型(PDB登入号：3LIP)为模板,模拟构建出Burkholderia sp. ZYB002菌株脂肪酶LipA的三维结构模型;将该脂肪酶LipA的盖子结构分别置换为OPE、Lip2和Lip3的对应盖子结构域,经评估后获得了5个盖子结构置换突变体模型,依次命名为：BCL-LOPE1、BCL-LO PE2、BCL-LLip2、BCL-LLip31 和 BCL-LLip32。2、针对上述突变体模型,依次设计引物,利用重叠延伸PCR技术,构建上述5个脂肪酶突变体的突变基因序列,并测序验证。3、经过His Trap FF亲和柱和Hi Trap DEAE FF离子交换柱两步纯化得到纯化后的野生型脂肪酶 LipA/LipB复合物。突变体脂肪酶采用His Trap FF亲和柱和Hi Trap henyl FF (low sub)疏水柱两步纯化程序,获得了纯化后的4个脂肪酶突变体的LipA/LipB复合物(脂肪酶突变体BCL-LLip32的LipA/LipB复合物未能获得)。4、测定了野生型脂肪酶LipA与4个脂肪酶突变体粗酶水解4一硝基苯月桂酸酯的K和 Vmax (BCL-Llip32旨肪酶突变体未能进行检测)。试验结果表明：脂肪酶突变体BCL-LOPE2的‰为0.14±0.03 mmol/L,而野生型脂肪酶LipA的K为0.17±0.03mmol/L,其余脂肪酶突变体的K均高于野生型,较野生型脂肪酶LipA与底物的亲和性弱。4个突变体脂肪酶的最大反应速度V均有所降低。

关键词： Burkholderia sp.ZYB002脂肪酶LipA 盖子结构突变底物特异性

盖子区域氨基酸的定点突变对T1脂肪酶酶学性质的影响

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生物技术通报 2020年第11期36卷 94-102页

作者：朱彩林吕祥夏小乐工业生物技术教育部重点实验室江南大学无锡214122

T1脂肪酶来源于Geobacillus zalihae菌株,常作为生物催化剂广泛应用于各领域。为了综合改善T1脂肪酶的酶学性质,前期通过对该酶盖子结构进行理性设计得到3个效果较好的突变体L188M、A190L、A190Y,在此基础上,将单点突变体进行组合得到L1... 详细信息

T1脂肪酶来源于Geobacillus zalihae菌株,常作为生物催化剂广泛应用于各领域。为了综合改善T1脂肪酶的酶学性质,前期通过对该酶盖子结构进行理性设计得到3个效果较好的突变体L188M、A190L、A190Y,在此基础上,将单点突变体进行组合得到L188M/A190L和L188M/A190Y两个复合突变体。在该实验中对突变体脂肪酶酶学性质展开研究,同时将单点与组合突变效果进行比较。结果显示野生型及突变体最适pH均为9.0,复合突变体的最适温度提高5℃。单点突变及组合突变均使T1脂肪酶的酶学性质得到不同程度的改善,且复合突变体效果更显著。组合突变体使脂肪酶的温度、pH稳定性显著提高,L188M/A190L对于有机溶剂二甲基亚砜及正十六烷的耐受性为野生型的1.88倍和2.73倍,L188M/A190Y为野生型的1.96倍和2.58倍。此外,对C16和C18底物的选择性也明显增强,L188M/A190L为野生型的1.65和2.7倍,L188M/A190Y为野生型的1.5倍和2.25倍。该研究成果在一定程度上拓宽了T1脂肪酶的应用前景,同时为其他脂肪酶的改造提供了一定理论依据。

关键词： T1脂肪酶盖子结构单点突变组合突变酶学性质

“盖子”区域带电氨基酸及C-端肽链对脂肪酶HL1232催化活性及选择性的调控研究

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“盖子”区域带电氨基酸及C-端肽链对脂肪酶HL1232催化活性及选择...

作者：安群华南理工大学

学位级别：硕士

HL1232脂肪酶(又称PLA1),是由Thermomyces lanuginosus lipase基因和Fusarium oxysporum phospholipase基因融合并重组表达获得的。该酶不仅表现出脂肪酶活性,同时还具有磷脂酶活性。HL1232脂肪酶空间结构中的“盖子”使其表现出界面激... 详细信息

HL1232脂肪酶(又称PLA1),是由Thermomyces lanuginosus lipase基因和Fusarium oxysporum phospholipase基因融合并重组表达获得的。该酶不仅表现出脂肪酶活性,同时还具有磷脂酶活性。HL1232脂肪酶空间结构中的“盖子”使其表现出界面激活效应。“盖子”结构的不同状态,决定了该脂肪酶是否具有催化底物水解活性。本文以HL1232脂肪酶为研究对象,在本实验室之前的工作基础上,通过对其“盖子”区域的三个带电荷氨基酸位点进行进一步定点突变研究,对这三个关键氨基酸在HL1232脂肪酶性质与功能中的作用进行了更为深入的研究。另外,磷脂酶活力是HL1232脂肪酶的一个重要性质,该脂肪酶能催化磷脂底物水解的特性使其被广泛用于油脂脱胶工业中。通过对HL1232脂肪酶氨基酸序列进行分析及比对,我们对C-端肽链在HL1232脂肪酶磷脂酶活力表现中的作用进行了研究。论文的具体内容及结果如下:1,“盖子”区域带电荷氨基酸在酶催化活性中的影响研究。在本实验室之前的工作基础上,补加了对R81,R84及E87位点的单点突变,根据氨基酸性质,将该三位点氨基酸残基分别突变成带相反电荷氨基酸,即设计突变体R81E,R84E及E87R;并在单点突变体的研究基础上,设计了多点突变体R81AR84M,R81AE87Q,R84ME87Q及R81AR84ME87Q,以全面研究该三位点不同氨基酸特性对HL1232脂肪酶酶学性质的影响;利用定点突变技术,以实验室构建的野生型表达载体pGAPZaA-HL1232出发,构建各突变体表达载体,并成功在毕赤酵母X-33中重组表达。发酵上清液经Q阴离子交换柱分离纯化,获得纯化野生型及突变体重组蛋白。以纯化的HL1232脂肪酶野生型及其突变体为研究对象,分别测定各突变体水解橄榄油底物与大豆卵磷脂底物的酶学性质。结果显示,R84E突变体水解两种底物的酶活力较野生型都有所上升;R81E突变体酶活力则与野生型相差不大,且其水解两种底物的最适反应条件相同,均为pH6.0,45℃;而E87R突变体的比酶活有所下降,且其反应的最适温度发生了巨大变化,其水解橄榄油底物及卵磷脂底物的最适反应温度由野生型的45℃、55℃分别下降至30℃、45℃。分析各多点突变体,虽然其单点突变酶活力均有很大程度提升,但除R81AE87Q外,其他三个多点突变体的比酶活均比野生型低,多点突变的酶学性质的改变不是单点突变的简单累加结果。2,C-端肽链在酶底物选择性中的作用研究。根据HL1232脂肪酶序列分析,设计了突变体D263-317,D270-317,S263-269及S263-269D270-317,对该段C-端肽链进行替换或缺失,以定向研究该段肽链在HL1232脂肪酶表现磷脂酶活力中的作用;并在此基础上,以263-269氨基酸残基片段中的唯一带电荷氨基酸残基D266为对象,设计了突变体D266A,D266E,D266E,以研究该位点在HL1232脂肪酶性质与功能中的作用。构建各突变体表达载体,并使其在毕赤酵母中成功重组表达。目的蛋白突变体经纯化后,分别测定各突变体水解橄榄油底物与大豆卵磷脂底物的酶学性质。结果显示,HL1232脂肪酶的C-端肽链的缺失或替换,其酶学性质发生了很大变化。D263-317和S263-269突变体水解大豆卵磷脂的最适pH均由野生型的酸性条件(pH 5.0)变成了中性条件(pH 7.0),且S263-269突变体水解橄榄油底物的最适pH由中性条件(pH 7.0)上升为pH 9.0,D263-317水解两种底物的比酶活大大降低。263-269氨基酸胺基片段的替换会改变该脂肪酶对水解磷脂底物与三酯底物的偏好性。各C-端肽链突变体的PL/TG均发生巨大变化,由野生型的0.828分别下降为0.802(D263-317),0.601(D270-317),0.328(S263-269),0.115(S263-269D270-317)。3,通过生物信息学的进一步分析发现,“盖子”区域氨基酸残基与周围氨基酸残基及外界环境间的相互作用(包括Cation-π,氢键,盐桥,疏水相互作用等)对“盖子”结构构象的转变起着重要的作用,这些相互作用力影响“盖子”结构的灵活性,并影响其闭合状态或开放状态的稳定性,进而影响该酶的催化效率;HL1232脂肪酶C-端肽链为其催化中心营造的极性环境可能是其具有磷脂酶活力的原因之一。

关键词：脂肪酶定点突变盖子结构 C-端肽链酶学性质生物信息学

华根霉（Rhizopus chinensis）脂肪酶底物特异性的定向改造

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华根霉（Rhizopus chinensis）脂肪酶底物特异性的定向改造

作者：朱珊珊江南大学

学位级别：硕士

华根霉（Rhizopus chinensis CCTCC M201021）作为一种典型的根霉属丝状真菌,不仅是传统酿造工业中的重要功能微生物,在现代发酵工业中也是许多工业用品和酶制剂的重要生产菌株。前期研究已经实现了华根霉脂肪酶基因（proRCL）（GenBank... 详细信息

华根霉（Rhizopus chinensis CCTCC M201021）作为一种典型的根霉属丝状真菌,不仅是传统酿造工业中的重要功能微生物,在现代发酵工业中也是许多工业用品和酶制剂的重要生产菌株。前期研究已经实现了华根霉脂肪酶基因（proRCL）（GenBank Accession No. EF405962）在巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）中的高水平分泌表达。本文在保留毕赤酵母诱导型启动子（AOX）两端同源重组序列的基础上插入组成型表达启动子（GAP）,实现毕赤酵母组成型表达华根霉脂肪酶的作用。同时结合橄榄油罗丹明B平板,建立高通量的平板筛选法。选定脂肪酶盖子区域,运用半理性设计和理性设计的手段获得了一系列的活性和底物特异性改变的突变株,系统研究了盖子结构对脂肪酶活性和底物特异性的影响。具体内容包括: （1）运用PCR技术从pGAPZαA表达载体上扩增得到GAP启动子片段,插入到表达载体pPIC9K-proRCL中,构建组成型表达载体pGAPK-proRCL。在保留含有同源双交换重组序列的诱导型启动子AOX1序列的基础上,电转化后华根霉脂肪酶基因proRCL表达盒在毕赤酵母基因组上发生双交换整合事件,从而组成型表达单拷贝的华根霉脂肪酶基因。重组菌发酵144 h后,脂肪酶最高酶活为130 U/mL。（2）利用橄榄油罗丹明B平板建立高通量筛选组成型表达华根霉脂肪酶基因的有效方法。该方法将初筛时间从12 d缩短为3 d,排除了多拷贝突变株的干扰,为后续脂肪酶的定向进化及筛选奠定了基础。（3）根据半理性设计思路,选定proRCL盖子结构域上连续10个氨基酸位点,利用重叠延伸PCR技术引入区域选择性突变,获得一系列酶活和底物特异性改变的突变酶。（4）根据理性设计思路,利用重叠延伸PCR技术将proRCLS4-3的盖子结构替换成米根霉脂肪酶（Rhizopus oryzae lipase,ROL）,米黑根毛霉脂肪酶（Rhizomucor miehei lipase,RML）和黑曲霉阿魏酸酯酶（Aspergillus niger Feruloyl esterase,ANE）的盖子结构。获得突变酶proRCLS4-3O,proRCLS4-3M,proRCLS4-3N。（5）纯化后酶学性质与初始脂肪酶proRCLS4-3相比较,proRCLS4-3O对C12的特异性最高,kcat值几乎不变,km值增大一倍,甘油三酯酶和磷脂酶活力均有下降,热稳定性减弱。结合软件分析结果表明,Met213通过改变疏水通道口的大小直接影响酶与底物亲和力的大小, Thr216的作用则是通过与His229,Ala230的相互作用固定开盖构型。而突变Asn216使构象的不稳定性增加,最终导致突变脂肪酶的热稳定性减弱。（6） proRCLS4-3M对C8脂肪酸的特异性最高。kcat值增大5.6倍,km值几乎不变,同时甘油三酯酶活提高51%,蛋白质分子空间结构模拟显示GRAVY值升高一倍,说明盖子疏水性升高导致其与疏水性的底物的亲和力增加。同时底物与催化中心距离的缩短表明底物与催化中心的接触更紧密,kcat值增大。突变Ala209Trp引起底物进入酶活性中心通道的变窄,导致突变酶和中长链的pNPC8的结合更加紧密,特异性改变。（7） proRCLS4-3N对短链C2的特异性最高,kcat/km由2.80 mM-1s-1明显下降为0.05mM-1s-1。甘油三酯酶活力与磷脂酶活力急剧下降。GRAVY值由原来的0.200下降为-1.086说明疏水性盖子替换成亲水性的盖子,破坏了催化中心的疏水环境,底物的催化效率降低,kcat值减小。N端糖基化位点使保持开盖构型,但盖子打开距离缩短,疏水性底物亲和性降低,底物特异性向短链脂肪酸靠近。

关键词：华根霉脂肪酶底物特异性组成型表达 GAP 橄榄油罗丹明B 盖子结构半理性设计理性设计

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脂肪酶的分子动力学模拟

脂肪酶的分子动力学模拟

作者：李灵利北京化工大学

学位级别：硕士

本研究在通过实验和分子模拟方法共同解析脂肪酶和周围微环境的应答机制及活性变化规律方面取得了良好的进展。构建了不同浓度的甲醇溶液，通过实验和模拟的方法研究其对Yarrowia lipolyticalipase Lip2脂肪酶构象的影响。脂肪酶整体构... 详细信息

本研究在通过实验和分子模拟方法共同解析脂肪酶和周围微环境的应答机制及活性变化规律方面取得了良好的进展。构建了不同浓度的甲醇溶液，通过实验和模拟的方法研究其对Yarrowia lipolyticalipase Lip2脂肪酶构象的影响。脂肪酶整体构象的回旋半径分析、实验酶活数据、主成分分析表明：在甲醇的作用下，脂肪酶整体发生了膨胀，三级结构发生了变化。荧光、紫外实验及溶剂可及面积计算结果表明：维持蛋白原有三级结构的主要作用力——疏水相互作用遭到甲醇的破坏，促使脂肪酶发生了膨胀，三级结构破坏，但二级结构变化不大。水和甲醇在脂肪酶表面的分布情况表明：随着甲醇浓度的增大，部分甲醇分子进入到了脂肪酶分子内部，从另一个侧面印证了蛋白的溶剂可及面积的变大及芳香族氨基酸的微环境的变化。通过对Lip2脂肪酶的盖子闭合性的分析发现了LIP2脂肪酶可能存在两个盖子结构，即除了Thr88-Leu105的盖子区域，Lip2脂肪酶还存在一个具有较大柔性的区域Phe274-Leu290。

关键词：脂肪酶甲醇三级结构微环境盖子结构

脂肪酶SMG1的底物识别和热稳定性机制研究

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脂肪酶SMG1的底物识别和热稳定性机制研究

作者：王倩华南理工大学

学位级别：硕士

脂肪酶(甘油三酯水解酶)是能够在油水界面催化脂类物质水解的一类水解酶。脂肪酶是一种重要的生物催化剂,在油脂工业和化工领域应用广泛。偏甘油酯脂肪酶是只能水解甘油二酯或甘油单酯的脂肪酶,在油脂改性上极具应用潜力。但是在脂肪酶... 详细信息

脂肪酶(甘油三酯水解酶)是能够在油水界面催化脂类物质水解的一类水解酶。脂肪酶是一种重要的生物催化剂,在油脂工业和化工领域应用广泛。偏甘油酯脂肪酶是只能水解甘油二酯或甘油单酯的脂肪酶,在油脂改性上极具应用潜力。但是在脂肪酶的研究领域,关于偏甘油脂肪酶的研究相对较少。脂肪酶SMG1是近期从球形马拉色菌中分离的一种偏甘油酯脂肪酶,能作用于甘油二酯和甘油单酯。SMG1晶体结构已经被解析出来(PDB ID:3UUE and 3UUF),为SMG1结构和功能关系的研究提供了基础。研究表明脂肪酶独有的界面激活特性与脂肪酶催化反应时构象的变化(特别是盖子结构的构象变化)密切相关,而脂肪酶的盖子结构对脂肪酶的底物选择性有重要影响。脂肪酶SMG1的盖子结构呈loop构象,而大多数脂肪酶的盖子结构采取helix构象。本文以脂肪酶SMG1为研究对象,从晶体结构出发结合已有的研究成果,通过定点突变技术、毕赤酵母重组表达、蛋白纯化、酶学性质分析以及蛋白结构分析等手段对SMG1的底物识别机制进行了研究,希望能对酶分子的理性设计提供一定的参考。另外,脂肪酶的热稳定性对其应用有重要影响,我们对脂肪酶SMG1的 Asn277位点对其热稳定性的影响进行了研究。本研究主要包括以下方面的内容:1.突变体设计。通过分析SMG1的晶体结构并结合已有的研究成果,我们认为位于催化口袋边缘的Phe278,和盖子结构上的Leu103和Phe104对底物识别有重要影响,因此我们以这几个位点为目标设计了L103G、F104G、F278A、L103G-F278A、F104G-F278A以及Delete(103-104)突变体。2.野生型和突变体SMG1的制备。利用定点突变技术从实验室构建的野生型表达载体出发构建突变体表达载体,并成功在毕赤酵母X-33中重组表达。对野生型和突变体的X-33表达菌株进行发酵,利用亲和层析技术对目的蛋白进行纯化,成功获得高纯度突变体重组酶蛋白。3.对野生型和突变体的酶学性质的分析和比较:1)SMG1界面催化特性的研究。以对硝基苯酚丁酸酯(PNPB)为底物研究了SMG1的界面催化特性,结果表明SMG1对PNPB的水解动力学曲线不符合典型脂肪酶界面激活的趋势。我们分析这可能与SMG1特殊的盖子结构有关。2)对野生型和突变体的最适温度、p H、最适底物、酶活、催化动力学参数、以及对天然底物TAG、DAG、MAG的选择性进行了分析,结果表明所有的突变体仍然不能水解甘油三酯,但是一些突变体的底物选择性发生了明显变化。L103G-F278A、F104G-F278A以及Delete(103-104)提高了对1,3-DAG的偏好性,水解1,3-DAG的平均速率分别是水解1,2-DAG的平均速率的7.21、10.17、6.42倍,而野生型仅为1.38倍。3)突变体L103G对人工底物对硝基苯酚辛酸酯(PNPO)的水解活力提高为原来的2倍,但是对DAG的水解活力降低为53%,突变体F278A对PNPO的水解活力降低为11%,而对DAG的水解活力保持在78%。而突变体Delete(103-104)对PNPO的水解活力仅为野生型的0.9%,对DAG的水解活力为野生型33%。4)结合SMG1的结构对这些性质变化进行了分析,对底物识别机制进行了讨论。***277与SMG1热稳定性关系的研究。在实验室构建的N277F、N277L、N277D这几个突变体的基础上,用圆二色谱对野生型及N277突变体的热稳定性进行了分析,结果与以前实验室实验测定的结果一致。我们从分子建模的角度分析了N277对脂肪酶SMG1热稳定性影响的机制。

关键词：脂肪酶SMG1 盖子结构界面激活定点突变底物选择性热稳定性