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百日咳杆菌效应CpG-ODNs防治变应性哮喘的实验研究

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百日咳杆菌效应CpG-ODNs防治变应性哮喘的实验研究

百日咳杆菌丝状血凝素和淋巴细胞增多促进因子在小鼠中的保护活性

第十届全国抗炎免疫药理学学术会议

作者：张宝袁孙云扬州大学医学院药理教研室

目的:百日咳杆菌(Bordetella pertussis)是一种致病微生物,感染后可导致百日咳病的发生。灭活后的百日咳疫苗可预防该病。近期研究发现,变应性哮喘伴随Th1/Th2失衡现象,越来越多的研究证据表明全细胞百日咳疫苗可选择性增强人和动物的Th... 详细信息

目的:百日咳杆菌(Bordetella pertussis)是一种致病微生物,感染后可导致百日咳病的发生。灭活后的百日咳疫苗可预防该病。近期研究发现,变应性哮喘伴随Th1/Th2失衡现象,越来越多的研究证据表明全细胞百日咳疫苗可选择性增强人和动物的Th1型反应,对Th1/Th2平衡的调节功能已被应用于变应性疾病的研究中。本课题旨在探讨百日咳杆菌中特殊的非甲基化DNA结构CpG-ODNs与免疫细胞(如巨噬细胞、树突状细胞等)内体TOLL样受体(TLR)9结合形成二聚体,调节Th1/Th2平衡,产生防治变应性哮喘作用。方法:本课题组应用Vector NTIAdvance 11软件自百日咳杆菌基因组提取出9条效应CpG-ODNs,与全细胞百日咳杆菌抗炎作用进行对比,筛选得到抗炎作用最强的CpG序列,命名为seqA进行后续研究。制备ICR小鼠慢性哮喘模型,分别采用腹腔注射(i.p.)及灌胃(p.o.)给予seq A、ODN-1018及cont ODN-1018,于实验第60天颈椎脱臼处死小鼠,制备小鼠肺泡灌洗液(BALF)、分离脾脏。酶联免疫吸附法(ELISA)检测BALF中IL-4、IFN-γ及VEGF浓度变化;逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测小鼠脾脏组织TLR-9表达。结果:(1)seqA(i.p.)组和ODN-1018(i.p.)组IL-4低于模型组,IFN-γ高于模型组(P0.05);(2)seq A(i.p.)组和ODN-1018(i.p.)组脾组织TLR-9表达强于模型组(P组与模型组比较无显著性差异(P>0.05)。结论:百日咳杆菌基因组CpG-ODNs具有抗炎作用,i.p组的百日咳杆菌效应CpG-ODNs seq A可调节小鼠哮喘模型BALF中Th1/Th2平衡,各组对VEGF表达量的影响无显著性差异,结论:百日咳杆菌基因组CpG-ODNs具有抗炎作用,i.p组的百日咳杆菌效应可显著增强小鼠脾组织TLR-9的表达,该作用系CpG-ODNs与TLR-9形成复合物有关;口服给予CpG-ODNs seq A对脾组织TLR-9表达无显著改变;腹腔注射CpG-ODNs seq A对脾组织TLR-9表达的干预作用优于灌胃途径。

关键词：哮喘百日咳杆菌寡核苷酸单链 Th1/Th2 TOLL样受体9

来源： cnki会议评论

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微生物学免疫学进展 1985年第4期 82-89页

作者： Masaaki Oda ,赵筱祺

百日咳是一种人类呼吸道疾病。使用全菌百日咳菌苗已有效地控制该病。然而,仍然需要一种含必要保护性抗原和反应原较少的菌苗。向改良菌苗方向进军的重要步骤,包括分离和鉴定百日咳杆菌的毒性成份和保护性抗原。

关键词：小鼠 FHA LPF 呼吸道感染灭活小家鼠百日咳杆菌百日咳博德特杆菌博德特杆菌属丝状血凝素抗体滴度促进因子

重组百日咳杆菌毒素S1亚单位及其突变体的克隆表达和生物学性质研究

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重组百日咳杆菌毒素S1亚单位及其突变体的克隆表达和生物学性质研...

作者：张晓丽第三军医大学

学位级别：硕士

百日咳是由革兰阴性杆菌百日咳杆菌(Bordertella pertussis)引起的一种具有强传染性的呼吸系统疾病,是一种流行周期为2～5年的区域性疾病。疫苗是预防和控制百日咳流行的最有效的手段,19世纪30年代以来全细胞百日咳疫苗(whole pertussis... 详细信息

百日咳是由革兰阴性杆菌百日咳杆菌(Bordertella pertussis)引起的一种具有强传染性的呼吸系统疾病,是一种流行周期为2～5年的区域性疾病。疫苗是预防和控制百日咳流行的最有效的手段,19世纪30年代以来全细胞百日咳疫苗(whole pertussis vaccine,WPV)成功应用于临床,从很大程度上控制了百日咳的流行,但由于全菌疫苗的副反应及自身的局限性,导致接种覆盖率下降,百日咳发病率呈现明显上升趋势。因此,筛选、制备安全有效的抗原成分,研制新一代无细胞疫苗是目前百日咳疫苗研究的主攻方向。无细胞百日咳疫苗主要包括百日咳毒素(Bordetella pertussis toxin,PT)和丝状血凝素,其中减毒的百日咳毒素是无细胞组分疫苗的重要成分。百日咳毒素为发现的***主要毒力因子之一,它是由6个亚单位(S1-S5)构成的A-B型毒素,其中,A原体由一分子的S1组成,为PT的毒性所在部位,PT的ADP-核糖转移酶活性和主要保护性抗原决定簇即位于该亚单位上,传统百日咳疫苗的毒副作用与S1亚单位的酶活性有关。由于PT基因的不连续性,使其不能直接体外表达。鉴于PT的主要保护性决定簇位于S1亚单位上,而且ADP-核糖转移酶试验表明,所有天然序列的rS1(recombinant S1)亚单位均具有酶活性,而部分变异的rS1亚单位均无可检出的酶活性,因此,突变的S1可能是良好的候选抗原。基于以上认识,本实验拟解决两个问题:一是百日咳毒素S1亚单位及其突变体高效表达问题。在这个过程中我们尝试过多种商品化的表达载体,如pET-22b、pET-28a、pET-11c、pQE-30等。并同时尝试融合表达是否能提高表达量,选用教研室自主研制的一种高效融合表达载体,其含有编码EspA伴体蛋白的核苷酸序列,使本身不表达或表达低的目的蛋白得到高效表达。EspA是肠出血性大肠杆菌O157:H7的Ⅲ型分泌系统相关蛋白,因此通过基因重组技术将EspA功能性肽段构建至表达载体上,从而达到促进外源蛋白高效表达的目的,并且EspA能够为目的蛋白提供潜在的粘膜佐剂功能。二是对S1及S1突变体rS1的生物学活性进行研究。主要结果如下: 1. *** S1的克隆表达采用PCR法自*** PT基因组扩增编码S1的约702bp基因,构建至克隆载体pMD18-T中,通过酶切、测序鉴定阳性重组子。应用生物信息学软件DNAssist和GenBank数据库对已公布的*** S1基因序列进行相似性分析。改变原核表达载体和诱导条件优化表达方案。将含目的基因片段的重组载体转化至大肠杆菌中,经IPTG诱导表达,用AKTA-explore纯化仪纯化重组表达的蛋白S1获得纯度约80%的抗原蛋白。应用Tris-Tricine电泳对表达产物和纯化产物进行分析,并采用Western blot鉴定重组蛋白的免疫原性。 2. EspA-S1融合蛋白的克隆表达采用重叠延伸PCR的方法,以EspA做为融合蛋白前端,与S1串联,在片段间引入5个氨基酸的linker PQDPP;将融合基因构建在原核表达载体pET-28a(+)中,经酶切及测序鉴定后,阳性重组子转化宿主菌*** BL21(DE3),IPTG诱导重组工程菌表达。Tris-Tricine电泳和免疫印迹鉴定融合蛋白。 3.百日咳毒素S1突变体rS1(S1-9K/129G)的构建表达。运用基因工程的定点突变技术,构建S1突变体rS1(S1-9K/129G)。构建至克隆载体pMD-18T中,通过酶切、测序鉴定阳性重组子。将含目的基因片段的重组载体pQE30-rS1转化至大肠杆菌M15中,经IPTG诱导表达,用AKTA-explore纯化仪纯化重组表达的蛋白,获得纯度约87%的目的蛋白。应用Tris-Tricine电泳对表达产物和纯化产物进行分析。 4.百日咳毒素S1突变体生物学作用研究。建立CHO细胞毒性模型。选用培养简单、生长周期较短、贴壁生长的CHO细胞,培养至对数生长期(OD600≈0.6),然后将贴壁生长在盖玻片上的CHO细胞与不同浓度的S1、rS1、PT于37℃,5%CO2共同孵育4h,姬姆萨染色及电镜观察。结果显示PT只要浓度达到20ng/ml即可使CHO细胞变形超过50%,而rS1即使达到了100ng/ml也无变形,S1对CHO细胞有变形效应。rS1与阳性对照PT及S1组差异显著(P日后每组每只小鼠采尾静脉血20μl并使用细胞计

关键词：百日咳杆菌生物学作用百日咳毒素S1亚单位突变体 EspA-S1融合蛋白

基于重组酶介导等温核酸扩增技术对百日咳杆菌快速检测体系的建立和应用

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基于重组酶介导等温核酸扩增技术对百日咳杆菌快速检测体系的建立...

作者：翁娇厦门大学

学位级别：硕士

百日咳杆菌(BP)是引起急性呼吸道传染病百日咳的致病菌,常见于新生儿和幼婴儿,主要临床表现为长期阵发性痉挛性咳嗽,咳嗽结束会出现类鸡鸣深长急促呼吸。一种高效快速确诊病因的方法对临床诊断和指导治疗是十分必要的。目前临床上对百... 详细信息

百日咳杆菌(BP)是引起急性呼吸道传染病百日咳的致病菌,常见于新生儿和幼婴儿,主要临床表现为长期阵发性痉挛性咳嗽,咳嗽结束会出现类鸡鸣深长急促呼吸。一种高效快速确诊病因的方法对临床诊断和指导治疗是十分必要的。目前临床上对百日咳的诊断主要是使用传统的细菌培养和血清学检测,上述方法检测周期长,操作复杂且灵敏度低。PCR技术的出现大大提高了核酸检测的灵敏度,但其依旧存在整个采样提取检测流程耗时长的问题。而新兴的重组酶介导扩增技术(RAA)在多种酶和蛋白的参与下可以在恒温条件实现核酸的指数级扩增,用时短,操作简便,十分适用于基层和现场快速诊断。本研究将RAA技术与冻干和核酸免提取技术结合,建立了一种快速、稳定、高敏感度、含内标的双重实时荧光BP-RAA检测体系,对人类呼吸道病原体百日咳杆菌进行检测。首先针对百日咳杆菌序列设计并筛选了高度保守的特异性引物,并且加入内部控制系统(Internal Control,IC),通过体系优化,建立了双重BP-RAA实时荧光检测体系。该体系能够在30分钟之内检测到低至10拷贝的BP标准品,大大缩短了百日咳诊断的整个检测时间,并且通过内控能够实时监测临床样本的提取、检测过程,保证结果的科学和有效性。同时,本研究进一步将BP-RAA体系与冻干技术结合,将其制备成冻干试剂,仅需复水、加样两个步骤即可上机检测,操作简单,并且冻干粉末状态稳定性好,在运输、储存和操作上更为方便。进一步的,本研究与核酸免提取技术结合,建立了一种集快速提取与检测为一体的百日咳杆菌检测体系,并对76例百日咳临床鼻拭子样本进行临床评价,50例百日咳阳性样本全部检出为阳性,26例百日咳阴性样本检测结果均为阴性,与RT-PCR检测结果一致,临床应用效果好。本研究的方法简化了核酸提取和扩增步骤,操作简单,反应时间短,灵敏度高,稳定性好便于储存运输,在临床上具有实际应用价值,有助于提高百日咳临床诊断和治疗的准确性和及时准确的流行病学处置。并为POCT即时快检的应用提供新思路!

关键词：重组酶介导的恒温扩增技术百日咳杆菌样本释放剂冻干

百日咳杆菌粘着素的分子克隆、表达、纯化及生物学特性研究

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微生物学免疫学进展 1997年第4期25卷 1-11页

作者：杨晓明何长民卫生部兰州生物制品研究所

大肠杆菌中克隆了编码百日咳杆菌粘着素（Ｐｅｒｔａｃｔｉｎ，Ｐｒｎ）１．９ｋｂ的结构基因，获得了４株表达Ｐｒｎ的重组菌株，以融合蛋白的形式，对Ｐｒｎ进行了表达。Ｐｒｎ融合蛋白的表达量占细胞总蛋白量的４６．４％。融合蛋白... 详细信息

大肠杆菌中克隆了编码百日咳杆菌粘着素（Ｐｅｒｔａｃｔｉｎ，Ｐｒｎ）１．９ｋｂ的结构基因，获得了４株表达Ｐｒｎ的重组菌株，以融合蛋白的形式，对Ｐｒｎ进行了表达。Ｐｒｎ融合蛋白的表达量占细胞总蛋白量的４６．４％。融合蛋白纯度达８９．２％。免疫印迹证明，抗天然Ｐｒｎ的单克隆抗体ＢＰＥ３能识别重组菌中及纯化的Ｐｒｎ融合蛋白。Ｐｒｎ融合蛋白能与抗百日咳杆菌Ⅰ相血清发生特异凝集反应。Ｐｒｎ融合蛋白及重组菌免疫小鼠后，对百日咳杆菌毒力株１８３２３的脑内攻击，保护率达６０～６２．５％。

关键词：百日咳杆菌粘着素分子克隆研制生物学特性

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百日咳杆菌与慢性咳嗽关系的临床分析

山西医药杂志（上半月） 2008年第2期37卷 174-175页

作者：李玫君忻州市第二人民医院 034100

成年人慢性咳嗽是非常普遍的,每年有很多成年人因为慢性咳嗽到医院就诊.但是引起慢性咳嗽的原因却经常被忽略,尤其是百日咳杆菌感染造成的慢性咳嗽.本研究旨在调查慢性咳嗽的原因为成年人百日咳杆菌(bordetella pertussis,***)感染的频率.

关键词：百日咳杆菌慢性咳嗽临床分析杆菌感染成年人医院就诊

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百日咳杆菌感染与成人不明原因慢性咳嗽相关性

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临床肺科杂志 2012年第8期17卷 1399-1400页

作者：文芳静徐志伟赵景景肖锦秀胡克武汉大学人民医院呼吸科湖北武汉430060 罗田县万密斋医院湖北罗田438000

目的探讨百日咳杆菌感染与成人不明原因慢性咳嗽的相关性。方法采集2010年12月至2011年8月因慢性咳嗽(咳嗽时间>8周,但不符合咳嗽指南中的任何一种原因)就诊于武汉大学人民医院64例患者血清,置于-20℃保存,应用ELISA方法测定患者血清中... 详细信息

目的探讨百日咳杆菌感染与成人不明原因慢性咳嗽的相关性。方法采集2010年12月至2011年8月因慢性咳嗽(咳嗽时间>8周,但不符合咳嗽指南中的任何一种原因)就诊于武汉大学人民医院64例患者血清,置于-20℃保存,应用ELISA方法测定患者血清中百日咳毒素的浓度。结果 64例患者中,仅1例为阳性,确诊为百日咳杆菌感染,另63例均呈阴性,百日咳杆菌感染阳性率为1.56%。结论慢性咳嗽患者百日咳感染检出阳性率低。

关键词：慢性咳嗽百日咳杆菌病因学

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