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牙髓干细胞对皮肤成纤维细胞衰老及增殖能力的影响

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上海口腔医学 2020年第5期29卷 466-470页

作者：李月玲杨佳音徐睿上海市嘉定区牙病防治所上海201899

目的:研究牙髓干细胞对皮肤成纤维细胞衰老及增殖能力的影响,并初步探讨其机制。方法:从人牙髓中提取,培养牙髓干细胞,与皮肤成纤维细胞分组共培养,分为3组:对照组(单纯皮肤成纤维细胞培养)、条件培养基组(利用牙髓干细胞条件培养基培... 详细信息

目的:研究牙髓干细胞对皮肤成纤维细胞衰老及增殖能力的影响,并初步探讨其机制。方法:从人牙髓中提取,培养牙髓干细胞,与皮肤成纤维细胞分组共培养,分为3组:对照组(单纯皮肤成纤维细胞培养)、条件培养基组(利用牙髓干细胞条件培养基培养成纤维细胞)、直接共培养组(采用Transwell共培养小室)。共培养后,进行β半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色,检测成纤维细胞的衰老情况;利用CCK-8法检测各组成纤维细胞的活性;流式细胞仪分析成纤维细胞的细胞周期变化;采用RT-PCR和Western免疫印迹检测各组成纤维细胞衰老相关蛋白p21、p53以及pRb的mRNA和蛋白表达水平。采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学分析。结果:与空白组相比,后2组的皮肤成纤维细胞表达β半乳糖苷酶降低、增殖能力增强、G1期细胞减少而S期和G2期增多,p53、p21 mRNA和蛋白表达水平降低而PRb表达升高。结论:牙髓干细胞及其条件培养基具有抗皮肤成纤维细胞衰老的作用,为牙髓干细胞在抗皮肤衰老方面的临床应用提供了依据。

关键词：牙髓干细胞皮肤成纤维细胞共培养条件培养基抗衰老

原花青素抗UVB诱导皮肤成纤维细胞凋亡和氧化损伤的影响

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中成药 2022年第12期44卷 4044-4049页

作者：饶美荣曾芬钟咪张佳音江南大学附属医院皮肤科江苏无锡214000

目的研究原花青素对中波紫外线(UVB)诱导皮肤成纤维细胞凋亡和氧化损伤的影响。方法分离培养人皮肤成纤维细胞,分成对照组(不做处理),UVB组(UVB照射),原花青素低、中、高剂量组(20、40、80μg/mL原花青素处理,UVB照射),原花青素中剂量+X... 详细信息

目的研究原花青素对中波紫外线(UVB)诱导皮肤成纤维细胞凋亡和氧化损伤的影响。方法分离培养人皮肤成纤维细胞,分成对照组(不做处理),UVB组(UVB照射),原花青素低、中、高剂量组(20、40、80μg/mL原花青素处理,UVB照射),原花青素中剂量+XAV939组(40μg/mL原花青素+1μmol/L XAV939处理,UVB照射)。CCK-8实验检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡能力,黄嘌呤氧化法检测细胞SOD活性,硫代巴比妥酸法检测MDA水平,比色法检测GSH-Px活性,ELISA法检测培养液上清MMP-1、MMP-9水平,Western blot法检测Bax、Bcl-2、Wnt1、β-catenin蛋白表达。结果与对照组比较,UVB组细胞存活率,SOD、GSH-Px活性,Bcl-2、Wnt1、β-catenin蛋白表达降低(P细胞上述指标均有改善(P皮肤成纤维细胞的保护作用(P皮肤成纤维细胞凋亡和氧化损伤。

关键词：原花青素中波紫外线(UVB) 皮肤成纤维细胞凋亡氧化损伤 Wnt/β-catenin信号通路

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树鼩永生化皮肤成纤维细胞株的建立及鉴定

云南农业大学学报（自然科学版） 2022年第3期37卷 478-484页

作者：奎秀莹王文广金亮子邓伟仝品芬陆彩霞代解杰中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南昆明650031 昆明医科大学医学生物学研究所云南昆明650031 云南大学医学生物学研究所云南昆明650031

【目的】建立永生化树鼩皮肤成纤维细胞,为探究真皮层中皮肤成纤维细胞和其产生的细胞外基质在其中所发挥的作用提供新的试验材料。【方法】通过酶消化法从树鼩腿部皮肤分离纯化出皮肤成纤维细胞,利用携带SV40T基因的慢病毒转染细胞,挑... 详细信息

【目的】建立永生化树鼩皮肤成纤维细胞,为探究真皮层中皮肤成纤维细胞和其产生的细胞外基质在其中所发挥的作用提供新的试验材料。【方法】通过酶消化法从树鼩腿部皮肤分离纯化出皮肤成纤维细胞,利用携带SV40T基因的慢病毒转染细胞,挑取单克隆后进行传代培养;对传至50代以上的细胞进行形态学观察、免疫荧光鉴定以及核型鉴定。【结果】传代培养后得到的细胞形态一致,且与原代细胞相比未发生改变,均为梭形和多角形纤维状,到第58代时细胞状态仍较好。生长曲线测定结果显示:细胞生长旺盛,第2~3天为细胞对数生长期,第5天进入平台期;免疫荧光可检测到皮肤成纤维细胞标志蛋白Vimentin和永生化SV40T强荧光信号。细胞核型分析显示:染色体数与中缅树鼩染色体一致,即所得细胞为永生化树鼩皮肤成纤维细胞。【结论】本研究成功构建1株能够稳定传代的永生化树鼩皮肤成纤维细胞,为皮肤损伤修复及其他皮肤相关疾病的研究提供了试验材料。

关键词：树鼩皮肤成纤维细胞分离永生化细胞株

不同SOD1基因突变的肌萎缩侧索硬化患者皮肤成纤维细胞中突变蛋白表达及线粒体功能

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中华医学杂志 2016年第25期96卷 1982-1986页

作者：刘文超刘涛刘志辉邓敏潍坊医学院 261053 北京大学第三医院中心实验室潍坊医学院附属医院神经内科

目的针对携带不同SOD1基因突变的肌萎缩侧索硬化（ALS）患者皮肤成纤维细胞进行SOD1突变蛋白表达和线粒体功能的探索.方法活检获取2008-2012年北京大学第三医院神经内科门诊确诊的携带SOD1-V14M、SOD1-G16A、SOD1-C 111Y基因突变的家... 详细信息

目的针对携带不同SOD1基因突变的肌萎缩侧索硬化（ALS）患者皮肤成纤维细胞进行SOD1突变蛋白表达和线粒体功能的探索.方法活检获取2008-2012年北京大学第三医院神经内科门诊确诊的携带SOD1-V14M、SOD1-G16A、SOD1-C 111Y基因突变的家族性ALS患者及年龄性别相匹配的健康对照皮肤组织,培养并建立成纤维细胞系;采用PCR扩增和直接测序的方法测定基因突变位点;共聚焦免疫荧光检测细胞内SOD1蛋白聚集量及线粒体膜电位变化;流式细胞仪检测活性氧（ROS）水平.结果携带SOD1-V14M、SOD1-G16A、SOD1-C111Y基因突变的ALS病人成纤维细胞出现胞质SOD1蛋白异常聚集,三组突变的SOD1蛋白的浆核比与对照组相比分别升高2.54、2.80及3.25倍;成纤维细胞线粒体膜电位△Ψm明显降低,红/绿荧光强度的比值相比对照组分别减少了36％、124％、142％;且细胞内ROS水平均较对照组增高了3.33、3.65、6.87倍.结论在携带SOD1基因突变的ALS病人成纤维细胞内出现胞质SOD1蛋白异常聚集、线粒体功能异常及ROS水平改变,患者的外周组织成纤维细胞可作为ALS发病机制研究的有力工具,更益于将来可能的临床应用.

关键词：肌萎缩侧索硬化皮肤成纤维细胞 SOD1基因突变蛋白聚集线粒体功能障碍

印太江豚皮肤成纤维细胞中Toll样受体4表达研究

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印太江豚皮肤成纤维细胞中Toll样受体4表达研究

作者：曾莹汕头大学

学位级别：硕士

鲸目动物是一类完全水栖的次生性水生哺乳动物。经过漫长的进化,鲸目动物已演化出完全适应水生生活的运动系统、呼吸系统以及免疫系统等。鲸目动物栖息的生境中存在丰富多样的病原体,其中不仅有来源于水体的病原体,也有陆源的病原体;病... 详细信息

鲸目动物是一类完全水栖的次生性水生哺乳动物。经过漫长的进化,鲸目动物已演化出完全适应水生生活的运动系统、呼吸系统以及免疫系统等。鲸目动物栖息的生境中存在丰富多样的病原体,其中不仅有来源于水体的病原体,也有陆源的病原体;病原体感染(例如:铜绿假单胞菌等)严重威胁了鲸目动物的个体健康和种群繁衍,因此,鲸目动物的免疫系统成为其适应复杂多变的水生环境、抵御水生环境中的特殊病原体、维持个体健康和保证种群繁衍的重要因素。通过皮肤先天免疫系统识别和抵御病原体侵染是哺乳动物维持机体健康的重要手段。近年来,虽然对人类等陆生哺乳动物相关机制已有深入研究,但对于多变、多压力生存环境下的鲸目动物的先天免疫体系识别和抵御病原体感染的分子作用机制研究仍缺乏。在典型陆生哺乳动物(例如:人类、小鼠和牛等)的机体内,先天免疫系统对铜绿假单胞菌等革兰氏阴性菌的识别与响应主要是依靠Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)。研究表明,TLR4首先识别革兰氏阴性菌的LPS,从而触发下游信号通路激活免疫系统,分泌抗菌肽、细胞因子等效应分子,并通过这些分子的直接作用或募集免疫效应细胞清除病原体。可见,TLR4在先天免疫系统对革兰氏阴性菌的识别与响应中发挥着至关重要的作用。因此,本研究从m RNA水平、蛋白水平、细胞水平和组织水平等多个方面对比研究了印太江豚(Neophocaena Phocaenoides)和人的皮肤成纤维细胞中TLR4的表达情况,深入探讨1)印太江豚皮肤成纤维细胞中TLR4的表达情况;2)脂多糖(LPS)诱导下印太江豚皮肤成纤维细胞TLR4表达情况;3)不同鲸豚的皮肤成纤维细胞中TLR4表达情况。主要研究结果如下:1)通过PCR、RNA荧光原位杂交和免疫荧光实验发现,TLR4仅存在于印太江豚皮肤成纤维细胞的基因组内,在皮肤成纤维细胞的m RNA和蛋白水平上均不表达。2)通过对组织切片进行RNA荧光原位杂交和免疫荧光实验研究不同印太江豚个体的皮肤成纤维细胞是否表达TLR4。结果显示,皮肤成纤维细胞中不表达TLR4这一现象可能普遍存在于不同的印太江豚个体中。3)通过实时荧光定量PCR检测LPS暴露后皮肤成纤维细胞中关键基因m RNA的表达水平。结果显示在人的皮肤成纤维细胞中,LPS刺激能使TLR4、IL6和IL8的表达量上调。然而,LPS暴露对TLR4在印太江豚皮肤成纤维细胞中的表达无影响,但LPS刺激能导致IL6的表达量上调,且铜绿假单胞菌暴露处理后能引起IL6、IL8、TNFα显著上调。可见,在TLR4不表达的情况下,印太江豚皮肤成纤维细胞仍能识别LPS和革兰氏阴性菌并产生免疫响应。总而言之,印太江豚皮肤成纤维细胞并不表达TLR4,但能够响应LPS或铜绿假单胞菌的刺激。一方面,印太江豚皮肤成纤维细胞中可能存在与人类不同的革兰氏阴性菌识别受体以及一种不依赖于TLR4的分子响应机制使印太江豚对LPS和革兰氏阴性菌产生免疫响应;另一方面,印太江豚可能通过识别革兰氏阴性菌的其他组分,例如i E-DAP、胞壁酰二肽、ADP庚糖、鞭毛等,从而识别革兰氏阴性菌。本研究对印太江豚TLR4在皮肤成纤维细胞、皮肤组织和肾上腺组织中的表达情况与人进行了对比研究,揭示了TLR4在印太江豚与人皮肤成纤维细胞中的不同表达模式,然而,对于不同细胞和鲸豚对革兰氏阴性菌的识别机制仍有待开展。

关键词：印太江豚先天免疫皮肤成纤维细胞 Toll样受体4 脂多糖革兰氏阴性菌

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鹿皮提取物对皮肤成纤维细胞调控机制研究

鹿皮提取物对皮肤成纤维细胞调控机制研究

作者：王天成长春中医药大学

学位级别：硕士

目的:分析鹿皮提取物组成,并以原代皮肤成纤维细胞为研究对象,利用转录组技术联合多种分子生物学方法明确鹿皮提取物对皮肤成纤维细胞的作用,及其对皮肤成纤维细胞的分子调控机制。方法:用酸提取法和冷冻干燥法制备梅花鹿鹿皮提取物(SDS... 详细信息

目的:分析鹿皮提取物组成,并以原代皮肤成纤维细胞为研究对象,利用转录组技术联合多种分子生物学方法明确鹿皮提取物对皮肤成纤维细胞的作用,及其对皮肤成纤维细胞的分子调控机制。方法:用酸提取法和冷冻干燥法制备梅花鹿鹿皮提取物(SDSE),并通过正交实验对提取工艺进行优化,采用SDS-PAGE和BCA蛋白测定法进行定性和定量分析,使用氨基酸自动分析仪对鹿皮提取物成分进行分析,采用CCK-8、细胞划痕实验、创伤模型、免疫荧光实验和组织学病理切片技术,分析SDSE是否可通过促进皮肤成纤维细胞增殖和迁移,进而促进皮肤愈合以及发挥抗皱功效。利用RNA-Seq技术结合生物信息学,分析SDSE处理后的原代成纤维细胞的基因表达模式,并进行相关基因功能注释和代谢通路分析。最后,利用q RT-PCR法对RNA-Seq结果基因表达水平验证。结果:(1)通过单因素考察和正交实验,确定最佳鹿皮提取工艺,最终提取率可以达到78%;SDS-PAGE电泳和BCA蛋白定量分析结果表明SDSE中蛋白质类成分含量可达42%;氨基酸检测结果表明SDSE中含有丰富的氨基酸,包括甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸等12种必须氨基酸和赖氨酸、亮氨酸等6种非必须氨基酸。(2)成功分离小鼠原代皮肤成纤维细胞,利用q RT-PCR对成纤维细胞标记基因进行验证,证明所得细胞正确,使用流式细胞仪对细胞纯度分析,结果显示细胞纯度达到95.8%。(3)CCK-8结果表明SDSE在8 mg/ml浓度时可显著促进成纤维细胞增殖,且作用效果最佳。(4)细胞划痕实验结果表明,SDSE可以显著提高原代皮肤成纤维细胞的迁移能力。(5)细胞免疫荧光实验表明SDSE可以增加COL1A1和COL3A1的表达水平。(6)建立了动物皮肤创伤模型并进行创面给药,结果表明SDSE可以显著提高皮肤愈合速度。(7)对RNA-Seq结果进行分析,结果表明,与空白组相比,鹿皮提取物组鉴定出511个差异表达基因,包括362个差异上调基因和511个差异下调基因。(8)对差异表达基因进一步筛选分析发现,SDSE处理原代皮肤成纤维细胞后,成纤维细胞增殖相关基因,如Spp1,Tnc,Igfbp5,Pdgfra,Lum被升高,抑制细胞增殖的基因被降低,如Mthfd2,Nupr1。(9)根据RNA-Seq的结果,SDSE处理后成纤维细胞中与皮肤抗皱相关的基因被上调,如Col1a1,Col1a2,Col3a1,Timp1。(10)通过qRT-PCR实验验证RNA-Seq数据,结果与转录组数据一致,证明结果真实可靠。结论:本研究制备了梅花鹿鹿皮提取物,经成分验证发现主要为蛋白质类成分,且含有丰富的氨基酸,包括12种必须氨基酸,6种非必须氨基酸;分离了新生小鼠皮肤真皮层的成纤维细胞,并研究SDSE对成纤维细胞的影响。CCK-8和划痕实验结果表明SDSE对成纤维细胞具有显著的促进增殖和迁移的作用,进一步采用RNA-Seq方法分析SDSE处理皮肤成纤维细胞后的基因表达模式,结果显示,SDSE通过上调Spp1,Tnc,Igfbp5,Pdgfra,Lum等基因,下调Mthfd2,Nupr1等基因促进成纤维细胞增殖。上调Col1a1,Col1a2,Col3a1,Timp1促进胶原的表达,减少胶原降解。对差异基因进一步进行KEGG富集分析,发现SDSE通过调节Rap1、PI3K-Akt信号通路,cell adhesion molecules,Focal adhesion,ECM-receptor interaction,促进细胞增殖和迁移。进一步的皮肤创伤实验,证明了SDSE可以促进皮肤愈合。以上结果表明,SDSE可通过促进皮肤成纤维细胞增殖和迁移促进皮肤愈合,其机制可能是通过调节细胞增殖和合成胶原蛋白相关基因的表达,本实验系统研究了传统中药动物药鹿皮的功效,为治疗皮肤创伤提供了理论基础。

关键词：鹿皮提取物皮肤成纤维细胞 RNA-Seq 细胞增殖创伤愈合

小分子化合物诱导大鼠皮肤成纤维细胞重编程为神经元的研究

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小分子化合物诱导大鼠皮肤成纤维细胞重编程为神经元的研究

作者：王雪云郑州大学

学位级别：硕士

研究背景与目的神经退行性疾病是现代社会公共医疗卫生面临的巨大挑战,这类疾病的发生和发展主要与神经元的损伤和丢失有关。神经元不可再生的特性导致了这类疾病的不可逆转性。目前,临床上对神经退行性疾病的治疗主要是依靠药物控制,... 详细信息

研究背景与目的神经退行性疾病是现代社会公共医疗卫生面临的巨大挑战,这类疾病的发生和发展主要与神经元的损伤和丢失有关。神经元不可再生的特性导致了这类疾病的不可逆转性。目前,临床上对神经退行性疾病的治疗主要是依靠药物控制,从而缓解疾病的发展进程。但是,药物对神经退行性疾病的作用效果并不显著。因此,未来开展新的治疗方法是十分必要的。神经细胞移植,作为一种将体外培养的神经细胞移植至宿主体内的技术,未来可能成为治疗神经退行性疾病的一种重要方法。近年来,通过不同方法将体细胞重编程为诱导神经元(induced neurons,iNs)受到国内外研究者的广泛关注,这也可能成为神经退行性疾病细胞替代治疗的重要方案之一。传统神经元的获得方法主要是体内分离神经干细胞(neural stem cell,NSCs)或胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs),将干细胞进行体外培养诱导分化为神经元。但是,神经干细胞的增殖能力在一定程度上具有其自身的局限性,且不易获得。因此,体细胞重编程技术的出现和发展为神经退行性疾病细胞替代治疗研究带来了新的契机。早在2006年,日本学者Takahashi和Yamanaka通过四种转录因子(Oct3/4,Sox2,c-Myc,Klf4)将体细胞重编程为诱导性多能干细胞(induced plurpotent stem cells,i PSCs)。i PSCs是一种全能状态的细胞,可以诱导成为神经元或胶质细胞,并用于神经退行性疾病的治疗。但是,i PSCs在诱导分化的过程中存在周期长、操作繁琐、潜在的致瘤性等不利因素。而外源转录因子的应用在重编程体细胞为i PSCs的过程中也存在潜在的隐患。因此,寻求一种更简便安全、易于操控的方法成为了科学家研究的热点。最近有研究发现,小分子化合物(small molecular compounds,SMs)可以将体细胞高效地重编程为iNs,被认为是神经退行性疾病细胞治疗的重要突破点。基于以上研究背景,本实验拟采用SMs(VCFYRP)包括VPA、CHIR99021、Forskolin、Y-27632、Repsox、P7C3-A20,开展其体内、体外诱导大鼠成纤维细胞高效重编程为神经元的研究。在体外,通过VCFYRP诱导大鼠胚胎成纤维细胞(rat embryonic fibroblasts,REFs)重编程为iNs,并检测重编程过程中iNs的生物学特性。此外,通过水凝胶负载缓释VCFYRP进行在体重编程研究。该研究将为神经退行性疾病的细胞替代治疗提供了新的研究思路和方法。材料和方法1.REFs通过组织块贴壁法进行原代培养和鉴定,采用免疫荧光检测成纤维细胞的标志蛋白波形蛋白(Vemintin),纤维连接蛋白(Fibronectin,Fn),神经元的标志蛋白神经元III类β-微管蛋白(neuronal class IIIβ-tubulin,TUJ1)和神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE),并将第三代REFs用于重编程实验。2.SMs组合(VCFYRP)将REFs重编程为iNs,并通过免疫荧光和Western blot检测REFs重编程为iNs过程中神经元相关蛋白TUJ1、NSE和酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)。3.RT-q PCR检测iNs的神经元的标记基因TUJ1、NSE、TH、γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)、胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase,Chat)和Nur相关因子1(Nur correlation factor 1,Nurr1),以及成纤维细胞相关基因Fn,结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)和Ⅰ型胶原α1(Type Collagenα1Ⅰ,COL1A1)的表达。4.通过Cell Counting Kit-8检测iNs的增殖能力。5.通过流式细胞术检测iNs的细胞周期、凋亡水平和蛋白质合成水平。6.通过水凝胶负载SMs(VCFYRP)进行在体重编程,在术后7天取皮肤组织进行苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色和免疫荧光分析TUJ1、NSE的表达情况。结果1.REFs的鉴定:免疫荧光结果表明,REFs表达成纤维细胞的标志蛋白Vemintin和Fn,阳性率高达97%以上,且不表达神经元的标志蛋白TUJ1和NSE。2.免疫荧光和Western blot检测iNs相关蛋白表达升高:2.1 REFs经SMs(VCFYRP)重编程后转化为iNs,iNs在形态上与神经元相似,出现了双极和多极的形态特征。2.2免疫荧光和Western blot检测结果表明神经元的标志蛋白TUJ1、NSE和TH的表达随着诱导时间延长逐渐增加,与REFs相比,具有显著性

关键词：皮肤成纤维细胞小分子化合物重编程诱导神经元水凝胶

二甲基砷酸对辽宁绒山羊皮肤成纤维细胞的毒性作用以及诱导细胞凋亡的机制

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畜牧兽医学报 2021年第7期52卷 1845-1857页

作者：赵凤琴周蕾王智阅孙东禹朴君朴敬爱金梅辽宁师范大学生物技术与分子药物研发辽宁省重点实验室大连116081

旨在用类金属毒性物质——砷对辽宁绒山羊皮肤成纤维细胞的染毒试验,探索砷对绒山羊皮肤成纤维细胞毒性作用和其诱导细胞凋亡的机制,为后续研究砷对绒山羊皮肤细胞生长的影响提供理论依据。本研究随机选取1只7月龄各项机能正常,体重为25... 详细信息

旨在用类金属毒性物质——砷对辽宁绒山羊皮肤成纤维细胞的染毒试验,探索砷对绒山羊皮肤成纤维细胞毒性作用和其诱导细胞凋亡的机制,为后续研究砷对绒山羊皮肤细胞生长的影响提供理论依据。本研究随机选取1只7月龄各项机能正常,体重为25 kg左右的雄性辽宁新品系绒山羊,取其腹部皮肤,进行细胞培养。将二甲基砷酸药物配制成11个不同浓度组(0、0.1、0.2、0.4、0.8、1、5、10、25、50、100 mmol·L^(-1)),对细胞量为3×10^(4)个·mL^(-1)皮肤细胞进行药物染毒24、48、72、96 h后,经MTT法进行3次重复试验,得到绒山羊皮肤成纤维细胞的增殖与抑制情况以及后续试验所选用的时间点和4个浓度组(对照、促进、临界、半抑制浓度(IC50)),进一步借助免疫荧光检测观察细胞骨架形态变化;彗星试验检测细胞DNA损伤情况;流式细胞仪检测细胞凋亡;透射电镜观察细胞质与细胞器的变化;测定细胞内荧光染料Mito-Tracker Green的染色强度分析线粒体跨膜电位(ΔΨm)以及观察分析溶酶体的数量情况。结果,24 h时不同浓度的OD值均能明显地反映出二甲基砷酸对绒山羊皮肤成纤维细胞的增殖和抑制趋势,而48、72、96 h时增殖作用逐渐减弱甚至消失,24 h时细胞增殖与抑制效果最佳,因此选取24 h时的对照组(未做任何处理)、促进浓度组(0.8 mmol·L^(-1))、临界浓度组(1 mmol·L^(-1))、IC50浓度组(38.68 mmol·L^(-1))进行后续的试验。24 h时,剂量范围0.1~1 mmol·L^(-1)的二甲基砷酸促进绒山羊皮肤成纤维细胞增殖,此阶段细胞骨架形态完整,细胞DNA未出现拖尾现象,凋亡率较小,线粒体数目增多,膜结构清晰,嵴致密,形态完整,膜电位升高,溶酶体数量增多;浓度大于1 mmol·L^(-1)的二甲基砷酸抑制绒山羊皮肤成纤维细胞生长,引起明显的细胞毒性(P细胞骨架形态发生改变,DNA未出现拖尾现象,凋亡率显著上升,线粒体发生肿胀,形态不规则,嵴断裂溶解,膜电位降低,溶酶体数量减少。IC_(50)组细胞骨架形态差异很大,细胞DNA出现彗星尾,最多最明显(P细胞凋亡数目明显增多,膜电位明显降低(P皮肤成纤维细胞的毒性作用以及诱导细胞凋亡的机制,表明一定浓度的二甲基砷酸对辽宁绒山羊皮肤成纤维细胞具有毒性作用,并具有进一步诱导细胞凋亡作用。

关键词：二甲基砷酸辽宁绒山羊皮肤成纤维细胞细胞增殖细胞凋亡

过表达YAP对过氧化氢诱导皮肤成纤维细胞氧化损伤的影响

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中国皮肤性病学杂志 2019年第5期33卷 501-506页

作者：王露张政高丽陈华全周发忠四川省妇幼保健院皮肤科四川成都610031 成都市第三人民医院四川成都610031 德阳市人民医院皮肤科四川德阳618000

目的研究过表达Yes相关蛋白(YAP)对过氧化氢(H_2O_2)诱导皮肤成纤维细胞氧化损伤的影响。方法皮肤成纤维细胞中转染pcDNA3.1-YAP质粒、对照pcDNA3.1质粒,经过H_2O_2处理后记为pcDNA3.1-YAP+H_2O_2、pcDNA3.1+H_2O_2,同时设置不转染的皮... 详细信息

目的研究过表达Yes相关蛋白(YAP)对过氧化氢(H_2O_2)诱导皮肤成纤维细胞氧化损伤的影响。方法皮肤成纤维细胞中转染pcDNA3.1-YAP质粒、对照pcDNA3.1质粒,经过H_2O_2处理后记为pcDNA3.1-YAP+H_2O_2、pcDNA3.1+H_2O_2,同时设置不转染的皮肤成纤维细胞经H_2O_2处理后记为H_2O_2,以不做任何处理的皮肤成纤维细胞作为对照。Real-time PCR和Western blot方法检测细胞中YAP表达变化,MTT检测细胞增殖,2,4-二硝基苯肼显色法检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出率,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测细胞中活化型Caspase-3(Cleaved Caspase-3)蛋白水平,钼酸铵比色法检测过氧化氢酶(CAT)活性,硫代巴比妥酸法检测细胞中丙二醛(MDA)含量,黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性,二硫对二硝基苯甲酸比色法检测谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性,羟脯氨酸法检测胶原合成水平。结果 pcDNA3.1-YAP+H_2O_2细胞中YAP水平高于pcDNA3.1+H_2O_2和对照(P细胞增殖能力降低,LDH漏出率升高,细胞凋亡率升高,细胞中Cleaved Caspase-3蛋白水平升高,CAT活性、SOD活性、GSH-PX活性降低,细胞中MDA含量升高,胶原含量降低,与对照比较,差异有统计学意义(P细胞增殖能力升高,LDH漏出率降低,细胞凋亡率降低,细胞中Cleaved Caspase-3蛋白水平降低,CAT活性、SOD活性、GSH-PX活性升高,细胞中MDA含量降低,胶原含量升高,与pcDNA3.1+H_2O_2和H_2O_2比较,差异有统计学意义(P皮肤成纤维细胞氧化损伤,减少细胞凋亡。

关键词：皮肤成纤维细胞凋亡氧化损伤 YAP