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鲤白细胞介素17b的原核表达及功能研究

鲤白细胞介素17B的原核表达及功能研究

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作者：徐逾鑫南京农业大学

学位级别：硕士

白细胞介素17(Interleukin-17,IL-17)是一种重要的炎症因子,可诱导多种炎症相关的趋化因子、细胞因子及抗菌蛋白的产生,在机体的宿主防御中(抵抗病原体感染和自身免疫性疾病)发挥重要作用。自1993年首次发现IL-17A之后,IL-17家族其他成... 详细信息

白细胞介素17(Interleukin-17,IL-17)是一种重要的炎症因子,可诱导多种炎症相关的趋化因子、细胞因子及抗菌蛋白的产生,在机体的宿主防御中(抵抗病原体感染和自身免疫性疾病)发挥重要作用。自1993年首次发现IL-17A之后,IL-17家族其他成员相继被发现,并按照顺序命名为IL-17b～F。IL-17在氨基酸序列上具有同源性,尤其是在羧基(C)端的4个β折叠以及4个半胱氨酸与2个丝氨酸残基形成的半胱氨酸结节上同源性更高,与IL-17A和IL-17F相比,IL-17b、IL-17C和IL-17E的序列在N端的延伸更长。迄今为止,IL-17家族成员已在斑马鱼(Danio rerio)、鲤(Cyprinus carpio)、(Miichthys miiuy)、河豚(Tetraodontidae)、青鳉(Oryzias latipes)、草鱼(Ctenopharyngodon idella)、大西洋鲑(Salmo salar)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、海鲈鱼(Dicentrarchus labrax)、鲶(Silurus asotus)等中得到鉴定。本实验通过同源搜索和基因克隆在NCbI中挖掘到Cc IL-17b1和Cc IL-17b2,分析了它们的序列特征,进行了线性分析;通过q PCR测定Cc IL-17b1和Cc IL-17b2的时空表达;构建原核重组表达载体p ET43.1a-17b进行原核表达,纯化获得可溶的重组蛋白Nus A-17b;体内肛灌不同浓度(5μg/kg、50μg/kg、500μg/kg)的重组蛋白Nus A-17b,取肠道组织进行组织病理学观察并测定体肾、肝脏、脾脏、肠道炎症因子IL-1β、IFN-γ、IL-6,趋化因子CCL20,NF-Kb和TRAF6的表达情况;体外使用不同浓度(0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml)的重组蛋白Nus A-17b孵育鲤肾组织8h后,同样测定上述基因的表达情况。序列分析表明:两个基因结构一致,均由三个外显子和两个内含子组成,两基因开放阅读框长度一致(597 bp),均由外显子1后端的24bp、外显子2的320bp和外显子3前端的253bp组成,编码198个氨基酸,其中N端24个氨基酸为信号肽,成熟肽均由较长的N端(82个氨基酸)、保守的中心结构域(90个氨基酸)和较短的C端(2个氨基酸)组成,分子量分别为22.58k Da、22.49k Da,等电点(p I)分别为9.59、9.83,蛋白一致性为91.92%;两基因的内含子长度分别为84bp、420bp和81bp、851bp。结构域比对结果显示,所有鱼类IL-17bs的中心结构域高度保守,包括7个保守的半胱氨酸残基。氨基酸序列比对结果显示,Cc IL-17b1、Cc IL-17b2与Cc IL-17其他家族成员的一致性分别为13.8%～24.5%和12.5%～24.5%,与人和其他硬骨鱼类IL-17b的一致性分别为42.8%～98%和39.4%～93.9%。系统发育树显示,整个进化树分为三个分支,所有鱼类IL-17b与人IL-17b以99%置信率聚为一支,鲤IL-17Cs和鲤IL-17Ds以46%置信度聚为一支,鲤IL-17A/Fs和鲤IL-17Ns以22%置信度聚为一支。线性分析显示,鲤经特异基因组复制,应该含有两个不同的Cc IL-17bs,但目前只找到一个连锁群上有IL-17b,其上游基因为rspo2,下游基因为rpl26。使用q PCR测定鲤受精卵发育阶段、仔鱼阶段以及成鱼不同组织中IL-17bs的表达。结果显示,Cc IL-17b1和Cc IL-17b2在鲤受精卵发育早期(0h～12h)的表达量显著高于鲤受精卵发育后期(25h～90h)和仔鱼阶段(1D～14D);Cc IL-17b1和Cc IL-17b2均在成鱼的性腺中高表达,其中在精巢中的表达量显著高于卵巢,不同的是除性腺外,Cc IL-17b1在肌肉中的表达量显著高于脾脏、心脏、体肾、头肾、肠道、鳃,Cc IL-17b2在皮肤中的表达量显著高于脾脏、心脏、体肾、头肾、肠道、鳃、肝脏、肌肉。通过构建重组质粒p ET43.1a-17b和p ET43.1a,并通过原核表达和镍柱纯化获得重组蛋白Nus A-17b和Nus A,与不同浓度的bSA蛋白标准品比对后确定蛋白浓度,每克总菌约获得0.23mg Nus A-17b蛋白和0.398mg Nus A蛋白。肛灌不用浓度(5μg/kg、50μg/kg、500μg/kg)的重组蛋白Nus A-17b后取高浓度组中鲤肠道进行组织病理学观察,结果显示,肛灌第1、3d,肠道组织结构损伤,肠绒毛缺损,出现大量的杯状细胞,炎性细胞聚集;肛灌第7d,肠道组织中的杯状细

关键词：鲤白细胞介素17b 基因表达原核表达炎症

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IL-17b在金黄色葡萄球菌感染过程中的抑炎作用及机制研究

IL-17B在金黄色葡萄球菌感染过程中的抑炎作用及机制研究

引用

作者：广承灵重庆理工大学

学位级别：硕士

研究背景:金黄色葡萄球菌(以下简称金葡菌)是一种存在于环境中的常见细菌,广泛分布在人体的皮肤、黏膜和呼吸道中。其特征性的金黄色分泌物使其在细菌培养基上易于辨识。金黄色葡萄球菌是一种潜在病原菌,在临床上当其感染扩散到血液或... 详细信息

研究背景:金黄色葡萄球菌(以下简称金葡菌)是一种存在于环境中的常见细菌,广泛分布在人体的皮肤、黏膜和呼吸道中。其特征性的金黄色分泌物使其在细菌培养基上易于辨识。金黄色葡萄球菌是一种潜在病原菌,在临床上当其感染扩散到血液或器官时,机体免疫系统激活产生大量炎症介质,如细胞因子和白细胞趋化因子,从而导致炎症风暴,这一过程加重感染病情,损害器官功能,甚至可导致多脏器功能衰竭和死亡。当前对待金葡菌感染常采用抗生素治疗,然而长期过量使用抗生素,尤其是在医疗机构或畜牧业中频繁使用抗生素,已经导致金黄色葡萄球菌出现多重抗药性的情况。这意味着传统的抗生素治疗可能不再有效,因此开发非抗生素手段对抗金葡菌引发的炎症风暴是迫切需要的。白细胞介素17b(interleukin17b,以下简称IL-17b)是白细胞介素17家族的一员,在已有研究中发现IL-17b在多种炎症模型中存在抑制炎症的作用,其作用机制是通过与IL-17受体b(interleukin17 receptor b,以下简称IL-17Rb)结合发挥下调炎性细胞因子的效果,而IL-17Rb为IL-17b和IL-17E(interleukin17E,IL-17E或称interleukin25,IL-25)共用受体,二者生理功能并不相同,且存在竞争性结合IL-17Rb的现象。本研究以多种巨噬细胞为研究对象,在细胞水平上利用RT-PCR、ELISA、蛋白质免疫印迹法(western blot,Wb)等方法探究IL-17b在金葡菌感染过程中发挥的作用及作用机制,并初步探究IL-17E(IL-25)在此过程中的影响。研究目的:1.在细胞水平上探究金葡菌感染巨噬细胞后IL-17b的炎症调控作用。2.在细胞水平上探究金葡菌感染条件下IL-17b与IL-17E(IL-25)相互调控对巨噬细胞炎症反应的影响。研究方法:1.分离野生和IL-17b-/-小鼠腹腔巨噬细胞(Peritoneal macrophages,PMs),用金葡菌(***,USA300)感染后提取总RNA通过RT-PCR检测IL-1β、IL-6、IL-12P40、TNF-α的转录水平。通过Western bolt检测炎症通路蛋白变化情况。2.用金葡菌感染小鼠肺泡巨噬细胞系(Mouse alveolar macrophages,MHS)一小时后外加鼠源重组蛋白IL-17b,六小时后提取总RNA检测IL-1β、IL-6、IL-12P40、TNF-α的转录水平,另收集细胞培养上清通过ELISA检测IL-1β、IL-6、IL-12P40、TNF-α等蛋白分泌水平。通过Western bolt检测炎症通路蛋白变化情况。3.用金葡菌感染小鼠肺泡巨噬细胞系(Mouse alveolar macrophages,MHS)一小时后外加不同浓度鼠源重组蛋白IL-17b,六小时后提取总RNA,检测其中IL-17b、IL-17E(IL-25)的转录水平,收集细胞培养上清通过ELISA检测IL-17E(IL-25)的表达水平。4.用金葡菌感染小鼠肺泡巨噬细胞系(Mouse alveolar macrophages,MHS)一小时后外加鼠源重组蛋白IL-17E(IL-25),六小时后提取总RNA检测IL-1β、IL-6、IL-12P40、TNF-α的转录水平。研究结果:金葡菌感染后,IL-17b-/-PMs中IL-1β、IL-6、IL-12P40、TNF-α转录水平明显高于野生小鼠PMs;Western blot结果显示IL-17b-/-PMs中MAPK通路中关键蛋白P38磷酸化程度明显升高;RT-PCR、ELISA检测结果中发现金葡菌感染MHS外加重组蛋白IL-17b明显使得IL-1β、IL-6、IL-12P40、TNF-α的转录水平和表达水平下降但当IL-17b浓度达到一定阈值后该现象减弱;Western blot检测到金葡菌感染MHS后外加重组蛋白IL-17b使MAPK通路中关键蛋白P38磷酸化程度明显降低;RT-PCR、ELISA检测结果中发现金葡菌感染MHS外加重组蛋白IL-17b上调IL-17E(IL-25)的转录表达;RT-PCR检测结果中发现金葡菌感染MHS外加重组蛋白IL-17E(IL-25)显著促进IL-1β、IL-6、IL-12P40、TNF-α的转录表达,发挥促炎作用。研究结论:***-17b在金葡菌感染过程中有明显的抑制炎症作用。***-17b通过下调MAPK通路中P38的磷酸化达到抑制炎症作用。3.低浓度或高浓度IL-17b明显促进IL-17E(IL-25)的转录表达。***-17E(IL-25)竞争结合IL17Rb,促进金葡菌感染诱导的炎症反应,进而减弱IL-1

关键词：金黄色葡萄球菌白细胞介素17b 巨噬细胞非抗生素治疗手段

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