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腺病毒滴度不同测定方法比较

南方医科大学学报 2011年第2期31卷 234-238页

作者：孙鹏宇张艳玲荆玉明张信基张哲欢黎诚耀陈白虹谭万龙李红卫南方医科大学南方医院泌尿外科广东广州510515 南方医科大学生物技术学院广东广州510515

目的将目前测定腺病毒滴度常用的OD260法、荧光定量PCR法、绿色荧光蛋白标记法、壳蛋白免疫法、细胞病变(CPE)法进行比较研究,分析和讨论各种方法的优缺点。方法 4种重组腺病毒(Ad-G-AT2R-EGFP、Ad–CMV-EGFP、Ad-mif-shRNA-EGFP和Ad-CB... 详细信息

目的将目前测定腺病毒滴度常用的OD260法、荧光定量PCR法、绿色荧光蛋白标记法、壳蛋白免疫法、细胞病变(CPE)法进行比较研究,分析和讨论各种方法的优缺点。方法 4种重组腺病毒(Ad-G-AT2R-EGFP、Ad–CMV-EGFP、Ad-mif-shRNA-EGFP和Ad-CBA-GFP)扩增、纯化后,同时分别用OD260值法、荧光定量PCR法、绿色荧光蛋白标记法、壳蛋白免疫法及CPE法测定病毒滴度,并以壳蛋白免疫法测定结果作为标准,对各种方法所得结果进行比较研究。结果绿色荧光蛋白标记法、CPE法与壳蛋白免疫法同时测定4种腺病毒滴度,其结果无统计学差异(P>0.1)。荧光定量PCR法测定值明显高于壳蛋白免疫法(P测定结果间存在良好的相关性(r=0.965),约为壳蛋白免疫法所测得结果的10倍。OD260法测得结果与壳蛋白免疫法测得结果间则无相关性。结论绿色荧光蛋白标记法与壳蛋白免疫法是测定腺病毒感染性滴度最为快速有效的方法,其结果客观可靠,能真实地反映病毒的实际感染力。荧光定量PCR法测定结果反映的是完整的病毒颗粒数,能够间接反映病毒的感染力,且该方法操作简单,耗时短,同样有较高的实用性。

关键词：腺病毒病毒滴度测定壳蛋白免疫法绿色荧光蛋白荧光定量PCR 细胞病变法

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草鱼出血病病毒高滴度培养方法的研究

淡水渔业 2000年第4期30卷 40-41页

作者：曾令兵袁明雄华中理工大学生命科学与技术学院

可溶性TGF-β_1Ⅱ型受体逆转录病毒表达载体的构建

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世界华人消化杂志 2005年第6期13卷 760-765页

作者：高巍周永兴张惠中聂青和中国人民解放军第四军医大学唐都医院全军感染病诊治中心陕西省西安市710038 中国人民解放军第四军医大学唐都医院中心实验室陕西省西安市710038

目的:构建表达人TGF—β1Ⅱ型受体细胞外结合区和人IgG1 Fc的融合蛋白逆转录病毒载体,为进一步肝纤维化的基因治疗奠定实验基础. 方法:以RT—PCR方法扩增目的基因TβRⅡ-IgG1 Fc,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEM—T—Easy,挑取阳性克... 详细信息

目的:构建表达人TGF—β1Ⅱ型受体细胞外结合区和人IgG1 Fc的融合蛋白逆转录病毒载体,为进一步肝纤维化的基因治疗奠定实验基础. 方法:以RT—PCR方法扩增目的基因TβRⅡ-IgG1 Fc,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEM—T—Easy,挑取阳性克隆酶切鉴定后测序;利用重组DNA 技术,将TβRⅡ-IgG1 Fc基因亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN中,重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,测定病毒滴度. 结果:经测序、限制性酶切分析及PCR方法鉴定,载体插入基因序列、大小、位置均正确,并用PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的感染性重组病毒产生细胞系. 结论:成功构建了重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN, 可望为肝纤维化的基因治疗提供有效途径.

关键词： TGF-β1Ⅱ型受体逆转录病毒表达载体逆转录病毒载体可溶性重组DNA技术 PA317细胞 PCR方法病毒滴度测定基因治疗肝纤维化 TβRⅡ 重组质粒人IgG1 pLXSN 脂质体介导限制性酶切构建表达融合蛋白目的基因产物纯化

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胰酶浓度对轮状病毒蚀斑形成的影响

中国医药生物技术 2008年第2期3卷 146-147页

作者：刘馨中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所昆明650118

轮状病毒属于呼肠孤病毒属（reovirus），是世界范围内导致婴幼儿急性肠炎的主要病原。由于轮状病毒存在众多的血清型，且其基因可重排产生新的基因型，所以在研究过程中保持毒株的纯净十分重要。病毒粒子单克隆的筛选是病毒分子遗传和... 详细信息

轮状病毒属于呼肠孤病毒属（reovirus），是世界范围内导致婴幼儿急性肠炎的主要病原。由于轮状病毒存在众多的血清型，且其基因可重排产生新的基因型，所以在研究过程中保持毒株的纯净十分重要。病毒粒子单克隆的筛选是病毒分子遗传和疫苗毒株研究中一项基本和基础的工作，其中蚀斑实验是非常理想的方法，同时也是轮状病毒滴度测定较为客观和准确的方法。但是，轮状病毒蚀斑形成受毒株、细胞的影响，相关试剂特别是胰酶（pancreatin）的浓度，对实验的稳定性及结果判定影响较大。为此，笔者观察了不同浓度胰酶对轮状病毒蚀斑形成的影响，对胰酶浓度进行优选，以期建立稳定的轮状病毒蚀斑实验方法。

关键词：轮状病毒属蚀斑浓度胰酶病毒滴度测定呼肠孤病毒急性肠炎世界范围

pSLX-CMV/TβRII-IgG1Fc载体的构建

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胃肠病学和肝病学杂志 2005年第3期14卷 230-234页

作者：高巍周永兴张惠中聂青和西安市第四军医大学唐都医院西安710038

目的构建表达人TGFβ1II型受体细胞外结合区和人IgG1Fc的融合蛋白逆转录病毒载体,为进一步肝纤维化的基因治疗奠定实验基础。方法以RTPCR方法扩增目的基因TβRIIIgG1Fc,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEMTEasy,挑取阳性克隆酶切鉴定后测... 详细信息

目的构建表达人TGFβ1II型受体细胞外结合区和人IgG1Fc的融合蛋白逆转录病毒载体,为进一步肝纤维化的基因治疗奠定实验基础。方法以RTPCR方法扩增目的基因TβRIIIgG1Fc,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEMTEasy,挑取阳性克隆酶切鉴定后测序;利用重组DNA技术,将TβRIIIgG1Fc基因亚克隆至逆转录病毒载体pSLXCMV中,重组质粒pSLXCMV/TβRIIIgG1Fc在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,测定病毒滴度。结果经测序、限制性酶切分析及PCR方法鉴定,载体插入基因序列、大小、位置均正确无误,并用PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的感染性重组病毒产生细胞系。结论成功构建了重组质粒pSLXCMV/TβRIIIgG1Fc,可望为肝纤维化的基因治疗提供有效途径。

关键词： Fc 逆转录病毒载体 RT-PCR方法重组DNA技术 PA317细胞病毒滴度测定基因治疗肝纤维化重组质粒人IgG1 TGF-β 脂质体介导限制性酶切 1型受体构建表达融合蛋白目的基因产物纯化酶切鉴定阳性克隆包装细胞抗性克隆