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痢疾杆菌效应蛋白调节宿主蛋白质泛素化信号途径的结构生物学研究

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痢疾杆菌效应蛋白调节宿主蛋白质泛素化信号途径的结构生物学研究

作者：金梦梦浙江大学

学位级别：硕士

痢疾杆菌是细菌性痢疾的病原菌,它能够利用自身毒性质粒编码的三型分泌系统向宿主细胞内分泌效应蛋白。效应蛋白以宿主细胞内的关键信号分子为靶标,调节细胞内的信号通路,以利于痢疾杆菌在宿主细胞内增殖转移。蛋白质泛素化途径是细胞... 详细信息

痢疾杆菌是细菌性痢疾的病原菌,它能够利用自身毒性质粒编码的三型分泌系统向宿主细胞内分泌效应蛋白。效应蛋白以宿主细胞内的关键信号分子为靶标,调节细胞内的信号通路,以利于痢疾杆菌在宿主细胞内增殖转移。蛋白质泛素化途径是细胞内极其重要的一个翻译后修饰途径,因此也常常被效应蛋白作为攻击目标。本文以痢疾杆菌效应蛋白OspI和IpaH3为研究对象,利用结构生物学的方法,解析效应蛋白调节宿主泛素化过程的分子机制。已有研究发现痢疾杆菌效应蛋白OspI能够使Ubc13的Gln100脱酰胺化,导致Ubc13失活,破坏了宿主细胞内的NF-kB信号通路。IpaH3作为一个泛素连接酶,能够特异地结合共价连接有泛素的UbcH5c,在下游底物上连接形成K48的泛素链。但是,OspI-Ubcl3与IpaH-UbcH5c间相互作用的分子机制仍是一个未解之谜。本文通过原核表达系统高效表达了OspI及其宿主靶分子泛素结合酶Ubc13,并通过纯化获得二者的高纯度重组蛋白,二者经孵育后形成稳定的效应蛋白-宿主靶分子复合物。通过复合物结晶实验,我们获得了衍射分辨率为2.3埃的复合物晶体。通过结构分析,我们发现OspI通过两个不同的表面电荷区与Ubc13的α1-螺旋、L1loop和L2loop相互作用,也进一步揭示了OspI的脱酰胺酶催化机制。另外,我们通过原核表达系统,高效表达和纯化获得了IpaH3的重组蛋白,并且成功地在体外合成了Ub共价连接的泛素结合酶UbcH5c （UbcH5c-Ub）。然后,我们利用分子筛证明了IpaH3与UbcH5c-Ub之间的相互作用。在经孵育后筛选,我们获得了许多的结晶条件,从众多条件中成功筛选到IpaH3-UbcH5c-Ub复合物晶体。接下来我们需要进一步解析IpaH3-UbcH5c-Ub复合物晶体结构,进而阐明二者之间的相互作用。

关键词：痢疾杆菌效应蛋白蛋白泛素化结构生物学

嗜酸乳杆菌和酪酸梭菌协同抑制痢疾杆菌的活性研究

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中国药科大学学报 2015年第1期46卷 117-122页

作者：王艺宙方凯王慧窦洁周长林中国药科大学生命科学与技术学院南京210009

以嗜酸乳杆菌和酪酸梭菌为研究对象,用琼脂扩散法检测其纯培养和共培养后的发酵液对福氏痢疾杆菌的体外抑菌活性。结果表明,嗜酸乳杆菌和酪酸梭菌共培养液对福氏痢疾杆菌具有良好的协同抑制作用,其共培养液抑菌作用较嗜酸乳杆菌和酪酸... 详细信息

以嗜酸乳杆菌和酪酸梭菌为研究对象,用琼脂扩散法检测其纯培养和共培养后的发酵液对福氏痢疾杆菌的体外抑菌活性。结果表明,嗜酸乳杆菌和酪酸梭菌共培养液对福氏痢疾杆菌具有良好的协同抑制作用,其共培养液抑菌作用较嗜酸乳杆菌和酪酸梭菌纯培养,其抑菌作用分别增强了17.2%和22.4%。同时,嗜酸乳杆菌和酪酸梭菌存在共生关系,共培养后生物量可达4.27 g/L(干重),较嗜酸乳杆菌和酪酸梭菌纯培养生物量分别提高6.0%和30.6%,且共生可使产酸增多,从而达到协同抑菌效果。对福氏痢疾杆菌黏附人结肠腺癌Caco-2细胞的研究表明,嗜酸乳杆菌和酪酸梭菌能协同抑制福氏痢疾杆菌对Caco-2细胞的黏附,Caco-2与混合益生菌、嗜酸乳杆菌和酪酸梭菌共孵育的组别,其福氏痢疾杆菌的相对黏附率分别降低了84.2%,81.2%和75.8%,相对应的Caco-2细胞的活力分别提高了22.9%,12.5%和11.5%。本研究首次发现两种益生菌嗜酸乳杆菌和酪酸梭菌具有共生关系,并且在体外能够协同抑制肠道致病菌福氏痢疾杆菌的生长和黏附,对于由福氏痢疾杆菌引起的细菌性痢疾治疗具有临床应用前景。

关键词：嗜酸乳杆菌酪酸梭菌协同抗菌活性痢疾杆菌复合益生菌黏附抑制

狼爪瓦松提取物对伤寒杆菌和痢疾杆菌的抑菌活性机制

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吉林大学学报（理学版） 2017年第6期55卷 1621-1625页

作者：张蕾潘一鸣宛春雷闫兵李洪铭于琪牡丹江师范学院生命科学与技术学院黑龙江牡丹江157011

研究狼爪瓦松提取物对伤寒杆菌和痢疾杆菌的抑菌效果及机理.实验结果表明:乙酸乙酯相、石油醚相和氯仿相对伤寒杆菌和痢疾杆菌有明显的抑菌效果,与对照组相比差异极显著(p<0.01),各提取物对实验菌的最小抑菌质量浓度(MIC)差异较大,乙酸... 详细信息

研究狼爪瓦松提取物对伤寒杆菌和痢疾杆菌的抑菌效果及机理.实验结果表明:乙酸乙酯相、石油醚相和氯仿相对伤寒杆菌和痢疾杆菌有明显的抑菌效果,与对照组相比差异极显著(p杆菌的MIC为1.5 mg/mL,乙酸乙酯提取液对痢疾杆菌的MIC为1mg/mL;各种瓦松提取液作用于伤寒杆菌和痢疾杆菌可导致菌体内有电解质渗透,与对照组相比差异显著(p杆菌和痢疾杆菌生长,其抑制作用随提取液质量浓度的提高及作用时间的延长而提高.

关键词：狼爪瓦松伤寒杆菌痢疾杆菌抑菌作用

痢疾杆菌福氏5型M90T株毒力相关膜蛋白复合物的分离鉴定

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痢疾杆菌福氏5型M90T株毒力相关膜蛋白复合物的分离鉴定

作者：龚益熊南昌大学

学位级别：硕士

痢疾杆菌是一种革兰氏阴性病原菌,通过各种分泌系统将毒力蛋白分泌到外部环境或者直接注入宿主细胞。迄今已经发现Ⅰ型到Ⅵ型共六种类型分泌系统,都是由单个蛋白或者大分子复合物形成一个跨越细菌细胞膜的通道。由于膜蛋白复合物结构复... 详细信息

痢疾杆菌是一种革兰氏阴性病原菌,通过各种分泌系统将毒力蛋白分泌到外部环境或者直接注入宿主细胞。迄今已经发现Ⅰ型到Ⅵ型共六种类型分泌系统,都是由单个蛋白或者大分子复合物形成一个跨越细菌细胞膜的通道。由于膜蛋白复合物结构复杂、疏水性强,难以从疏水的细胞膜脂双层中完整地分离纯化,因此长期以来对其研究局限于将可能的结构蛋白一个个单独进行结构和功能研究,缺乏整体性。近年来由Shaegger等人建立并逐渐成熟的蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Blue Native PolyAcrylamide Gel Electrophoresis,BN PAGE）为复合物研究带来新的突破。在痢疾杆菌的致病过程中,毒力大质粒编码许多侵袭相关蛋白比如Ⅲ型分泌系统复合物及其分泌的毒力因子,它的缺失会导致痢疾杆菌毒性的丧失。其细胞膜上除Ⅲ型分泌系统复合物之外,不仅还有5种类型分泌系统复合物未被分离鉴定,还可能有其它一些完全未知的复合物。本研究通过蓝色非变性凝胶电泳（BN PAGE）比较痢疾杆菌福氏5型野生株M90T和大质粒缺失株M90T△T的膜蛋白复合物,发现一个野生株特有的复合物,其分子量约为290kDa,命名为M90T-290。通过第二向SDS-PAGE分离M90T-290得到6个蛋白亚基,质谱鉴定为：一个由大质粒编码的毒力蛋白apyrase（ATP-二磷酸水解酶）和5个染色体编码的蛋白,分别为ClpB、DnaK、hypothetical protein S1768、translation elongation factor Tu、glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenas。M90T-290这个复合物是通过染色体和毒力大质粒的共同调控来实现M90T的致病性。鉴定出复合物的组成蛋白后,决定用标签亲和纯化技术对复合物的组成进行了验证。将apyrase的编码基因phoN2插入表达GST标签的PGEX 6p-1载体,构建成功apyrase-GST融合表达载体,转入M90T中,命名为M90T-6p-apy;制备该转化菌的膜蛋白复合物样品,用谷胱甘肽转移酶亲和柱纯化含GST标签的蛋白,利用BN PAGE分离纯化产物。结果没有分离得到GST-apyrase融合蛋白参与形成的复合物。分析可能是GST标签本身分子量比较大,改变了apyrase的三维结构导致无法形成复合物。于是将apyrase的编码基因phoN2插入到更小的表达His标签的PET 32a载体中,构建成功apryase-His融合表达载体,转入BL21中,命名为BL-PET-apyrase。诱导表达后超声破碎裂解细菌收集上清,发现在上清中有融合蛋白。然后利用镍柱进行亲和纯化,纯化得到apyrase-His融合蛋白。本实验构建的融合载体和纯化的融合蛋白为以后的复合物的验证奠定基础。同时为了对apyrase与M90T-290复合物的功能进行初步探索,利用Red重组系统敲除M90T中apyrase的编码基因phoN2。成功构建了线性打靶片段。把线性打靶片段转入含重组酶系统的PKOBEG感受态细胞中,通过卡纳霉素抗性标记筛选发生重组的缺失突变株。可能是由于重组效率低,目前还在筛选发生有效重组的缺失突变株。

关键词：痢疾杆菌膜复合物 BN-PAGE 腺苷三磷酸双磷酸酶亲和纯化 Red重组系统

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左氧氟沙星对小儿痢疾杆菌基因表达影响研究

药物生物技术 2017年第2期24卷 110-114页

作者：李旭明丁卉晏路标曾玉杨艳陈亚军南京市妇幼保健院检验科江苏南京210004 南京市妇幼保健院生殖医学中心江苏南京210004 南京市妇幼保健院儿科江苏南京210004

痢疾杆菌是小儿细菌性腹泻的主要病原体,被卫生部列为第三类病原微生物。文章为了给小儿痢疾抗药性研究提供基因表达差异性信息,用左氧氟沙星处理诱导痢疾杆菌使其产生抗药性,提取抗药和非抗药痢疾杆菌的总RNA,以随机引物逆转录获得c D... 详细信息

痢疾杆菌是小儿细菌性腹泻的主要病原体,被卫生部列为第三类病原微生物。文章为了给小儿痢疾抗药性研究提供基因表达差异性信息,用左氧氟沙星处理诱导痢疾杆菌使其产生抗药性,提取抗药和非抗药痢疾杆菌的总RNA,以随机引物逆转录获得c DNA,对转录本进行建库测序,分析其基因表达差异情况。结果显示痢疾杆菌菌耐药菌株与原始菌株相比有明显的基因差异表达,差异性表达基因占19.84%,其中4.7%基因上调表达,15.1%基因下调表达,且基因表达调控有关的sRNA也呈明显的差异性表达。对两个转录本的基因功能注释表明双组份系统和主动排外泵相关的基因表达有明显差异,这可能与菌株的抗药性产生有关。

关键词：小儿腹泻痢疾杆菌左氧氟沙星耐药菌株转录组测序基因表达

马齿苋水煎液体外抑制大肠杆菌和痢疾杆菌的作用机制的研究

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马齿苋水煎液体外抑制大肠杆菌和痢疾杆菌的作用机制的研究

作者：张子越山东农业大学

学位级别：硕士

抗生素和化学合成抗菌药物在动物细菌性疫病的预治中起到了积极的作用,但由于其在畜牧业动物疫病防治中长期的大量应用,使得细菌的耐药性增加,细菌性疾病越来越难以治疗。除此之外,抗生素和化学合成抗菌药物的残留问题,成为危害食品安... 详细信息

抗生素和化学合成抗菌药物在动物细菌性疫病的预治中起到了积极的作用,但由于其在畜牧业动物疫病防治中长期的大量应用,使得细菌的耐药性增加,细菌性疾病越来越难以治疗。除此之外,抗生素和化学合成抗菌药物的残留问题,成为危害食品安全的重要因素。中药是我国传统文化的瑰宝,在动物疫病防治中具有绿色环保、副作用低、不易产生耐药性等优点,越来越受到人们的关注。马齿苋为药食同源植物,具有抗菌、抗病毒、抗溃疡、抗炎、抗氧化和促进伤口愈合等良好的药理活性,但其作用机制及相应的活性成分尚不明确。本试验基于网络药理学分析方法,系统性阐述了马齿苋的药理活性及作用靶标,并针对其有效治疗细菌性腹泻和痢疾的功效,进行了体外和细胞水平的验证。网络药理学分析共筛选获得马齿苋的标志性成分花生四稀酸、β-谷甾醇、山柰酚、木犀草素、异甜菜素、槲皮素等10个,对应靶标187个,核心靶标62个,经KEGG富集分析发现核心靶标与结肠炎、病毒感染、癌症等通路密切相关,其中与治疗结肠炎相关的通路为ABCC4、ABCG2、ACAT1、ALOX5、CYP3A4、IFNG、IKKA、MPO、NOS2、NQO1、PPARG、PTGS1、PTGS2、TNF、XDH等。鉴于以上网络药理学分析结果,本研究针对可以引起结肠炎的大肠杆菌和痢疾杆菌,进行了马齿苋对大肠杆菌和痢疾杆菌的抑菌机制的探究。体外抑菌试验结果表明,与水超声、甲醇超声和乙醇超声获得的马齿苋提取液相比,马齿苋水煎液的抑菌效果最佳,MIC为125 mg/mL。不同浓度的马齿苋水煎液可以抑制大肠杆菌和痢疾杆菌正常的生长、破坏其菌体形态;能够破坏细菌的细胞壁和细胞膜,导致培养液中AKP、核酸及可溶性蛋白含量增加;抑制大肠杆菌和痢疾杆菌的某些菌体蛋白的表达,且马齿苋水煎液对细菌的以上影响与其作用浓度和作用时间呈正相关。RT-PCR结果表明,MIC浓度作用12 h对痢疾杆菌的毒力基因IpaB和VirB转录水平抑制作用更明显,1/2 MIC浓度作用6 h时抑制作用更明显。采用痢疾杆菌侵染人正常结肠上皮细胞（NCM460）构建结肠炎症模型,发现12.5mg/mL的马齿苋水煎液可以有效抑制炎症因子TNF-a和IL-6的表达,缓解痢疾杆菌对细胞活性造成的损伤。

关键词：马齿苋大肠杆菌痢疾杆菌抑菌机制结肠炎

双向BN/SDS-PAGE分离鉴定痢疾杆菌福氏5型M90T株毒力相关膜蛋白复合物

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生物技术通报 2011年第9期27卷 163-166,180页

作者：龚益熊廖翔朱力吴兰周晓巍梁龙黄培堂南昌大学食品工程与生命科学学院南昌330047 军事医学科学院生物工程研究所北京100071

通过蓝色非变性凝胶电泳(BN-PAGE)比较痢疾杆菌福氏5型野生株M90T和大质粒缺失株M90TΔT的膜蛋白复合物,发现一个野生株特有的复合物,其分子量约为290 kD,命名为M90T-290。通过第二向SDS-PAGE分离M90T-290得到6个蛋白亚基,质谱鉴定为:... 详细信息

通过蓝色非变性凝胶电泳(BN-PAGE)比较痢疾杆菌福氏5型野生株M90T和大质粒缺失株M90TΔT的膜蛋白复合物,发现一个野生株特有的复合物,其分子量约为290 kD,命名为M90T-290。通过第二向SDS-PAGE分离M90T-290得到6个蛋白亚基,质谱鉴定为:一个由大质粒编码的毒力蛋白Apyrase(ATP-二磷酸水解酶)和5个染色体编码的蛋白,这些蛋白可能以膜复合物的形式影响毒力蛋白IcsA的单极性分布和痢疾杆菌在细胞间的扩散。这个新发现的毒力相关膜复合物在痢疾杆菌的致病过程中可能发挥重要作用。

关键词：痢疾杆菌蓝色非变性凝胶电泳膜蛋白复合物毒力 ATP-二磷酸水解酶

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黄连水提物对痢疾杆菌的抑菌机制研究

黄连水提物对痢疾杆菌的抑菌机制研究

作者：黄燕飞安徽农业大学

学位级别：硕士

随着抗菌药物的广泛使用,出现了诸如毒性反应、二重感染、细菌耐药性等一系列问题,尤其是细菌耐药性的传播与蔓延,将导致多重耐药菌感染面临无药可医的严重局面。研究表明,有些中药具有良好的抑菌作用,而且毒副作用小,不易产生耐药性,... 详细信息

随着抗菌药物的广泛使用,出现了诸如毒性反应、二重感染、细菌耐药性等一系列问题,尤其是细菌耐药性的传播与蔓延,将导致多重耐药菌感染面临无药可医的严重局面。研究表明,有些中药具有良好的抑菌作用,而且毒副作用小,不易产生耐药性,特别是有的中药还能够清除耐药菌的耐药质粒、降低其耐药性。药理学研究表明,黄连具有广谱抗菌、抗病毒作用,其临床疗效已获得广泛认可,但其抑菌机制尚不明确。本研究从分子水平上对黄连抑制痢疾杆菌的抑菌机制进行了探讨,以期为黄连在临床抗感染方面的应用提供理论指导。试验以黄连水提物为试验药物,以痢疾杆菌为供试菌。首先采用倍半稀释法和吸光光度法考察了黄连对痢疾杆菌的最小抑菌浓度(MIC)及对菌体生长曲线的影响;然后选择适宜的黄连浓度和培养时间,采用分光光度法测定了黄连对痢疾杆菌细胞膜通透性、能量代谢活力及细胞壁的影响;通过凝胶阻滞实验测定了黄连对痢疾杆菌基因组DNA及蛋白合成的影响;荧光定量PCR法检测了黄连对痢疾杆菌四种毒力因子(ipaH、dsbA、sodB和iutA)表达的影响;流式细胞仪DCFH-DA染色法检测了黄连对痢疾杆菌菌体内活性氧(ROS)水平的影响;流式细胞仪Annexin V-FITC和PI双染检了测菌体细胞凋亡;流式细胞仪PI单染法检测了菌体细胞周期的变化情况。结果:(1)黄连对痢疾杆菌的抑菌活性研究黄连对病原痢疾杆菌具有明显的抑制作用,MIC为5 mg·mL;对数生长期为10 h,且抑菌效果随着黄连作用时间和浓度的增加而提高。(2)黄连对痢疾杆菌细胞膜及能量代谢的影响黄连与痢疾杆菌培养10 h时,和对照组相比:2.5 mg·mL黄连处理组DNA、RNA大分子物质泄漏了40.1%,琥珀酸脱氢酶(SDH)和苹果酸脱氢酶(MDH)活性分别降低了21.9%、8.69%;5 mg·mL黄连处理组大分子物质泄漏了65.4%,SDH和MDH活性分别降低了53.9%、37.9%;10 mg·mL黄连处理组大分子物质泄漏了75.3%,SDH和MDH活性分别降低了68.5%、69.8%。(3)黄连对痢疾杆菌细胞壁的影响当黄连与痢疾杆菌培养10 h时,与对照组相比:各黄连处理组中的AKP含量均有很大增加,2.5 mg·mL黄连处理组AKP增加了62%;5 mg·mL黄连处理组AKP增加了77.6%;10 mg·mL黄连处理组AKP增加了81.4%。(4)黄连对痢疾杆菌基因组DNA及蛋白合成的影响当黄连浓度达到5 mg·mL时,菌体中基因组DNA与黄连中的蛋白质部分结合停留在点样孔中,且随着作用时间的延长,DNA的合成量也明显减少;黄连与痢疾杆菌培养10 h时,与对照组相比;2.5 mg·mL黄连处理组可溶性蛋白含量减少了35%;5mg·mL黄连处理组可溶性蛋白含量减少了57%;10 mg·mL黄连处理组可溶性蛋白含量减少了69%。(5)黄连对痢疾杆菌四种毒力因子表达的影响ipaH、dsbA、sodB和iutA四种毒力基因的表达量均下降,说明黄连可以通过抑制了这四种毒力基因的表达来降低菌体对机体的破坏。(6)黄连对痢疾杆菌菌体内活性氧(ROS)水平的影响黄连处理组中的ROS含量高于对照组,说明黄连打破了菌体内产生ROS与清除ROS系统的平衡,使菌体内ROS堆积,从而影响菌体正常生理活动的进行。(7)黄连对痢疾杆菌细胞凋亡的影响黄连处理组的凋亡率高于对照组,说明黄连诱导了菌体细胞发生凋亡。(8)黄连对痢疾杆菌细胞周期的影响黄连处理组中的G1期低于对照组,S期高于对照组,说明黄连扰乱了菌体正常的细胞周期。结论:黄连可通过改变菌体膜蛋白结构破坏菌体细胞膜,通过降低SDH和MDH活性造成细胞代谢紊乱,还可以破坏菌体细胞壁的完整性,可通过与菌体基因组DNA结合而影响菌体蛋白质的合成,可使菌体内ROS增加,可引起细胞凋亡,可造成细胞周期紊乱。

关键词：黄连痢疾杆菌抑菌机制

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痢疾杆菌的药敏试验

临床医药文献电子杂志 2015年第18期 3653-3653页

作者：吴德英黎平县人民医院检验科

目的通过痢疾杆菌的药敏试验分析痢疾杆菌药物敏感情况,为临床治疗提供更多依据。方法对我院2012年3月;014年10月收集的腹泻患者粪便标本进行痢疾杆菌分离,通过K-B法对28株痢疾杆菌进行药物敏感试验。结果药敏试验显示,痢疾杆菌对诺氟... 详细信息

目的通过痢疾杆菌的药敏试验分析痢疾杆菌药物敏感情况,为临床治疗提供更多依据。方法对我院2012年3月;014年10月收集的腹泻患者粪便标本进行痢疾杆菌分离,通过K-B法对28株痢疾杆菌进行药物敏感试验。结果药敏试验显示,痢疾杆菌对诺氟沙星的耐药率为7.14%,对奥格门丁的耐药率为10.71%,对磺胺、氨苄西林、四环素等耐药性则较高,耐药率大于75%。结论痢疾杆菌对诺氟沙星、奥格门丁耐药性较低,在临床抗生素管理中应选择性地合理应用抗生素。

关键词：痢疾杆菌药敏试验耐药性