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端粒酶逆转录酶肽-核酸病毒样颗粒疫苗的制备及免疫原性鉴定

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世界华人消化杂志 2005年第22期13卷 2645-2649页

作者：郭红郝嘉吴超房殿春中国人民解放军第三军医大学西南医院全军消化内科中心重庆市400038 中国人民解放军第三军医大学新桥医院心外科重庆市400037 中国人民解放军第三军医大学临床微生物及免疫教研室重庆市400038

目的:设计人端粒酶逆转录酶(hTERT)的新型病毒样颗粒疫苗,并鉴定其表达蛋白的免疫原性和疫苗转染效率．方法:合成阳离子抗原肽K18P9,同时将人粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)和hTERT克隆入真核双表达载体pTCAE中,再将多肽和核酸... 详细信息

目的:设计人端粒酶逆转录酶(hTERT)的新型病毒样颗粒疫苗,并鉴定其表达蛋白的免疫原性和疫苗转染效率．方法:合成阳离子抗原肽K18P9,同时将人粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)和hTERT克隆入真核双表达载体pTCAE中,再将多肽和核酸疫苗结合于同一疫苗颗粒,并将其转染入真核细胞内.ELISA法和免疫印迹法检测hGM-CSF和hTERT的免疫原性,同时评价疫苗的转染效率．结果:酶切及测序结果证实已成功构建含hGM-CSF和 hTERT的载体pTGH,电镜等结果证实核酸被包装肽包裹形成病毒样颗粒,ELISA法和免疫印迹法证实疫苗在体外对真核细胞的转染效应以及hGM-CSF和hTERT 的免疫原性,与阳性对照DOTAP组比较,疫苗转染效率约可达78．5％．结论:成功构建了具有免疫原性的hTERT肽-核酸病毒样颗粒疫苗．

关键词：端粒酶逆转录酶病毒样颗粒疫苗细胞毒T淋巴细胞

生物矿化的口蹄疫病毒样颗粒疫苗的免疫原性评价

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畜牧兽医学报 2023年第4期54卷 1598-1607页

作者：李硕张韵白满元赵瑞翀宋河涛穆素雨滕志东董虎马娥宁孙世琪郭慧琛尹双辉中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室/国家口蹄疫参考实验室兰州大学动物医学院兰州730000 甘肃农业大学动物医学院兰州730070 云南省畜牧兽医科学院云南热带亚热带动物病毒病实验室昆明650224

生物矿化技术可以增强口蹄疫(foot-and-mouth,FMD)病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)的耐热性,但并无试验数据支撑矿化FMD VLPs用于临床的可行性。本研究旨在评价矿化FMD VLPs疫苗在牛和猪上的免疫原性。用VLPs和矿化VLPs免疫猪,... 详细信息

生物矿化技术可以增强口蹄疫(foot-and-mouth,FMD)病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)的耐热性,但并无试验数据支撑矿化FMD VLPs用于临床的可行性。本研究旨在评价矿化FMD VLPs疫苗在牛和猪上的免疫原性。用VLPs和矿化VLPs免疫猪,采用液相阻断ELISA(LPBE)检测猪血清中的特异性抗体滴度,并经酶联免疫斑点试验(ELISpot)检测免疫猪外周血淋巴细胞(PBLs)经体外刺激后分泌的特异性IFN-γ。用矿化A型VLPs、矿化O型VLPs、矿化的A型和O型二价VLPs分别免疫牛,采用LPBE、中和试验、夹心ELISA检测血清中的特异性抗体、中和抗体以及IL-4和IFN-γ的含量。结果显示,VLPs与矿化VLPs免疫猪的血清抗体水平无显著差异,相对于VLPs,矿化VLPs免疫猪的PBLs分泌的IFN-γ水平高于VLPs免疫猪(P疫苗免疫牛血清中IL-4和IFN-γ水平均高于PBS组,矿化二价疫苗与相应的矿化单价疫苗免疫牛的血清特异性抗体和中和抗体效价均无显著差异。综上所述,矿化VLPs对牛和猪均具有良好的免疫原性,不同血清型的矿化VLPs可以联合使用并且矿化壳层可增强VLPs诱导细胞免疫应答的能力。

关键词：口蹄疫病毒病毒样颗粒疫苗生物矿化动物免疫

以乙型肝炎病毒核心蛋白为载体的PRRSV病毒样颗粒疫苗的构建

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中国兽医科学 2015年第10期45卷 1000-1004页

作者：曹佳媛田明尧辛舒崔卓栋李一权曹亮张艳芳韩继成郭海宁金宁一广西大学动物科学技术学院广西南宁530007 军事医学科学院军事兽医研究所吉林长春130122

为采用乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)为载体,构建含美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5糖基化蛋白抗原表位的HBc-GP5病毒样颗粒(VLPs)疫苗,对HBc序列进行密码子优化,将其克隆至pET-28a(+)载体中,获得质粒pEO-NEW。在HBc刺突顶端的免... 详细信息

为采用乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)为载体,构建含美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5糖基化蛋白抗原表位的HBc-GP5病毒样颗粒(VLPs)疫苗,对HBc序列进行密码子优化,将其克隆至pET-28a(+)载体中,获得质粒pEO-NEW。在HBc刺突顶端的免疫显性区插入优化后的GP5序列,获得重组表达质粒pEO-LEORF5,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG 22℃诱导表达。利用SDS-PAGE和Western-blot验证融合蛋白pEO-LEORF5的表达。超声破碎后利用蔗糖密度梯度离心对融合蛋白进行纯化,最后用透射电镜观察VLPs的形成情况。结果表明,重组表达质粒pEO-LEORF5构建正确。表达的融合蛋白的分子质量为32ku,以包涵体和可溶性两种形式表达。经浓缩纯化后融合蛋白纯度可达67%,且能自主装配为VLPs。本试验成功构建出新型HBc-GP5VLPs候选疫苗,为研发新型PRRS疫苗提供了新思路。

关键词：乙型肝炎病毒核心蛋白猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP5抗原表位病毒样颗粒疫苗

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大肠杆菌表达动物病毒样颗粒疫苗的研究进展

中国兽医科学 2024年第7期54卷 955-961页

作者：李幽幽扶星星朱玲王永胜吴福文张海徐志文四川农业大学动物生物技术中心四川成都611100 四川水利职业技术学院生物工程学院四川成都611230 四川百诺吉科技有限公司四川绵阳621000

大肠杆菌表达宿主因其表达量高、周期短、成本低等诸多优势而被广泛用作异源蛋白质的表达。据统计,超过30%的重组蛋白质药物和50%重组蛋白质的制备是使用大肠杆菌作为表达宿主的。大肠杆菌是低成本表达重组蛋白的首选生物之一,这对于兽... 详细信息

大肠杆菌表达宿主因其表达量高、周期短、成本低等诸多优势而被广泛用作异源蛋白质的表达。据统计,超过30%的重组蛋白质药物和50%重组蛋白质的制备是使用大肠杆菌作为表达宿主的。大肠杆菌是低成本表达重组蛋白的首选生物之一,这对于兽用疫苗的生产尤其重要。本文系统阐述了大肠杆菌表达系统在动物病毒样颗粒疫苗应用中的生产和研究进展,并且总结了大肠杆菌表达系统在疫苗应用中存在的问题及现有的解决策略,以期为以大肠杆菌作为表达宿主的动物病毒样颗粒疫苗研制提供参考。

关键词：大肠杆菌表达宿主病毒样颗粒疫苗

3种TLR配体对猪圆环病毒2型病毒样颗粒疫苗佐剂活性的比较

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中国预防兽医学报 2020年第6期42卷 595-600页

作者：李洋洋宗扬程健王亚杰张鑫宇夏晓莉孙怀昌扬州大学兽医学院/江苏省重要动物疫病与人兽共患病协同创新中心江苏扬州225009 江苏农牧科技职业学院江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室江苏泰州225300

为比较3种TLR配体对猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒(VLP)疫苗的佐剂活性,本研究利用重组大肠杆菌表达脑膜炎奈瑟菌Ag473脂蛋白、创伤弧菌FlaB鞭毛蛋白和结核分枝杆菌热应激蛋白70(Hsp70),采用镍亲和柱纯化获得该3种重组蛋白;分别将相同... 详细信息

为比较3种TLR配体对猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒(VLP)疫苗的佐剂活性,本研究利用重组大肠杆菌表达脑膜炎奈瑟菌Ag473脂蛋白、创伤弧菌FlaB鞭毛蛋白和结核分枝杆菌热应激蛋白70(Hsp70),采用镍亲和柱纯化获得该3种重组蛋白;分别将相同剂量(10μg)3种重组蛋白、ISA206佐剂(100μL)和不完全弗氏佐剂(FIA)(100μL)与PCV2 VLP疫苗(50μg)混合,肌肉注射免疫小鼠,初免后14 d加强免疫1次;初免后每周采血分离血清,采用ELISA检测抗原特异抗体;加强免疫后14 d利用PCV2攻毒,攻毒后7 d和14 d采血分离血清,采用荧光定量PCR检测病毒DNA拷贝数;攻毒后14 d迫杀小鼠,制备并培养其脾细胞,经PCV2 VLP疫苗刺激后,采用试剂盒检测细胞因子的表达。SDS-PAGE分析结果显示,3种TLR配体在重组大肠杆菌中均获得正确表达,纯化重组蛋白的纯度大于90%。从初免14 d起,3个分子佐剂组中Ag473佐剂组的PCV2抗体水平最高,但低于ISA206佐剂组却高于FIA组,差异不显著(p>0.05)。在PCV2攻毒前,3个分子佐剂组中Ag473佐剂组的小鼠脾细胞TNF-α和IFN-γ表达水平最高,但低于ISA206佐剂组却高于FIA组,差异显著(p病毒拷贝数均较对照组显著下降(p病毒拷贝数进一步下降,免疫组间差异不显著。研究结果表明在测试的3种分子佐剂中,Ag473脂蛋白具有较强的总体免疫佐剂活性,有望进一步开发为PCV2等病毒的亚单位疫苗佐剂。

关键词：猪圆环病毒2型病毒样颗粒疫苗分子佐剂活性比较

猪繁殖与呼吸综合征病毒及其病毒样颗粒疫苗的研究进展

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黑龙江畜牧兽医 2017年第8期 81-84页

作者：王俊马小元欧云文张永光张杰中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室/OIE/中国国家口蹄疫参考实验室兰州730046

自北美地区出现猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)以来,此病已有几十年的历史,给养猪业带来了毁灭性的打击。感染此病后呼吸系统症状增加,主要侵袭肺部,病变明显而且继发其他病毒和细菌性疾病;怀孕母猪会产生繁殖障碍,导致流产,产死胎和木乃伊... 详细信息

自北美地区出现猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)以来,此病已有几十年的历史,给养猪业带来了毁灭性的打击。感染此病后呼吸系统症状增加,主要侵袭肺部,病变明显而且继发其他病毒和细菌性疾病;怀孕母猪会产生繁殖障碍,导致流产,产死胎和木乃伊胎等。迄今为止临床上仍然使用灭活疫苗和弱毒疫苗来预防此病,但是这两种疫苗都有不可调和的缺陷,并不能提供完全保护力。新型基因工程疫苗病毒样颗粒(VLPs)疫苗是目前的研究热点,因其不具有感染性病毒的遗传物质,仅含有病毒的几种主要结构蛋白,不会造成感染,安全系数高,免疫效果好而被普遍接受。但是猪繁殖与呼吸综合征病毒的VLPs疫苗仍处于实验室开发阶段,不过已经给各类疾病疫苗的研发提供了一个新的思路。文章对猪繁殖与呼吸综合征及其病毒样颗粒疫苗进行综述。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征免疫应答常规疫苗病毒样颗粒疫苗表达系统

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禽流感病毒样颗粒疫苗研究进展

黑龙江畜牧兽医 2023年第22期 31-35页

作者：张莹王成玺王秀荣李文超沈阳工学院生命工程学院辽宁抚顺113122 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所哈尔滨150069

禽流感是由禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)感染引起的一种禽类传染病,给家禽业造成了巨大的经济损失。AIV因抗原漂移和抗原转换可能会产生新的变异毒株和亚型,因此禽流感是在世界范围内需要被重点关注的禽类传染病。病毒样颗粒(... 详细信息

禽流感是由禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)感染引起的一种禽类传染病,给家禽业造成了巨大的经济损失。AIV因抗原漂移和抗原转换可能会产生新的变异毒株和亚型,因此禽流感是在世界范围内需要被重点关注的禽类传染病。病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)能自组装成类似天然病毒结构的蛋白颗粒,易被免疫系统识别,但无遗传物质,安全性较高,是疫苗制备的新方向。禽流感VLPs是基于AIV蛋白模拟禽流感病毒外表面而构成的蛋白颗粒,具有很强的免疫原性,用其制成的疫苗具有无传染性、稳定和不易失活等优势,是一种安全性较高的疫苗类型。笔者就禽流感VLPs疫苗的研发基础、与疫苗有关的结构蛋白及疫苗的通用性和优缺点进行综述,以期对未来禽流感疫苗的研发和防控提供理论参考。

关键词：禽流感病毒样颗粒疫苗禽流感疫苗血凝素神经氨酸酶基质蛋白

大熊猫源CDV/CPV病毒样颗粒疫苗的免疫学评估方法的建立及应用

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大熊猫源CDV/CPV病毒样颗粒疫苗的免疫学评估方法的建立及应用

作者：李强四川农业大学

学位级别：硕士

大熊猫属世界珍稀和易危物种,人工圈养繁殖方式导致其密度较大,容易引发传染性疾病,其中犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)和犬细小病毒(Canine Parvovirus,CPV)对大熊猫种群安全的危害最为严重,对其防控具有重要意义。已经证实,... 详细信息

大熊猫属世界珍稀和易危物种,人工圈养繁殖方式导致其密度较大,容易引发传染性疾病,其中犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)和犬细小病毒(Canine Parvovirus,CPV)对大熊猫种群安全的危害最为严重,对其防控具有重要意义。已经证实,传统的犬源CDV/CPV二联疫苗对大熊猫的免疫效果不佳;金丝雀痘载体疫苗仅含CDV的抗原基因,虽在临床使用,却不能同时保护大熊猫免受CDV/CPV感染。本研究以大熊猫源CDV/CPV作为基础材料,通过表达与大熊猫源CDV/CPV病毒样颗粒(CDV/CPV Virus-Like Particles,CDV/CPV VLPs)相关蛋白,建立ELISA检测方法,并用于大熊猫源CDV/CPV VLPs疫苗的免疫评估。本研究分为以下三个部分:1.大熊猫源CDV FH融合基因与CPV VP基因的原核表达大熊猫源CDV F与H基因经扩增、测序、抗原表位分析、筛选、合成FH融合片段,大熊猫源CPV VP基因经采用同源臂引物扩增、测序,然后分别将FH融合片段与VP基因分别连接到表达载体p ET-32a、p ET-28a中,转化到受体菌BL21(DE3)进行表达,经条件优化(IPTG最适浓度为0.8mmol/L、最佳诱导时间为24h、最佳诱导温度为37℃)后,成功表达FH融合蛋白(约35k Da)与VP蛋白(约70k Da),两种蛋白都以包涵体形式表达,FH融合蛋白与VP蛋白的表达量分别为0.884mg/m L和0.925mg/m L。以FH融合蛋白与VP蛋白为抗原,犬抗CDV FH融合蛋白及CPV VP蛋白的多克隆抗体为抗体进行琼脂扩散试验,CDV FH蛋白的多克隆抗体血清稀释至1:8时有肉眼可见的白色沉淀线;CPV VP蛋白的多克隆抗体血清稀释至1:16时有肉眼可见的白色沉淀线,表明表达蛋白具有免疫原性。两种蛋白经Western blotting验证,目的蛋白能与对应的阳性血清发生特异性反应,表明两种重组蛋白都具有良好的反应原性。2.大熊猫源CDV与CPV抗体间接ELISA检测方法的建立FH融合蛋白与VP蛋白分别作为抗原包被在酶标板上,经抗原包被浓度、血清稀释度、酶标二抗稀释度等条件优化后再确定阴阳性判定标准值。结果为以FH融合蛋白为包被抗原时,最佳包被浓度为8μg/m L,血清最佳稀释度为1:800,酶标二抗最优稀释倍数为1:2000,判定标准为OD值≥0.281为阳性,反之为阴性。以VP蛋白为包被抗原时,最佳包被浓度4μg/m L,血清最佳稀释度为1:400,酶标二抗最优稀释倍数为1:2000,判定标准为OD值≥0.297为阳性,反之为阴性。两种蛋白分别作为包被抗原建立的ELISA检测方法,阳性血清稀释度可达1:25600,敏感性较高;同批次内与不同批次间重复性变异系数均小于10%,重复性较好;且两种包被蛋白不与其他病毒阳性血清发生交叉反应,特异性较好。与商业化检测试剂盒相比,本研究建立的ELISA检测方法灵敏性更高。3.大熊猫源CDV/CPV病毒样颗粒疫苗的免疫效果评估将大熊猫源CDV/CPV VLPs疫苗免疫实验犬,通过安全性试验显示实验犬体温在正常范围内(37.5℃-39℃),免疫部位、行为、脏器、肠道均无异常,表明疫苗未出现明显的副反应。利用建立的两个ELISA检测方法检测血清中特异性抗体,结果为VLPs疫苗免疫完成后机体能快速产生较高水平的特异性抗体并且持续时间长达3个月,且特异性抗体水平在前3个月始终高于犬源CDV/CPV二联苗,免疫效果较好,同时证实所建立ELISA检测方法可用于VLPs的特异性抗体水平评估。另外VLPs疫苗刺激机体后通过对Ig G抗体分型表明,免疫球蛋白Ig A、Ig G1与Ig G2a在前3个月始终与未免疫组有着显著性差异。细胞因子的m RNA转录水平进行测定显示,免疫完成后3周内能促进IL-2、IL-4、IL-10、IL-13、IFN-α、IFN-β的相对表达量;淋巴细胞增殖表明,在Con A的刺激下,VLPs组与犬源二联苗组淋巴细胞增殖存在极显著差异,VLPs组能有效刺激机体产生细胞免疫,提升机体的细胞免疫水平。结果总体显示出VLPs疫苗能激发体液免疫与细胞免疫,免疫效果较好且安全,具有较好的临床应用前景。综上,本研究成功表达了大熊猫源CDV FH融合蛋白与CPV VP蛋白,以表达蛋白作为抗原成功建立了检测犬血清中大熊猫源CDV与CPV抗体的2个ELISA检测方法。应用建立的ELISA方法检测大熊猫源CDV/CPV VLPs疫苗免疫犬只血清抗体水平,证实免疫犬只能快速产生较高水平的特异性抗体并且持续时间长达3个月,显示该疫苗免疫效果较好,具备候选疫苗的条件。

关键词：大熊猫犬瘟热病毒犬细小病毒病毒样颗粒疫苗 ELISA

肠道病毒D68广谱病毒样颗粒疫苗的开发及其免疫效果评价

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肠道病毒D68广谱病毒样颗粒疫苗的开发及其免疫效果评价

作者：马为民中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所)

学位级别：硕士

肠道病毒D68(Enterovirus D68,EVD68)属于小RNA病毒科肠道病毒属D种,该病毒按进化情况可划分3个主要基因型:A(A1-A2),B(B1-B3)和C以及原型株Fermon毒株。2014年以来EVD68在全球多地暴发并引起一系列与呼吸系统相关的疾病,包括支气管炎... 详细信息

肠道病毒D68(Enterovirus D68,EVD68)属于小RNA病毒科肠道病毒属D种,该病毒按进化情况可划分3个主要基因型:A(A1-A2),B(B1-B3)和C以及原型株Fermon毒株。2014年以来EVD68在全球多地暴发并引起一系列与呼吸系统相关的疾病,包括支气管炎、肺炎、呼吸衰竭,甚至死亡。同时有文献报道感染EVD68 B1/B3亚基因型病毒与急性弛缓性脊髓炎发作有因果关联。到目前为止尚无有效的治疗药物以及预防性疫苗上市,EVD68在目前以及将来仍会是公共卫生的一大威胁。开发EVD68尤其是覆盖EVD68 B基因型的疫苗会极大减少病毒感染造成的财政负担以及患者痛苦。在实验室的前期工作中,我们已经开发了针对EVD68-US/MO/14-18947毒株(简称18947毒株)的灭活疫苗以及针对EVD68-US/MO/14-18950毒株(简称18950毒株)的病毒样颗粒(Virus Like Particle,VLP)疫苗。本实验在实验室前期基础上旨在开发一种能够广谱覆盖EVD68 B基因型流行株的VLP疫苗。我们首先以EVD68 B基因型P 1结构蛋白序列为主体,参考EVD68 A和C基因型毒株以及Fermon毒株的P1蛋白序列,选取共有序列(Consensus Sequence)设计了EVD68 Consensus P1序列并绘制进化树比较其与多株EVD68病毒P1序列之间的进化差异。然后Consensus P1序列和18947毒株P1结构蛋白序列一同使用“P1+3CD蛋白酶”策略分别在毕赤酵母中表达,经过Western Blot,SDSPAGE以及负染电镜观察确认两种P1结构蛋白均能够在毕赤酵母系统表达,随后被有效切割成VP0、VP1,VP3并自发组装成病毒样颗粒(简称为Consensus VLP/18947 VLP)。毕赤酵母表达的Consensus VLP能够在小鼠中激发抗体反应,其抗血清对18947VLP、ConsensusVLP都具有很好的结合能力。同时,抗血清对于EVD68B1亚基因型18947株病毒具有高水平的中和滴度,对A基因型US/KY/14-18953株病毒(简称18953毒株)、Fermon株具有低水平的中和反应。毕赤酵母表达的18947 VLP具有良好的免疫原性与抗原性,能够在小鼠中激发出抗体反应,抗血清能够结合18947 VLP抗原。同时,抗血清能够对EVD68 B1亚基因型18947株病毒产生较高水平中和反应以及对A基因型18953株病毒产生高水平中和反应,但对Fermon原型株仅有低水平的中和反应。本实验证明两种VLP是具有良好的免疫原性与抗原性,为下一步开发供临床使用的EVD68 B基因型广谱疫苗提供了依据。

关键词：肠道病毒D68(EVD68) 病毒样颗粒疫苗广谱疫苗