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直接免疫荧光法检测狂犬病病毒滴度条件的优化及验证

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中国生物制品学杂志 2014年第11期27卷 1477-1480页

作者：王梦舒郑宇郭丽姝陶雷程晓耕徐菲长春百克生物科技股份公司吉林长春130012 吉林大学生命科学学院艾滋病疫苗国家工程实验室吉林长春130012

目的对直接免疫荧光法检测狂犬病病毒(rabies virus,RV)滴度的条件进行优化及验证。方法考察直接免疫荧光法中细胞不同接种方式(分步接种法、一步接种法)、病毒不同培养温度(34、37℃)及培养时间(6、12、24、48、72、96 h)对狂犬病病毒... 详细信息

目的对直接免疫荧光法检测狂犬病病毒(rabies virus,RV)滴度的条件进行优化及验证。方法考察直接免疫荧光法中细胞不同接种方式(分步接种法、一步接种法)、病毒不同培养温度(34、37℃)及培养时间(6、12、24、48、72、96 h)对狂犬病病毒滴度的影响;对优化的方法进行试验间精密性和特异性验证,并与小鼠脑内滴定法的检测结果进行比较。结果选择一步接种法作为直接免疫荧光法的细胞接种方式;34℃作为病毒培养温度;病毒培养至96 h时进行染色,判定实验结果;病毒培养至第3天时进行荧光灶计数,计算病毒液中病毒的数量。两名操作人员12次检测结果的变异系数仅为0.05%;用该方法检测不同病毒,仅狂犬病病毒组出现特异性荧光,而犬瘟热病毒和犬细小病毒组未观察到荧光灶。采用直接免疫荧光法和小鼠脑内滴定法检测狂犬病病毒样品的病毒滴度结果差异无统计学意义(P>0.05),具有较好的一致性。结论优化的直接免疫荧光法精密性良好,特异性强,操作简便,检测周期短,可用于狂犬病病毒滴度的定量检测。

关键词：狂犬病病毒直接免疫荧光法病毒滴度

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运用流式细胞术快速检测汉滩病毒滴度

细胞与分子免疫学杂志 2011年第5期27卷 579-581,584页

作者：蒋伟杨栋强潘蕾于海涛李彧王伟王平忠白雪帆第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心陕西西安710038

目的:建立用流式细胞仪快速测定汉滩病毒滴度的方法。方法:汉滩病毒76-118株感染Vero-E6细胞,以汉滩病毒核蛋白单克隆抗体(mAb)3G1为一抗,FITC标记的羊抗小鼠抗体为二抗,用流式细胞术(FCM)检测阳性细胞率,评价感染后不同时间点,以及不... 详细信息

目的:建立用流式细胞仪快速测定汉滩病毒滴度的方法。方法:汉滩病毒76-118株感染Vero-E6细胞,以汉滩病毒核蛋白单克隆抗体(mAb)3G1为一抗,FITC标记的羊抗小鼠抗体为二抗,用流式细胞术(FCM)检测阳性细胞率,评价感染后不同时间点,以及不同病毒接种量的阳性细胞率,并与间接免疫荧光法对比。结果:感染后36 h阳性细胞百分率为(10.06±0.42)%,最低检测的病毒滴度为100 TCID50/mL。结论:相对于传统的空斑实验及间接免疫荧光滴定法,FCM是一种简单、快速、有效检测汉滩病毒滴度的方法。

关键词：汉滩病毒流式细胞术空斑实验间接免疫荧光病毒滴度

首批黄热减毒活疫苗病毒滴度国家标准品的研制

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中国生物制品学杂志 2017年第4期30卷 342-345,350页

作者：王玲刘晶晶孔艳李玉华中国食品药品检定研究院虫媒病毒疫苗室北京100050

目的制备我国首批黄热减毒活疫苗病毒滴度国家标准品。方法委托北京天坛生物制品股份有限公司制备1批经全面检验合格的黄热减毒活疫苗作为候选国家标准品(批号为:20111201)。由3家实验室采用空斑法对黄热减毒活疫苗病毒滴度标准品进行... 详细信息

目的制备我国首批黄热减毒活疫苗病毒滴度国家标准品。方法委托北京天坛生物制品股份有限公司制备1批经全面检验合格的黄热减毒活疫苗作为候选国家标准品(批号为:20111201)。由3家实验室采用空斑法对黄热减毒活疫苗病毒滴度标准品进行协作标定,以黄热病疫苗国际标准品为溯源,确定本国家标准品以LgIU/ml为标示单位的病毒滴度,并分析标准品的分装精度、稳定性、均匀性。结果制备的国家标准品分装精度为-0.68%~0.95%。3家实验室20次协作标定结果显示,标准品病毒滴度的IU赋值为5.4 LgIU/ml。37℃2周加速破坏试验病毒滴度下降0.5 LgPFU/ml;长期稳定性考察(-30℃),病毒滴度2年内下降0.5 LgPFU/ml,而第3、4年病毒滴度基本无下降。均匀性参考量值——pH的CV值为0.17%、卵清蛋白含量的CV值为4.4%,病毒滴度CV值为2.0%。结论研制的黄热减毒活疫苗病毒滴度国家标准品符合国家标准品要求,可作为国家标准品进行发放和使用。该国家标准品批准文号为(2016)国生标字0032,其批号编码为250017-20111201。

关键词：黄热减毒活疫苗病毒滴度国家标准品

呼吸道合胞病毒培养及其病毒滴度检测方法的建立

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中国生物制品学杂志 2015年第9期28卷 973-975,978页

作者：王欣怡李树香刘敬崔文禹徐静北京生物制品研究所有限责任公司北京101111

目的确定呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus,RSV）培养条件,筛选病毒保护剂配方,并建立检测病毒滴度的微量细胞病变方法。方法分别将Hep2、Vero和293R细胞以0.01 MOI接种RSV,选择病毒培养细胞基质;将RSV分别以0.005和0.02 MO... 详细信息

目的确定呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus,RSV）培养条件,筛选病毒保护剂配方,并建立检测病毒滴度的微量细胞病变方法。方法分别将Hep2、Vero和293R细胞以0.01 MOI接种RSV,选择病毒培养细胞基质;将RSV分别以0.005和0.02 MOI接种Hep2细胞,在4～9 d收获病毒液,检测病毒滴度,确定最佳MOI及病毒收获时间;将6种配方病毒保护剂分别加至病毒液中,反复冻融7次,检测病毒滴度,筛选最佳配方;将病毒分别在33和37℃条件下滴定,第7、9天判定结果,确定微量细胞病变方法的培养温度和判定时间。结果确定病毒培养细胞基质为Hep2细胞,以0.02 MOI RSV接种后,37℃培养7～9 d收获病毒液;配方1（0.1%人血白蛋白）为最佳病毒保护剂配方;微量细胞病变法的实验条件为37℃滴定,7 d判定结果。结论建立了稳定可靠的呼吸道合胞病毒培养及病毒滴度检测方法。

关键词：呼吸道合胞病毒培养条件病毒滴度

广州地区无偿献血者HCV基因分型与病毒滴度的相关性研究

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中国输血杂志 2012年第10期25卷 1063-1065页

作者：黄杰庭戎霞熊华平许茹黄珂王敏付涌水广州血液中心广东广州510095

目的探讨丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)6a亚型与病毒滴度的关系。方法从2009年11月～2011年8月收集广州地区无偿献血人群中抗-HCV阳性标本527份,对其进行HCV核酸检测(nucleic acid test,NAT)。对核酸阳性的标本采用罗氏COBAS Amp... 详细信息

目的探讨丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)6a亚型与病毒滴度的关系。方法从2009年11月～2011年8月收集广州地区无偿献血人群中抗-HCV阳性标本527份,对其进行HCV核酸检测(nucleic acid test,NAT)。对核酸阳性的标本采用罗氏COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV test进行病毒滴度的定量检测,以及采用NS5B基因扩增和直接测序法进行HCV基因分型的鉴定。对于标本的病毒滴度与基因分型采用SPSS16.0软件进行关联性分析。结果 527份抗-HCV阳性标本中,299份标本成功获得病毒滴度和分型结果。HCV 1型(1a+1b)、2型(2a)、3型(3a+3b)和6型(6a)的比例分别为48.8%,8.7%,12.4%和30.1%。统计分析结果表明,不同基因型之间的病毒滴度存在显著差异(F=6.675,P滴度分别为6.04,6.15 log10 IU/ml,均高于2型和3型(平均滴度分别为5.66和5.49 log10 IU/ml)。结论 HCV 1b和6a是广东地区无偿献血者人群中流行的主要亚型。HCV 1型(1a+1b)和6型(6a)的病毒滴度显著高于2型和3型。HCV 6a在广东地区的流行和传播可能其较高病毒滴度有关。研究HCV基因分型与病毒滴度的关系的研究有助于广东地区HCV的防控策略以及各亚型治疗方案的制定。

关键词：丙型肝炎病毒病毒滴度基因分型 HCV 6a 无偿献血者

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病毒载体滴度对基因转移效率的影响研究

陕西师大学报（自然科学版） 1997年第1期25卷 87-90页

作者：袁仕取林焯唐韩卫宁陕西师范大学生命科学学院河南肿瘤研究所

用改良的经典方法测定包装ＬａｃＺ基因的腺病毒和逆转录病毒载体的病毒滴度，以及用新建的简便方法测定逆转录病毒载体的病毒滴度．应用此两种病毒载体介导ＬａｃＺ基因分别导入１５种人或小鼠靶细胞，并以不同滴度的病毒上清液转染靶... 详细信息

用改良的经典方法测定包装ＬａｃＺ基因的腺病毒和逆转录病毒载体的病毒滴度，以及用新建的简便方法测定逆转录病毒载体的病毒滴度．应用此两种病毒载体介导ＬａｃＺ基因分别导入１５种人或小鼠靶细胞，并以不同滴度的病毒上清液转染靶细胞Ｋ５６２，探讨病毒滴度对基因转移效率的影响．实验结果表明，病毒滴度与转染效率呈正相关，逆转录病毒滴度由１０６ＣＦＵ／ｍＬ降至１０４ＣＦＵ／ｍＬ时，用其转染Ｋ５６２细胞的转染效率由９０％降至２０％；ＣＡ启动子腺病毒滴度由０．４×１０９ＣＦＵ／ｍＬ降至０．２×１０７ＣＦＵ／ｍＬ时，对Ｋ５６２细胞的转染率由１００％降至３５％．同时表明，腺病毒滴度高。

关键词：病毒载体病毒滴度转染效率基因转移

荧光定量PCR用于重组杆状病毒鉴定及病毒滴度检测的研究(英文)

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中国病理生理杂志 2007年第8期23卷 1623-1626页

作者：童夏生孟哲峰浙江省温岭市第三人民医院浙江温岭317523 中国疾病控制预防中心北京100002

目的:建立一种高效?简便的荧光实时定量PCR方法,用于重组杆状病毒鉴定及病毒滴度的检测。方法:利用Bac-to-Bac载体系统在昆虫细胞中构建含人IL-18基因的重组杆状病毒,收获的病毒母液以10倍梯度系列稀释后,提取病毒基因组DNA。以10倍梯... 详细信息

目的:建立一种高效?简便的荧光实时定量PCR方法,用于重组杆状病毒鉴定及病毒滴度的检测。方法:利用Bac-to-Bac载体系统在昆虫细胞中构建含人IL-18基因的重组杆状病毒,收获的病毒母液以10倍梯度系列稀释后,提取病毒基因组DNA。以10倍梯度稀释的重组杆状病毒穿梭质粒(bacmid)作为标准模板,进行荧光定量PCR反应扩增IL-18基因片段并绘制标准曲线,然后以上述的重组杆状病毒基因组DNA作为模板,采用同样体系进行实时PCR反应检测,同时用琼脂糖空斑法测定病毒母液的滴度。结果:成功构建了重组杆状病毒并建立了病毒滴度的实时荧光PCR检测方法。运用标准模板进行的PCR反应显示该方法的线形范围为101-108拷贝,病毒母液的DNA拷贝浓度(vg/mL)值约为空斑检测的滴度pfu/mL值的10倍。结论:荧光定量PCR方法可灵敏快速地鉴定重组杆状病毒,并在较大的线形范围内检测重组杆状病毒滴度,较之空斑法更准确地反映了重组杆状病毒的实际数量。

关键词：荧光定量PCR 重组病毒鉴定病毒滴度

重组H5N1亚型禽流感病毒NA基因腺病毒的滴度测定及遗传稳定性研究

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河南农业科学 2010年第8期39卷 122-125页

作者：胡建和王青徐彦召郑素玲吴玉苹杭柏林河南科技学院动物科学学院河南新乡453003 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

为了研究表达H5N1亚型禽流感病毒NA基因重组腺病毒pAd-N1的遗传稳定性及重组病毒的滴度,将重组腺病毒pAd-N1在293细胞上连续传代20次,取第5、10、15、20代的重组病毒,采用PCR方法扩增禽流感病毒NA基因,并进行基因序列分析;用绿色荧光蛋... 详细信息

为了研究表达H5N1亚型禽流感病毒NA基因重组腺病毒pAd-N1的遗传稳定性及重组病毒的滴度,将重组腺病毒pAd-N1在293细胞上连续传代20次,取第5、10、15、20代的重组病毒,采用PCR方法扩增禽流感病毒NA基因,并进行基因序列分析;用绿色荧光蛋白做标记计算出20代次时重组病毒的滴度。结果显示:从各代重组病毒DNA中均扩增出了约1 400 bp的目的条带,序列分析结果表明,第5、10、15代重组病毒中的NA基因序列与原始转移载体序列完全一致,第20代重组病毒插入基因有2处发生了点突变(516位A→G,1 323位T→C),但其编码的氨基酸未发生变化,即蛋白抗原表位未发生变化;采用快速测定法计算出重组腺病毒的滴度为109.5pfu/mL。

关键词：禽流感重组腺病毒遗传稳定性病毒滴度

不同血清浓度培养条件对博尔纳病病毒感染滴度的影响比较

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激光杂志 2012年第1期33卷 78-81页

作者：邓婧黄荣忠李文娟张亮刘霞马丽华金戈徐晓艳房亮谢鹏重庆医科大学附属第一医院神经内科重庆400016 重庆医科大学神经科学研究中心重庆400016 重庆市神经生物学重点实验室重庆400016

目的:探讨不同血清浓度对博尔纳病病毒(BDV)感染少突胶质细胞(OL细胞)感染力的影响,寻找BDV病毒感染细胞最适宜的血清浓度。方法:接种BDV的OL细胞(OL/BDV)于培养皿中,培养24小时后,通过反复冻融、超声破碎的方法获取BDV病毒液,用于感染... 详细信息

目的:探讨不同血清浓度对博尔纳病病毒(BDV)感染少突胶质细胞(OL细胞)感染力的影响,寻找BDV病毒感染细胞最适宜的血清浓度。方法:接种BDV的OL细胞(OL/BDV)于培养皿中,培养24小时后,通过反复冻融、超声破碎的方法获取BDV病毒液,用于感染正常的OL细胞。在保证除血清浓度因素不同而其余因素均相同的条件下,用DMEM、2%FCS、5%FCS、10%FCS四种不同浓度的血清培养基在96孔板中培养BDV新感染的OL细胞,测定病毒感染滴度,比较各组之间是否有统计学差异。结果:DMEM、5%FCS和10%FCS组所测得的BDV病毒滴度两组之间无统计学差异,2%FCS组所测得的病毒滴度和DMEM、5%FCS、0%FCS组之间有明显统计学差异,2%FCS组病毒滴度明显高于其它两组。结论:不同浓度的血清浓度对Boma病毒对细胞的感染力有影响,2%FCS的培养条件可能更适合于BDV感染OL细胞实验。

关键词：博尔纳病病毒少突胶质细胞血清浓度病毒滴度