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作者：潘小幸华中科技大学

学位级别：硕士

微生物脂肪酶具有底物选择性广、反应条件温和、在有机反应体系中稳定性好、副反应和副产物少等优点，是目前市场上应用最广泛的生物催化剂之一。但游离脂肪酶成本高、难以回收利用，而用传统的方法进行固定化的脂肪酶纯化操作复杂、回... 详细信息

微生物脂肪酶具有底物选择性广、反应条件温和、在有机反应体系中稳定性好、副反应和副产物少等优点，是目前市场上应用最广泛的生物催化剂之一。但游离脂肪酶成本高、难以回收利用，而用传统的方法进行固定化的脂肪酶纯化操作复杂、回收较困难，这些缺点均限制了脂肪酶在工业中的大规模应用。为解决这些问题，本文以白地霉脂肪酶为研究对象，选择酿酒酵母细胞壁蛋白a凝集素为锚定蛋白，分别采用酿酒酵母和毕赤酵母两种真核表面展示系统对其进行表面展示，得到了稳定性提高、生产成本相对低廉的白地霉脂肪酶全细胞催化剂。在此基础上，研究了酵母表面展示白地霉脂肪酶的酶学性质，并筛选优良的全细胞催化剂用于催化鱼油水解富集DHA和EPA，为其大规模工业化应用奠定基础。本文的主要研究工作和创新点如下：（1）首次以N-末端锚定在酿酒酵母细胞壁上的a凝集素为锚定蛋白，将白地霉脂肪酶GCL展示在酿酒酵母EBY100细胞表面。表面展示的GCL对水解pNPC的酶活力为43.7±0.5U/g干细胞，但无法水解橄榄油，推测其可能原因是展示效率不高或酿酒酵母的过糖基化修饰造成酶蛋白的活性中心被遮蔽。酿酒酵母表面展示GCL的最适反应温度和pH分别为40°C和8.5，热稳定性较游离酶有较大的提高，在40°C水浴中温浴3h后残余活力为85%。（2）以酿酒酵母细胞壁蛋白a凝集素为锚定蛋白，成功构建了新的毕赤酵母表面展示载体pPICZXFa。将白地霉脂肪酶基因克隆到该载体中得到pPICZXFa-△GCL，用BstX I线性化后电转入毕赤酵母X-33中，得到重组菌株X-33/pPICZXFa-△GCL。通过摇瓶发酵筛选到一株展示酶活力最高的5#重组子，并对其发酵培养基和条件进行了优化。在甲醇添加量为1%（v/v），接种量为4%（v/v），初始pH7.0的条件下，表面展示的GCL不仅能水解橄榄油且其酶活力由最初的180.2±4.45U/g干细胞提高到273±2.4U/g干细胞。（3）分别以pNPC和橄榄油为底物，考察了毕赤酵母表面展示的GCL水解对硝基苯酚酯和甘油三酯的最适反应温度和pH、热稳定性等酶学性质，评价其应用价值。以pNPC为底物时，其最适反应温度和pH分别为40°C和9.0，在40°C水浴中温浴6h后，残余酶活力为80%;以橄榄油为底物时，其最适反应温度和pH分别为45°C和7.5，在45°C水浴中温浴4h后，残余酶活力为80%。（4）首次利用固定化在毕赤酵母细胞表面的GCL催化鱼油水解，探索其作为全细胞催化剂富集DHA和EPA的工业应用潜能。结果表明：其催化水解鱼油反应14h后，水解度达到最大值28.6%，此时EPA和DHA含量分别为1.85%和30.86%，与原始鱼油相比分别提高了1.21倍和1.29倍，富集后的DHA和EPA总得率为46.62%。

关键词：白地霉脂肪酶表面展示酿酒酵母毕赤酵母 DHA和EPA的富集

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白地霉脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达与高密度发酵研究

白地霉脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达与高密度发酵研究

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作者：智晓燕华中科技大学

学位级别：硕士

白地霉脂肪酶(Geotrichum candidum lipase，GCL)对具有C9位顺式双键的长链不饱和脂肪酸（如油酸、亚油酸和亚麻酸）具有高度底物特异性，可广泛应用于油脂改性、对映体药物拆分和生物柴油制备等领域。但其自然产量极低无法满足大规模... 详细信息

白地霉脂肪酶(Geotrichum candidum lipase，GCL)对具有C9位顺式双键的长链不饱和脂肪酸（如油酸、亚油酸和亚麻酸）具有高度底物特异性，可广泛应用于油脂改性、对映体药物拆分和生物柴油制备等领域。但其自然产量极低无法满足大规模应用的需要。因此，利用基因工程技术实现其异源高效表达，对该酶的工业化应用具有重要意义。本文构建了4种含有gcl基因的表达载体，同时构建了6种单启动子表达gcl基因的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)重组菌株、3种双启动子表达gcl基因的***重组菌株和1种同时含有vgb基因和gcl基因的P. pastoris重组菌株。优化了含有gcl基因的P. pastoris重组菌株摇瓶发酵条件，将筛选得到的5种P. pastoris重组菌株进行了10-L发酵罐高密度发酵。主要研究内容和结果如下： 1、以实验室保存的质粒DNA为模板扩增gcl基因，构建了诱导型表达载体pPIC9K-gcl、pPICZα-gcl、pFLDZα-gcl和组成型表达载体pGAPZα-gcl，分别电转至P. pastoris GS115或X-33中，得到6种基因工程菌，分别是GS115/9Kgcl、X-33/Zα-gcl、GS115/Zα-gcl、X-33/FLD-gcl、GS115/FLD-gcl和X-33/GAP gcl。采用BMMY-橄榄油罗丹明B平板和摇瓶发酵筛选到1株酶活力最高的转化子GS115/9Kgcl78#，初始酶活力达220U/mL，并对此菌株进行单因子摇瓶发酵优化。当摇瓶发酵条件为甲醇诱导96h，每24h甲醇添加量1%，接种量2%，培养基初始pH7.0，摇瓶装液量50mL(500mL摇瓶)，甲醇诱导温度25℃时，酶活力可达735U/mL，是初始酶活力的3.34倍。 2、以实验室保存的质粒DNA为模板扩增透明颤菌血红蛋白(Vitreoscillahemoglobin，VHb)的基因vgb，构建载体pPICZX-vgb。以菌株GS115/9Kgcl78#为宿主，二次电转构建了3种双启动子重组菌和1种同时含有vgb基因和gcl基因的耐低氧重组菌。摇瓶发酵筛选得到3个双启动子高活力菌株GS115/9Kgcl-Zαgcl51#、GS115/9Kgcl-FLDgcl26#和GS115/9Kgcl-GAPgcl63#，它们的酶活力分别比GS115/9Kgcl78#提高40.8%，53.8%和27.5%。装液量100mL (500mL摇瓶)时，含有vgb基因的耐低氧重组菌株GS115/9Kgcl-ZXvgb43#，能够减弱低氧对GCL表达的抑制作用。 3、运用基于TaqMan探针法的荧光定量PCR技术确定了重组菌GS115/9Kgcl68#、 GS115/9Kgcl78#、 GS115/9Kgcl86#、 GS115/9Kgcl-Zαgcl51#、GS115/9Kgcl-FLDgcl26#、GS115/9Kgcl-GAPgcl-63#的gcl基因拷贝数分别为2、3、1、5、4和4。确定了GS115/9Kgcl-ZXvgb43#中含有1个vgb基因拷贝。将重组菌约63kDa目的蛋白在MALDI-TOF-TOF中进行蛋白质质谱分析，通过软件Mascot搜索数据库鉴定出重组菌表达的目的蛋白是GCL。经Endo H糖苷内切酶酶切的GCL约为60kDa，与预测GCL大小一致，证实了GCL在P. pastoris异源表达过程中存在糖基化修饰。 4、在10-L发酵罐高密度发酵中，以FM22基础盐培养基生长菌体，以甲醇进行诱导，单启动子重组菌GS115/9Kgcl78#的酶活力为6200U/mL。重组菌GS115/9Kgcl-Zagcl51#、 GS115/9Kgcl-Zαgcl26#、 GS115/9Kgcl-Zαgcl63#和GS115/9Kgcl-ZXvgb43#的酶活力分别比GS115/9Kgcl78#提高了45.2%、79.0%、35.5%和18.5%。其中，重组菌GS115/9Kgcl-Zαgcl26#的酶活力和酶活生产率较高，分别为11100U/mL和75.14U/(mL·h)，在这五种重组菌中均处于最高水平。本文利用双启动子策略和VHb共表达策略实现了GCL在P. pastoris中的高效表达，筛选到的重组菌在摇瓶和10-L发酵罐水平均获得很高的表达量，为GCL的工业化生产奠定了坚实的技术基础。

关键词：白地霉脂肪酶毕赤酵母双启动子透明颤菌血红蛋白摇瓶优化高密度发酵

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潜力工业催化剂——白地霉脂肪酶

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食品与发酵工业 2008年第5期34卷 128-133页

作者：阎金勇闫云君华中科技大学生命科学与技术学院教育部分子生物物理重点实验室

白地霉脂肪酶因具有独特的底物特异性,在油脂改性等领域有着广泛应用。文中概述了白地霉脂肪酶的发酵生产、分离纯化、克隆与表达、底物特异性分子机理及应用等,并展望其未来发展方向,为该工业催化剂的研发与广泛应用提供参考。

关键词：白地霉脂肪酶分离纯化表达底物特异性应用

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毕赤酵母高密度发酵生产白地霉脂肪酶研究

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作者：柯锋华中科技大学

学位级别：硕士

白地霉脂肪酶(Geotrichum candidum lipase，GCL)对具有C9位顺式双键的长链不饱和脂肪酸具有高度底物特异性，基于这一性质可选择性地水解脂肪酸而富集高营养价值的多不饱和脂肪酸或选择性酯化分离共轭亚油酸异构体，应用潜力巨大。本... 详细信息

白地霉脂肪酶(Geotrichum candidum lipase，GCL)对具有C9位顺式双键的长链不饱和脂肪酸具有高度底物特异性，基于这一性质可选择性地水解脂肪酸而富集高营养价值的多不饱和脂肪酸或选择性酯化分离共轭亚油酸异构体，应用潜力巨大。本文对含有GCL B基因的重组毕赤酵母(Pichia pastoris)Mut+表型和Muts表型工程菌进行了摇瓶发酵条件优化及10-L发酵罐高密度发酵产酶条件优化。主要研究结果如下： (1)将实验室构建的X-33/pPICZα-gcl57#进行罗丹明B平板检测及摇瓶发酵酶活验证，其初始酶活力为140U/mL(橄榄油乳化液,碱式滴定法)。对该菌株的摇瓶发酵条件进行了优化，其最佳产酶条件为装液量40mL/500mL三角瓶、pH7.0、诱导时间72h、甲醇添加量1%，优化后酶活力达到375U/mL。对57#重组子进行了10-L发酵罐高密度发酵条件优化研究，其最佳诱导产酶条件为：细胞生长阶段温度29.0°C、pH5.0，诱导阶段温度27.0°C、pH6.0。最佳条件下发酵162.8h，生物量达到338g/L，蛋白含量达到2.68g/L，酶活力达到5,000U/mL，酶活生产率达到30.69U/(mL·h)。采用甲醇与甘油混合补料，发酵139.8h生物量达到398g/L，蛋白含量达到2.56g/L，酶活力达到5,600U/mL，酶活生产率达到40.06U/(mL·h)，相对甲醇单独补料酶活提高16.7%，酶活生产率提高46.0%;而采用甲醇与山梨醇混合补料，发酵123h生物量达到395g/L，蛋白含量达到2.74g/L，酶活力达到6,000U/mL，酶活生产率达到48.78U/(mL·h)，相对甲醇单独补料酶活提高25.0%，酶活生产率提高78.2%。 (2)通过电转将载体pPICZα-gcl整合至P. pastoris KM71H中，得到一株酶活力最高达215U/mL的Muts表型33#重组子，其摇瓶诱导产酶最佳甲醇添加量为0.6%。对其进行10-L发酵罐高密度发酵，甲醇单独诱导发酵196.7h，生物量达到332g/L，蛋白含量达到2.61g/L，酶活力达到5,450U/mL，酶活生产率达到27.69U/(mL·h)。采用甲醇与山梨醇混合补料发酵168.3h，生物量达到394g/L，蛋白含量达到3.06g/L，酶活力达到6,500U/mL，酶活生产率达到38.62U/(mL·h)。 (3)将实验室构建的双启动子重组菌GS115/9Kgcl-FLDgcl26#进行10-L发酵罐混合碳源补料发酵研究。以甲醇和山梨醇作为混合碳源进行诱导，发酵113.1h，生物量达到396g/L，蛋白含量达到4.52g/L，酶活力达到11,200U/mL，酶活生产率达到98.98U/(mL·h)。 (4)对比三株工程菌在10-L发酵罐中的发酵特性及产酶情况，结论为：Muts型参数变化较Mut+型更稳定;甲醇与山梨醇混合补料可以明显减少色素(FAD)的产生;采用甲醇与山梨醇混合补料相对甲醇单独补料，酶活力提高20%，酶活生产率提高30%0%;而采用分子手段构建的双启动子工程菌，其酶活相对单一启动子工程菌提高约1倍，酶活生产率也提高1倍左右。

关键词：白地霉脂肪酶毕赤酵母摇瓶优化高密度发酵混合补料

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