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百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素的研究进展

中国生物制品学杂志 2008年第12期21卷 1126-1128页

作者：吴丽洁徐颖华张庶民昆明理工大学生命科学与技术学院昆明650224 中国药品生物制品检定所血清室北京100050

鲍特百日咳杆菌分泌腺苷酸环化酶毒素,该毒素能够将其催化基团转运到真核细胞中,并由真核细胞的钙调蛋白激活,产生大量的cAMP。因此,腺苷酸环化酶毒素既可作为表位运输的工具,又有助于研究细菌毒素蛋白进入真核细胞的机制。本文就百日... 详细信息

鲍特百日咳杆菌分泌腺苷酸环化酶毒素,该毒素能够将其催化基团转运到真核细胞中,并由真核细胞的钙调蛋白激活,产生大量的cAMP。因此,腺苷酸环化酶毒素既可作为表位运输的工具,又有助于研究细菌毒素蛋白进入真核细胞的机制。本文就百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素的研究进展作一综述。

关键词：百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素钙调蛋白单磷酸腺苷真核细胞

百日咳杆菌气管定植因子（TcfA）的功能分析

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百日咳杆菌气管定植因子（TcfA）的功能分析

作者：柯兵兵中国食品药品检定研究院

学位级别：硕士

百日咳是由百日咳鲍特氏菌（以下简称百日咳杆菌）引起的一种呼吸道传染病，在婴幼儿当中较为常见。百日咳杆菌致病机理包括粘附、侵袭、产毒等一系列的过程。丝状血凝素（Filamentous hemagglutmin）、粘附素（Pertactin)、百日咳气管... 详细信息

百日咳是由百日咳鲍特氏菌（以下简称百日咳杆菌）引起的一种呼吸道传染病，在婴幼儿当中较为常见。百日咳杆菌致病机理包括粘附、侵袭、产毒等一系列的过程。丝状血凝素（Filamentous hemagglutmin）、粘附素（Pertactin)、百日咳气管定植因子（Tracheal colonization factor;TcfA）等诸多膜表面蛋白参与到细菌的粘附过程。百日咳气管定植因子是百日咳杆菌膜表面蛋白，相关文献报道，推测该蛋白可能是百日咳杆菌的粘附分子，但对其粘附功能尚未进行系统的验证。因此本研究采用DNA重组技术，在大肠杆菌（BL21;DE3）内表达TcfA蛋白，并纯化重组TcfA蛋白。然后通过重组表达菌的体外细胞粘附实验、重组蛋白免疫荧光实验、竞争抑制实验证明TcfA蛋白的黏附作用。并在此基础上，就TcfA蛋白第317-319位RGD三联肽的功能进行验证。同时通过构建FHA-PRN-基因缺失株，探究TcfA蛋白在粘附过程中的重要性，并尝试找出TcfA蛋白与经典模型细胞HeLa相互作用的受体。通过基因重组技术成功的表达了TcfA蛋白，并纯化出纯度达85%的重组蛋白，免疫印迹实验结果显示，重组蛋白能与疫苗生产菌株（CS菌）全菌体血清发生抗原抗体反应，说明重组蛋白具有良好的免疫反应性和抗原特异性;玻片凝集实验和V管凝集实验证明TcfA蛋白表达于大肠杆菌膜表面;荧光粘附试验证实表达有TcfA的大肠杆菌与含有空载体的大肠杆菌对经典模式细胞的粘附有明显的差异，CFU实验定量证实两者之间具有统计学差异。粘附ELISA实验从另一技术方法反映了两者之间具有统计学差异。重组蛋白的免疫荧光实验间接反映了TcfA蛋白与细胞受体的相互作用，重组蛋白的竞争抑制实验表明TcfA蛋白能竞争抑制重组TcfA大肠杆菌的粘附，并表现出蛋白浓度的依赖性。TcfA小鼠多抗封闭实验结果显示，封闭了重组大肠杆菌膜表面的TcfA蛋白，细菌的粘附率出现明显的下降，说明了TcfA蛋白的粘附的特异性（依赖性）。含RGD的短肽与含RGE的短肽的竞争抑制试验表明，TcfA蛋白可能通过其氨基酸位点上的RGD模序发挥作用。庆大霉素胞外杀伤实验是检测病原菌是否具有入侵宿主细胞能力的有效方法之一，该方法主要是检测粘附分子是否介导了病原菌的入侵。实验结果显示，TcfA蛋白并不介导重组大肠杆菌入侵HeLa细胞。FHA、PRN基因缺失株与抗TcfA小鼠多克隆抗体作用后，粘附力相比于FHA、PRN基因缺失株和CS野生株有较明显的下降，说明TcfA蛋白作为百日咳杆菌膜表面的一个粘附因子，在细菌的粘附过程中发挥着重要的作用。GST pull down实验初步证明Myosin-9蛋白可能是TcfA蛋白与HeLa细胞相互作用的受体，但需要进一步验证。

关键词：百日咳杆菌 TcfA蛋白粘附

百日咳杆菌CpG-ODNs对变应性哮喘小鼠Toll信号分子的实验研究

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百日咳杆菌CpG-ODNs对变应性哮喘小鼠Toll信号分子的实验研究

作者：张宝袁扬州大学

学位级别：硕士

变应性哮喘是以IgE过量合成、嗜酸性粒细胞和肥大细胞浸润、气道高反应性及气道重塑为主要特征的慢性气道炎症。哮喘发病率逐年上升,严重影响患者日常生活,有时甚至是致命的。近年来研究发现,变应性哮喘是一种Th1/Th2反应失衡的呼吸道疾... 详细信息

变应性哮喘是以IgE过量合成、嗜酸性粒细胞和肥大细胞浸润、气道高反应性及气道重塑为主要特征的慢性气道炎症。哮喘发病率逐年上升,严重影响患者日常生活,有时甚至是致命的。近年来研究发现,变应性哮喘是一种Th1/Th2反应失衡的呼吸道疾病,哮喘病程中,Th2反应占主导作用,产生Th2类细胞因子从而阻抗Thl反应,介导了嗜酸性粒细胞炎症及B细胞分泌IgE过程,调节Th1/Th2平衡调控哮喘已成为公认的治疗方法。百日咳杆菌为一类致病微生物,可诱发百日咳疾病。近年来医学工作者将灭活百日咳杆菌疫苗,白喉疫苗及破伤风疫苗合用形成百白破联用疫苗,以预防这三类疾病。也有研究发现灭活百日咳杆菌为一种Thl反应刺激剂,可产生防治变应性疾病作用。进一步研究发现灭活全细胞百日咳杆菌对小鼠变应性哮喘具有治疗作用,这可能与其中包含抗变应性哮喘活性的CpG-ODNs有关。非甲基化含CpG基序寡核苷酸单链（unmethylated CpG motif containing oli godeoxynucleotides,简称CpG-ODNs）为一类具有抗变应性疾病活性的DNA序列。目前研究发现4种亚型,即A型-D型。脊椎动物含有无活性的甲基化CpG-ODNs,无脊椎动物含有有活性的非甲基化CpG-ODNs。CpG-ODNs进入机体后,以胞吞作用进入细胞,与细胞内体中TOLL样受体-9（TLR-9）结合,激活TLR共刺激通路,诱导核因子（AP-1, NF-kappaB）转录,促进Thl细胞因子合成,抑制Th2型细胞因子分泌,使哮喘中失衡的Th1/Th2反应恢复平衡,产生调节变应性哮喘作用。前期研究主要涉及给予变应性哮喘小鼠灭活百日咳杆菌,对其调节变应性哮喘机制进行评价。结果发现给药后哮喘小鼠BALF中炎症细胞数下降,且外周血中IL-4/IFN-y恢复平衡,具有一定调节变应性哮喘机制的作用,这种作用可能由菌体内的CpG-ODNs产生,但对百日咳杆菌CpG-ODNs防治哮喘的机制研究未见报道。本研究基于前期研究,应用软件获取9条百日咳杆菌CpG-ODNs,进行抑制炎症细胞反应实验,筛选出抑制炎症细胞最佳CpG-ODNs序列seq A。后续研究中应用seqA给予OVA致敏小鼠慢性哮喘模型,检测其对变应性哮喘小鼠肺泡灌洗液（BALF）中Thl/Th2细胞因子（IFN-y/IL-4）及血管内皮生长因子（VEGF）产生量的影响,并通过RT-PCR和western blot法分别检测小鼠脾细胞TLR-9mRNA及肺组织TLR-9蛋白表达量。结果发现,seq A抑制炎症细胞效果最佳,其能够提高小鼠慢性哮喘模型BALF中IFN-y含量,抑制IL-4含量;但对VEGF作用并不明显。且其能够有效上调小鼠脾细胞TLR-9mRNA和肺组织TLR-9蛋白表达量,所有实验组中腹腔注射（ip）组均优于灌胃（ig）组。结果表明,百日咳杆菌CpG-ODNs具有抑制炎症细胞活性,seq A能够有效调节Th1/Th2反应,且其对TLR-9具有上调作用,证明这种活性与激活TLR-9信号通路有关,实验发现给予CpG-ODNs时ip途径优于ig途径。

关键词：变应性哮喘百日咳杆菌 CpG-ODNs Th1/Th2 Toll样受体9

培养条件对百日咳杆菌发酵中百日咳毒素及丝状血凝素表达的影响

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中国生物制品学杂志 2021年第7期34卷 816-818,823页

作者：杨勇吴永超张飞伟杨坤闵宪捷刘佐军雍雪飞刘少祥潘海龙成都生物制品研究所有限责任公司四川成都610023

目的探讨培养条件对百日咳杆菌发酵中百日咳毒素(pertussis toxin,PT)和丝状血凝素(filamentous haemagglutinin,FHA)表达的影响。方法采用300 L全自动发酵罐进行百日咳杆菌发酵培养,培养基为百日咳S-S培养基,搅拌通气培养,培养量200 L... 详细信息

目的探讨培养条件对百日咳杆菌发酵中百日咳毒素(pertussis toxin,PT)和丝状血凝素(filamentous haemagglutinin,FHA)表达的影响。方法采用300 L全自动发酵罐进行百日咳杆菌发酵培养,培养基为百日咳S-S培养基,搅拌通气培养,培养量200 L,温度3537℃,培养时间40 h,接种比例1∶121∶15。试验分为高PT表达组(搅拌转速为160 r/min,搅拌叶片为直叶,有挡板,培养020及2140 h的通气量分别为600和400 L/min)、高FHA表达组(搅拌转速为220 r/min,搅拌叶片为弯叶,无挡板,培养020及2140 h的通气量分别为400和600 L/min)及对照组(搅拌转速为180 r/min,搅拌叶片为直叶,有挡板,通气量为500 L/min),每组平行培养3批培养物。于培养结束时采用ELISA法检测PT及FHA含量。结果高PT表达组PT含量平均值达3.16μg/mL,比对照组(平均值2.23μg/m L)提升了41.7%(P百日咳发酵工艺中,高搅拌剪切力和较低的溶氧水平有利于PT的表达,低剪切力和高溶氧水平有利于提高FHA的产量。

关键词：百日咳毒素丝状血凝素百日咳杆菌发酵

培养基中氯化钠对百日咳杆菌CS株生长及百日咳毒素表达的影响

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中国生物制品学杂志 2015年第11期28卷 1138-1141页

作者：李应伟刘晓凤周晓舟夏永成都生物制品研究所有限责任公司四川成都610023

目的探讨培养基中氯化钠（Na Cl）对百日咳杆菌CS株生长及百日咳毒素（pertussis toxin,PT）表达的影响,确定最适PT表达的Na Cl加入方式。方法以MSS为起始培养基,补加不同浓度的Na Cl溶液,接种生产用百日咳杆菌Ⅰ相CMCC58003（CS株）后... 详细信息

目的探讨培养基中氯化钠（Na Cl）对百日咳杆菌CS株生长及百日咳毒素（pertussis toxin,PT）表达的影响,确定最适PT表达的Na Cl加入方式。方法以MSS为起始培养基,补加不同浓度的Na Cl溶液,接种生产用百日咳杆菌Ⅰ相CMCC58003（CS株）后,分别于不同时间取样;分别于接种菌种后不同时间补加Na Cl至7.5 g/L,于培养结束时（39 h）取样;分别于接种菌种后0和25 h时补加Na Cl至7.5 g/L,培养不同时间取样。上述样品分别测定菌浓度及PT表达量。结果起始培养基中Na Cl浓度越高,细菌生长越缓慢,菌浓度增加时间也越长,起始培养基中Na Cl浓度为7.5 g/L时,培养上清中PT表达量最高,达6.61μg/ml,比对照培养基（MSS）提高了15.6%。培养过程中在25 h时补加Na Cl,培养结束时PT表达量最高,为8.64μg/ml,比对照培养基（MSS）提高了43.28%,比0 h时补加Na Cl提高了26.13%。在25 h时补加Na Cl后,细菌的菌浓度增长期比MSS培养基培养延长了2~3 h,比0 h时补加Na Cl缩短了1~2 h,菌浓度在培养的中后期明显高于0 h时补加Na Cl,PT表达周期与生长曲线基本平行,当细菌生长进入衰退期时,PT也随之开始逐步降解。结论在培养前期,可采用含2.5 g/L Na Cl的MSS培养基使菌体快速生长,当进入抗原PT表达期后,可通过补加Na Cl来提高PT转录活性,从而提高PT的产量。

关键词： MSS培养基氯化钠百日咳杆菌百日咳毒素

百日咳杆菌LPF和FHA的纯化及其特性的研究

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信阳师范学院学报（自然科学版） 1993年第4期6卷 440-446页

作者：潘兹书何长民信阳师院生物系 464000 卫生部兰州生物制品研究所

采用羟基磷灰石、HP—Sepharose 4B和Sephadex G—200色层分析方法,精制出了单一的白细胞增多促进因子(LPF)和丝状血凝素(FHA)组分.经SDS—PAGE证明,精制LPF呈现四条带,其分子量分别为30,000、27,000、23,000和14,000;精制FHA呈现三条带... 详细信息

采用羟基磷灰石、HP—Sepharose 4B和Sephadex G—200色层分析方法,精制出了单一的白细胞增多促进因子(LPF)和丝状血凝素(FHA)组分.经SDS—PAGE证明,精制LPF呈现四条带,其分子量分别为30,000、27,000、23,000和14,000;精制FHA呈现三条带,其分子量分别为185,000、130,000、105,***检测证明,精制LPF为620EU/mL,精制FHA为402EU/mL;小鼠LP和HS活性测定结果证明,0.136μg的精制LPF可引起白细胞的明显增高,0.015μg可引起HS活性,0.29μg可引起组胺致敏小鼠50%的死亡;CHO细胞簇聚活性检测结果显示,3.3pg的精制LPF可引起CHO细胞明显的簇聚反应;免疫双扩散试验结果显示,精制LPF和FHA分别与其相应的抗LPF和抗FHA血清形成特异性的沉淀线;电镜结果显示,精制LPF呈直径约6nm的球形颗粒;精制FHA呈2×40—100nm的丝状结构.

关键词：白细胞增多百日咳杆菌纯化

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ELISA在检测百日咳杆菌免疫原中的应用

上海免疫学杂志 1992年第1期12卷 27-29页

作者：陈平纡杨晓明陈爱荣何长民卫生部兰州生物制品研究所兰州730046

本文采用ELISA技术,实验研究了LPF-ELISA和FHA-ELISA的最适条件以及LPF和FHA免疫原在纯化过程中的动态。实验结果表明,LPF-ELISA的HP最佳包被浓度为0.413μg/100μl;所用第二抗体(抗LPF兔血清)的最佳浓度为2.8EU/100μl。FHA-ELISA的抗... 详细信息

本文采用ELISA技术,实验研究了LPF-ELISA和FHA-ELISA的最适条件以及LPF和FHA免疫原在纯化过程中的动态。实验结果表明,LPF-ELISA的HP最佳包被浓度为0.413μg/100μl;所用第二抗体(抗LPF兔血清)的最佳浓度为2.8EU/100μl。FHA-ELISA的抗FHA豚鼠血清的最佳包被浓度为0.05EU/100μl,所用第二抗体(抗FHA兔血清)的最佳浓度为2.25EU/100μl。LPF和FHA在经培养、盐析、浸提、超速和分级离心后,其ELISA单位与蛋白量密切相关,呈同步消长。证明用LPF-ELISA和FHA-ELISA作新菌苗批量生产工序中的质量控制,是一种行之有效的方法。

关键词： ELISA 百日咳杆菌免疫原

百日咳杆菌69KDa外膜蛋白的分离纯化及生物学特性研究

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微生物学免疫学进展 1995年第2期23卷 65-72页

作者：孙述学何长民卫生部兰州生物制品研究所

本文发展了一种从百日咳杆菌Ⅰ相菌株中纯化６９ＫＤａ外膜蛋白的简易方法，将细菌体经加热浸提、乙醇沉淀蛋白、ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ＿（５０）柱层析精制而成。用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、免疫印迹、光密度仪扫描分析，证明纯化制... 详细信息

本文发展了一种从百日咳杆菌Ⅰ相菌株中纯化６９ＫＤａ外膜蛋白的简易方法，将细菌体经加热浸提、乙醇沉淀蛋白、ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ＿（５０）柱层析精制而成。用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、免疫印迹、光密度仪扫描分析，证明纯化制剂为均一的、特异性的６９ＫＤａ外膜蛋白，其收率为５４．２％，纯度达９９．２％，每微克６９ＫＤａ蛋白制。剂中内毒素含量低于０．８５ＥＵ；ＰＴ残留量小于０．１０５ｎｇ。ｆＬ６９ＫＤａ蛋白抗血清能凝集含有３因子凝集原的百日咳菌株。用纯化的６９ＫＤａ蛋白免疫小鼠，能够保护小鼠抵抗致死剂量的１８３２３菌株的脑内攻击，与ＰＴ、ＦＨＡ组成的无细胞百日咳菌苗的效力，较含ＰＴ和ＦＨＡ的组分菌苗为高。表明６９ＫＤａ蛋白与ＰＴ、ＦＨＡ显示协同保护作用，有望成为无细胞百日咳菌苗的另一候选组分。

关键词：百日咳杆菌 69KDa外膜蛋白菌苗分离提纯

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百日咳杆菌单克隆抗体的分离与鉴定

国外医学.预防.诊断.治疗用生物制品分册 1985年第6期 277-278页

作者：黄家彬

百日咳杆菌的组分及产物甚多,其中不少都与该菌的致病力或免疫保护性有密切关系,除脂多糖(LPS)外,非致病性百日咳菌株往往没有这些成份。为确切了解诸成份与致病力及免疫原性的关系,作者采用改良的

关键词：百日咳杆菌抗原博德特杆菌属单克隆抗体杂交瘤细胞系