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中国香菇核心种质真菌病毒多样性检测及其携带特点分析

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微生物学通报 2022年第8期49卷 3120-3136页

作者：刘贤伟郭孟配边银丙徐章逸华中农业大学应用真菌研究所湖北武汉430070 湖北省食用菌工程技术研究中心湖北武汉430070

【背景】香菇病毒通常具有潜隐性特征,携带病毒的香菇菌株往往并不表现出明显症状,然而一旦发生常造成较大的经济损失。【目的】解析中国香菇核心种质中真菌病毒多样性特点。【方法】以56个中国香菇核心种质为试验材料,采用RT-PCR和RT-q... 详细信息

【背景】香菇病毒通常具有潜隐性特征,携带病毒的香菇菌株往往并不表现出明显症状,然而一旦发生常造成较大的经济损失。【目的】解析中国香菇核心种质中真菌病毒多样性特点。【方法】以56个中国香菇核心种质为试验材料,采用RT-PCR和RT-qPCR检测技术对34种香菇病毒携带情况进行检测和分析。【结果】研究结果表明,分别有14种和5种香菇病毒的目标基因在绝大多数阳性菌株中扩增出较亮和较暗的条带,RT-qPCR结果也表明阳性带毒香菇菌株中病毒目标基因的扩增结果与病毒含量呈正相关,即病毒在阳性菌株中的含量越高则病毒扩增条带越亮;被检测的34种香菇病毒中,LeFV5和LeMV1检测率为100%;21个栽培种质和35个野生种质中分别有8种和6种香菇病毒检测率为80%以上,而且其中4种病毒相同(LeDFV2、LeFV2、LeSV和LeHV2);栽培菌株和野生菌株携带病毒数分别为8−21种和9−23种,平均每个菌株携带16.4种和16.7种。【结论】香菇种质资源中普遍携带复杂的多种真菌病毒,被检测的病毒在阳性菌株中扩增亮度不同,而且存在明显遗传差异的香菇菌株中携带的一些高检测率病毒相似,暗示这些病毒在香菇进化早期就存在。

关键词：真菌病毒病毒多样性 RT-PCR检测

禾本科作物立枯丝核菌真菌病毒多样性及其与寄主致病力分化关系研究

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禾本科作物立枯丝核菌真菌病毒多样性及其与寄主致病力分化关系研...

作者：王雅蓉湖南农业大学

学位级别：硕士

立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)是一种世界性的、寄主范围十分广泛的植物病原真菌,能引起水稻和玉米等禾本科作物纹枯病,严重影响作物的产量和品质。真菌病毒广泛存在于包括植物病原真菌在内的各大类群真菌中,部分真菌病毒能改... 详细信息

立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)是一种世界性的、寄主范围十分广泛的植物病原真菌,能引起水稻和玉米等禾本科作物纹枯病,严重影响作物的产量和品质。真菌病毒广泛存在于包括植物病原真菌在内的各大类群真菌中,部分真菌病毒能改变寄主的生理生化特性,可引起寄主低毒力表型,具有防治真菌病害的生防潜力。同时,也可以利用真菌病毒与寄主互作研究病原真菌致病机理。本研究对分离自水稻和玉米上的立枯丝核菌AG-1 IA中存在的病毒多样性进行了分析,并对真菌病毒的存在与寄主毒力分化的关系进行了探究。具体研究结果如下:(1)通过ds RNA提取、高通量测序分析了丝核菌中真菌病毒多样性。从湖南和浙江等多地的水稻和玉米上分离获得33个立枯丝核菌。通过ds RNA提取发现32个菌株中含有大小在1.5 kbp到大于15 kbp之间的ds RNA条带。对提取的ds RNA进行高通量测序、拼接、BLASTx比对分析获得病毒相关的contigs序列。设计特异性引物RT-PCR检测验证,明确了这些菌株中存在38个病毒相关的contigs。序列分析发现这些contigs病毒序列分别隶属于11个已知病毒科,如Megabirnaviridae(2个)、Partitiviridae(7个)、Megatotiviridae(2个)、Fusagraviridae(1个)、Fusariviridae(1个)、Endornaviridae(5个)、Narnaviridae(1个)、Mitoviridae(6个)、Deltaflexiviridae(1个)、Rhabdoviridae(1个)和未分类的Toti-like(2个)、以及其他未知的病毒分类单元(9个),其中推定29个contigs为新病毒序列,占76.3%。ds RNA病毒中的Partitiviridae和+ss RNA病毒中的Mitoviridae为优势病毒科。该结果说明立枯丝核菌中含有丰富的真菌病毒资源。对32个立枯丝核菌菌株进行性状培养、致病力测定与产菌核能力比较,发现含病毒菌株的生长速率、产菌核能力和致病力出现分化,然而菌株的弱毒特性与产菌核能力不相关。(2)解析了菌株ZJXD1-1中获得的8个病毒基因组的分子特性与生物学功能。单独提取菌株ZJXD1-1中总RNA进行高通量测序、结合ds RNA常规测序发现该菌株中含有2个内源病毒,5个线粒体病毒和1个未分类的单分体类似病毒,分别命名为Rhizoctonia solani endornavirus 11(RsEV11)、Rhizoctonia solani endornavirus 12(RsEV12)、Rhizoctonia solani mitovirus 106(RsMV106)到Rhizoctonia solani mitovirus110(RsMV110)、Rhizoctonia solani toti-like virus 2(RsTLV2)。基因组结构分析发现RsEV12中含有一个91个氨基酸(aa)的特殊结构域Peptidase C39(肽酶家族C39),这是首次在内病毒中发现该结构域。RsTLV2在系统进化分析中与Totiviridae科具有远源亲缘关系,但与动物病毒Callinectes sapidus toti-like virus 1最相似。通过菌株对峙培养进行病毒水平转移,获得了含有不同病毒组合的衍生菌株,致病力测定发现RsMV110,RsEV11和RsEV12可能具有增强菌株致病力的作用,RsMV106可能具有降低菌株致病力的作用。RsEV11和RsEV12同时存在或丢失,且不易通过菌丝接触进行传播。(3)证明了真菌病毒在立枯丝核菌菌株间多重传播引起菌株致病力分化。通过将4个菌株DLWK2-1-1、DLWK2-1-3、WNT2-1-1、WNT2-1-2与菌株ZJXD1-1对峙培养发现,ZJXD1-1从对峙的菌株中获得了病毒,说明ZJXD1-1具有容纳多种病毒的能力。致病力测定显示ZJXD1-1的8个后代衍生菌株致病力发生了明显分化,其中DWZ-6致病力明显降低。通过进一步对峙培养将DWZ-6中所携带的病毒水平转移至ZJXD1-1中,后代衍生菌株致病力也随之降低,证明DWZ-6致病力减弱与所获得的病毒相关。本研究对分离自湖南和浙江水稻和玉米禾本科作物上的立枯丝核菌中携带的真菌病毒多样性进行了分析,对其中一个菌株中病毒的分子特性和生物学功能进行了研究,并探究了真菌病毒在菌株间的多重传播对立枯丝核菌致病力分化的影响。研究为立枯丝核菌生物防治提供了潜在的真菌病毒资源,也为了解病毒进化和立枯丝核菌致病力分化提供了理论基础。

关键词：真菌病毒病毒多样性立枯丝核菌水平传播低毒力

基于NGS技术挖掘植物寄生线虫中RNA病毒多样性及其系统发育分析

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基于NGS技术挖掘植物寄生线虫中RNA病毒多样性及其系统发育分析

作者：毛慧伦华中农业大学

学位级别：硕士

植物寄生线虫是作物重要病原物之一,每年造成作物大幅度减产和严重的经济损失,但关于植物寄生线虫病毒研究匮乏。揭示植物寄生线虫中病毒种类,将为研究病毒进化及植物寄生线虫生防病毒提供资源。本论文通过对罹患线虫病样品采样、寄生... 详细信息

植物寄生线虫是作物重要病原物之一,每年造成作物大幅度减产和严重的经济损失,但关于植物寄生线虫病毒研究匮乏。揭示植物寄生线虫中病毒种类,将为研究病毒进化及植物寄生线虫生防病毒提供资源。本论文通过对罹患线虫病样品采样、寄生线虫分离及核酸提取等方法构建根结线虫和腐烂茎线虫的宏病毒转录组文库,结合公共数据库中植物寄生线虫物种的转录组数据,对植物寄生线虫中病毒类型及分子特性进行了分析。具体研究结果如下:获得50种不同RNA病毒的序列信息,通过末端克隆技术获得了7个病毒的完整基因组序列或完整单节段基因组序列。基于数据库比对分析,在腐烂茎线虫宏转录组文库中鉴定到14种不同的病毒序列,包括13种潜在的新病毒和1种已在隐杆线虫中报道的野田村病毒SANTV;在植物寄生线虫开源RNA-seq数据中组装得到36种包含完整Rd Rp区域的病毒序列,其中25种与已知病毒基因组序列相似性较低,被认为是新的RNA病毒,另外11种是已在植物寄生线虫中报道的病毒。挖掘得到的50种RNA病毒隶属于12个病毒科或病毒目,其中负单链RNA(-ss RNA)病毒占比最高(50%),包括9个布尼亚病毒目(Bunyavirales)(包括Phenuiviridae、Discoviridae和未分类的布尼亚病毒)成员、4个弹状病毒科(Rhabdoviridae)成员、4个Nyamiviridae成员、4个越病毒科(Yueviridae)成员、2个秦病毒科(Qinviridae)成员和2个正粘病毒科(Orthomyxoviridae)成员。正单链RNA(+ss RNA)病毒占比次之(48%),包括2个野田村病毒科(Nodaviridae)成员、1个内源RNA病毒科(Endornaviridae)成员、2个雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)成员、3个黄病毒(Flaviviridae)成员以及13种隶属于小核糖核酸病毒目(Picornavirales)(包括Marnaviridae、Dicistroviridae和未分类的小核糖核酸病毒)病毒;另外还鉴定到1种双链RNA(ds RNA)病毒,隶属于双RNA病毒科(Birnaviridae),这也是首次在植物寄生线虫中发现双链RNA病毒。未在植物寄生线虫宏转录组数据库中发现DNA病毒信息。总之,该研究鉴定了50种以植物寄生线虫为宿主的RNA病毒,揭示了侵染线虫病毒的多样性。发现在基于Rd Rp蛋白的系统发育分析中,同一病毒类群中线虫病毒更倾向于聚集在同一分支,表现出明显的宿主特异性;同时病毒宿主范围及分布情况的调查显示,大多植物寄生线虫病毒可侵染多个线虫物种,展现了线虫病毒宿主的物种多样性和分布广泛性。植物寄生线虫中隐藏的丰富病毒信息不仅对病毒进化史的进一步完善具有重要意义,并为合理利用线虫病毒资源提供支撑。

关键词：植物寄生线虫腐烂茎线虫 RNA病毒病毒多样性进化关系

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长江江豚病毒多样性及其流行病学研究

长江江豚病毒多样性及其流行病学研究

作者：赵新华中农业大学

学位级别：硕士

长江江豚(Neophocaena asiaeorientalis asiaeorientalis,YFP)是一种极度濒危的淡水鲸类,现存1249头。尽管长江江豚的数量较之前有所恢复,但其濒危的状况仍未改变,并且病毒性疾病等因素尚属空白。因此本文以病毒宏基因组学等为方法,探... 详细信息

长江江豚(Neophocaena asiaeorientalis asiaeorientalis,YFP)是一种极度濒危的淡水鲸类,现存1249头。尽管长江江豚的数量较之前有所恢复,但其濒危的状况仍未改变,并且病毒性疾病等因素尚属空白。因此本文以病毒宏基因组学等为方法,探究位于天鹅洲白鱀豚国家级自然保护区内长江江豚肛拭子样所包含的病毒多样化情况,研究长江江豚的病毒流行病学。并分别利用乳头瘤病毒E1与L1基因,为新发现的长江江豚乳头瘤病毒(Papillomavirus,NaPVs)建立检测方法以及构建包含主要衣壳蛋白L1基因的原核表达质粒。主要结果如下:1.通过宏基因组测序共鉴定出属于9个科的19种病毒,包括Papillomaviridae,Herpesviridae,Picornaviridae,Picobirnaviridae,Caliciviridae,Retroviridae,Parvoviridae,Virgaviridae,Narnaviridae及其他未分类的病毒。在上述病毒中,根据新发现的长江江豚疱疹病毒(Na HV)、嵴病毒(Na KV1-2)和乳头瘤病毒(NaPV1-6)的潜在致病性,以分子生物学的方法检测样本中病毒的携带情况,检测结果表明大多数长江江豚携带一种或多种病毒(52/58,89.7%)。并且嵴病毒和疱疹病毒显示出明显的年龄分布趋势,而PVs在长江江豚中显示出明显的性别差异特征。然后,根据乳头瘤病毒科各个属的物种划分标准,在长江江豚中发现了两个新的PVs种(指Omikronpapillomavirus 2和3)和4株新分离的PVs。进一步的进化分析表明,NaPVs占据粘膜生态位,并且病毒与宿主的共进化、复制、重组以及宿主转换事件的混合,共同驱动了鲸类PVs的进化。最后,根据估算的长江江豚和其他鲸类中PVs的分化时间,反映了长江江豚初生物种的地位。总之,研究结果揭示了长江江豚中潜在的病毒种类、病毒流行情况以及演化历程,为病毒感染对长江江豚健康及繁衍的影响提供了研究方向。2.对6种NaPVs的全基因组序列进行多序列比对,选择最为保守E1基因为目的序列,并设计简并引物,通过扩增体系优化,建立了NaPVs检测方法。以上述6种病毒序列为模板,PCR扩增后测序,确定引物最佳退火温度为50℃,将测序正确的NaPV4基因序列连接至T载体,构建好的质粒以10倍比稀释,使拷贝数在1×10-1×10之间,最终确定该检查方法的灵敏度为10.6 copies/μL。3.以新发现的长江江豚乳头瘤病毒2型(NaPV2)全基因组序列为模板,扩增其编码L1基因的区域,并连接至原核载体p GEX-4T-1-L1,对重组质粒进行双酶切鉴定及目的基因测序后转入大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG诱导表达,探究不同温度下融合蛋白的表达形式,并以GST亲和层析纯化可溶性蛋白。SDS-PAGE显示,在20℃下,NaPV2 L1-GST融合蛋白以可溶性和包涵体形式高效表达,相对分子质量约82 000。NaPV2 L1在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,为NaPV2 L1的疫苗制备奠定了基础。

关键词：长江江豚宏基因组乳头瘤病毒病毒多样性共进化乳头瘤病毒检测

梨胴枯病菌间座壳菌病毒多样性分析及三种新病毒的鉴定

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梨胴枯病菌间座壳菌病毒多样性分析及三种新病毒的鉴定

作者：李雯华中农业大学

学位级别：硕士

由间座壳菌(Diaporthe spp.)引起的梨胴枯病是重要的枝干病害,近年在梨产区的发生和危害明显加重,严重影响产业的发展。生物防治技术与产品的研发是近些年来的热点,现已证实真菌病毒是潜在的生防资源。本研究以实验室前期从我国梨胴枯... 详细信息

由间座壳菌(Diaporthe spp.)引起的梨胴枯病是重要的枝干病害,近年在梨产区的发生和危害明显加重,严重影响产业的发展。生物防治技术与产品的研发是近些年来的热点,现已证实真菌病毒是潜在的生防资源。本研究以实验室前期从我国梨胴枯病样品中分离鉴定获得的间座壳菌为材料,通过高通量测序结合检测验证进行间座壳菌病毒种类多样性研究,并对新鉴定出的三种间座壳菌病毒分子生物学特性进行系统性研究,旨在明确我国梨胴枯病菌中真菌病毒的多样性,并为探究真菌病毒起源和进化提供新的有用信息。1.梨胴枯病菌中病毒种类多样性研究。对来源于9个省(市)梨胴枯病样品的10种间座壳菌的25个菌株进行高通量测序,结果显示这些菌株的混合样品中存在有4个科的9种病毒,其中8种为新发现的病毒。其中+ss RNA病毒5种,-ss RNA病毒3种,ds RNA病毒1种。基于病毒Rd Rp氨基酸序列的系统进化分析显示,5种+ss RNA病毒分属于线粒体病毒科(Mitoviridae)和帚状病毒科(Virgaviridae),3种-ss RNA病毒分属于布尼亚病毒目(Bunyavirales),1种ds RNA病毒分属于四分体病毒科(Quadriviridae)。进一步通过RT-PCR检测发现以上25个菌株中9个菌株携带病毒,其中1个菌株携带2种+ss RNA病毒,其余8个菌株均各携带1种病毒。2.三种间座壳菌新型病毒的分子生物学特性研究。(1)从来源于江西的D.padina菌株DK160中鉴定出1种新的单组分-ss RNA病毒,暂命名为Diaporthe negative-stranded RNA virus 1(DNs RV1)。DNs RV1的基因组全长为9945 nt,包含一个编码Rd Rp的ORF。该病毒属于布尼亚病毒目中新建议成立的一个科Mybuviridae。DNs RV1可稳定地通过分生孢子垂直传播,还可在不同种间座壳菌株之间水平传播。对峙培养结果可看出DNs RV1对其寄主的表型无显著影响。(2)从来源于福建的D.hongkongensis菌株DK114中鉴定出1种新的单组分+ss RNA病毒,暂命名为Diaporthe virga-like virus 1(Dv LV1)。Dv LV1的基因组全长为11441nt,包含1个ORF,编码1个Rd Rp和1个解螺旋酶保守结构域。该病毒与帚状病毒科的亲缘关系最近,但不能归属到目前已知的属中,建议将该病毒及与其亲缘关系相近的病毒成立帚状病毒科中的一个新的病毒属。(3)从来源于江苏的D.caryae菌株DK380中鉴定出1种新的ds RNA病毒,暂命名为Diaporthe disease-associated mycovirus(Dd AMV)。Dd AMV包含4条ds RNA基因组,RNA1-3基因组的全长分别为4828 bp、3628 bp和4185 bp,RNA4基因组已知序列的长度为2133 bp。Dd AMV病毒粒子球形,平均直径41.7 nm。基于Rd Rp氨基酸序列系统进化分析,该病毒与四分体病毒科的亲缘关系最近,其中该科的已知成员Rn QV1聚在一个分支,而Dd AMV与一些尚未明确归属到该科的病毒则聚在另一个分支。

关键词：梨胴枯病间座壳菌病毒多样性 DNsRV1 DvLV1 DdAMV

酱香型白酒发酵过程细菌病毒多样性及其功能的研究

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酱香型白酒发酵过程细菌病毒多样性及其功能的研究

作者：傅文博江南大学

学位级别：硕士

中国白酒酿造是一个在开放环境下由多种来源的微生物群落共同驱动的谷物发酵过程,其中核心的细菌和真菌已经受到了相当多的关注,被认为是影响发酵产物和品质的关键因素。除此之外,近年来食品发酵中感染微生物的病毒也逐渐开始被研究。... 详细信息

中国白酒酿造是一个在开放环境下由多种来源的微生物群落共同驱动的谷物发酵过程,其中核心的细菌和真菌已经受到了相当多的关注,被认为是影响发酵产物和品质的关键因素。除此之外,近年来食品发酵中感染微生物的病毒也逐渐开始被研究。病毒是没有细胞结构的生命实体,可以感染包括微生物在内的所有细胞生命形式。以微生物作为宿主的病毒可以调节群落结构且具有改变宿主代谢的潜力。因此,探索在白酒发酵过程中尚未被研究的微生物病毒多样性,以及其如何对发酵菌群和代谢产物造成影响,有助于提高对微生物相互作用的认识,有助于维系发酵微生物群落的稳定可控。本研究以酱香型白酒发酵体系中感染微生物的病毒作为研究对象,借助噬菌体可培养诱导、病毒宏基因组学和特异性聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)等研究手段,初步探明了酱香型白酒发酵中的病毒多样性、基因功能以及与发酵微生物的潜在联系。取得的主要研究结果如下:首先,经过病毒宏基因组测序,探究了酱香型白酒发酵过程中的病毒多样性。在酱香型白酒发酵体系样品中共鉴定出病毒9科178属944种,其中以有尾病毒目(Caudovirales)为主。在发酵过程中长尾病毒科(Siphoviridae)占比为30.4%～47.3%、肌尾病毒科(Myoviridae)占比为34.7%～48.0%,以及丝杆状病毒科(Inoviridae)占比为16.6%～20.5%是最主要的微生物病毒。酱香型白酒发酵环境和酒醅具有相似的病毒多样性。此外,根据病毒的系统发育树推断发酵体系中还存在未被表征的长尾病毒科多样性。第二,对酒醅样品的病毒宏基因组数据进行统计学分析发现,窖内发酵过程显著富集了长尾病毒科、肌尾病毒科和丝杆状病毒科,入窖发酵5天后三个病毒科丰度增幅达到260.8%～1276.8%。在窖内发酵过程中细菌香农多样性指数减少49.4%,而病毒香农多样性指数增加40.1%,并且病毒与核心细菌的丰度在发酵过程中呈显著负相关(P病毒、微生物群落和发酵参数之间存在显著相关性(P病毒在内的微生物相互作用会对发酵菌群结构产生重要影响。第三,在酱香型白酒发酵病毒基因注释中占比7.9%的“氨基酸转运与代谢”和5.7%的“碳水化合物转运与代谢”的重要辅助代谢功能在病毒基因中较为丰富。通过聚类得到957个非冗余病毒碳水化合物活性酶,其中69.9%是糖苷水解酶。此外,病毒氨基酸活性酶可以广泛参与包括半胱氨酸、蛋氨酸和甘氨酸等氨基酸的利用和合成途径。第四,来源于酱香型白酒发酵的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)MT-B06基因组中存在7个前噬菌体区域,其中4个为基因序列互不相同的完整前噬菌体区域。前噬菌体会通过水平基因转移获得和表达宿主编码Cot D孢子外壳蛋白的基因。26株来源于酱香型白酒发酵的地衣芽孢杆菌中至少69.23%存在前噬菌体编码主要衣壳蛋白的基因,100%存在前噬菌体编码Cot D孢子外壳蛋白的基因,表明前噬菌体整合和水平基因转移在酱香型白酒发酵核心细菌中广泛存在。此外,从高温大曲中诱导出的溶原噬菌体可以在细菌对数生长期显著抑制地衣芽孢杆菌的生长(P<0.05)。

关键词：酱香型白酒病毒多样性发酵微生物辅助代谢基因前噬菌体

内蒙古一个规模化养殖杜泊羊鼻咽和肛拭子的全病毒组分析

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经济动物学报 2024年

作者：王慧羽特木尔巴根孙悦涂长春李林川高登军何彪中国农业科学院长春兽医研究所内蒙古动物疫病预防控制中心吉林农业大学动物科学技术学院

内蒙古地处我国北部，横跨东北、华北、西北地区，毗邻外蒙古和俄罗斯。该地区富含丰富的牧草资源，具有得天独厚的牛羊养殖业发展优势。随着国民经济稳步提升，在养殖规模和数量明显增加的背景下，各种动物疫病的发生也呈上升趋势，然... 详细信息

内蒙古地处我国北部，横跨东北、华北、西北地区，毗邻外蒙古和俄罗斯。该地区富含丰富的牧草资源，具有得天独厚的牛羊养殖业发展优势。随着国民经济稳步提升，在养殖规模和数量明显增加的背景下，各种动物疫病的发生也呈上升趋势，然而该地区的草食家畜携带的病毒本底数据还十分欠缺。本研究对内蒙古一个杜泊羊规模化养殖场的30头成年羊与10头羔羊的鼻咽拭子和肛拭子样品，通过宏转录组法和多重替代扩增法进行全谱病毒组学分析，结果共发现12个哺乳动物病毒科。对星状病毒、肠道病毒、口疮病毒与轮状病毒进行遗传进化分析，发现星型状病毒与现有已知病毒遗传差异较大，为新的病毒种；而肠道病毒、口疮病毒与轮状病毒VP1基因片段与参考毒株差异较小。RT-PCR检测发现，揭示了该地区绵羊携带病毒的多样性和流行情况。本研究初步获得了该养殖场存在的病毒病原本底数据，为了解杜泊羊携带病毒多样性和防范病毒性传染病奠定了基础。

关键词：绵羊宏病毒组学病毒多样性

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长江水体病毒群落解析及遗传多样性研究

长江水体病毒群落解析及遗传多样性研究

作者：芦娟江苏大学

学位级别：硕士

目的水域生态系统中包含着数量极其丰富的病毒群,水中病毒的数量大约比水中细胞生物的总数量高一个数量级。病毒可被视为水生生物发病和死亡的主要原因之一,与此同时,水域生态环境反过来会进一步促使病毒在宿主种内和种间传播。人类和... 详细信息

目的水域生态系统中包含着数量极其丰富的病毒群,水中病毒的数量大约比水中细胞生物的总数量高一个数量级。病毒可被视为水生生物发病和死亡的主要原因之一,与此同时,水域生态环境反过来会进一步促使病毒在宿主种内和种间传播。人类和动物可通过饮用受污染水、游泳或吸入气溶胶等途径感染病毒。此外,水域生态系统中的病毒通常以噬菌体为主,这些噬菌体在调控水中菌群和调节生物地球化学循环方面发挥着重要作用。因此,探索水生环境中病毒群的组成对于监测水中的致病性病毒以及保证水资源的可持续发展具有重要意义。但目前对江河水中病毒群的组成情况知之甚少。长江是世界第三大长河,西起唐古拉山脉,向东汇入东海。其中,位于长江下游的长江三角洲地区是世界上人口最密集且经济最发达的地区之一。因此本研究以长江三角洲地区为取样地,探索长江水体中的病毒群落特征。方法本研究在安庆、芜湖、南京、镇江、常州和南通6个采样点取样。使用病毒宏基因组学方法探究长江水体中病毒群的组成特征,并进一步比较长江沿岸各采样点间病毒组的差异,最后基于各病毒群的特征基因进行系统发育分析,以探究长江水体中病毒群的遗传多样性。结果（1）病毒群的组成及差异虽然各采样点的病毒群在物种丰度上有细微差异,但总体上组成相似,均以有尾噬菌体目（Caudovirales）为主,并且淡水噬菌体uv FW种（Freshwater phage uv FW）在各样本中普遍存在。位于南京的病毒群具有独特的组成特征,其中细小病毒科（Parvoviridae）的丰度较高。在科水平上,本研究共检测出17个病毒科,包括9个ds DNA病毒科、4个ss DNA病毒科和4个RNA病毒科。6个文库中的病毒reads主要归类于有尾噬菌体目,包括长尾噬菌体科（Siphoviridae）（37.20%±4.27%）、短尾噬菌体科（Podoviridae）（12.96%±1.19%）、肌尾噬菌体科（Myoviridae）（7.21%±2.15%）等ds DNA病毒科。ss DNA病毒主要由微小噬菌体科（Microviridae）组成（2.25%±1.84%）;而南京的水样病毒群中最主要的ss DNA病毒科是细小病毒科（Parvoviridae）（11.88%）。其余的ss DNA病毒科均为CRESS-DNA病毒,主要包括环状病毒科（Circoviridae）（0.24%±0.11%）和类双生病毒科（Genomoviridae）（0.07%±0.09%）。仅有少部分序列属于RNA病毒,包括星状病毒科（Astroviridae）（0.07%±0.11%）、肝炎病毒科（Hepeviridae）（0.01%±0.02%）、双顺反子病毒科（Dicistroviridae）（0.11%±0.18%）和帚状病毒科（Virgaviridae）（0.49%±0.55%）。主坐标（PCo A）分析和UPGMA树状图显示,取自南京的病毒组与其他五个采样点间存在明显差异。但Friedman检验结果显示,各样本间的差异无显著统计学意义（P＞0.05）。在种水平上,6个文库中共鉴定出201个病毒种,其中37个种为共有病毒种,在各样本的病毒种总数中占31%～45%。南京的水样文库中特有病毒种的数量最多,占其总数的47%。各病毒群都以噬菌体的丰度最高。淡水噬菌体uv FW种（Freshwater phage uv FW）在6个文库中都普遍存在,在各文库中的占比范围是8.93%～24.63%。南京的文库中特有病毒种的数量最多,包括气单胞菌噬菌体62Ahyd R11PP种（Aeromonas phage 62Ahyd R11PP）和维尔坦病毒（Viltain virus）等。此外,芜湖文库中特有的病毒种主要属于聚球菌噬菌体（Synechococcus phages）。（2）病毒特征基因系统发育分析系统发育分析结果显示,有尾噬菌体目（Caudovirales）和CRESS-DNA病毒具有较高的遗传多样性。基于有尾噬菌体目的Ter L蛋白序列构建的系统发育树显示,本研究中的248条Ter L蛋白序列均与已知参考序列的亲缘关系较远,无法归类于有尾噬菌体目中已知的病毒科。同样,基于24条CRESS-DNA病毒的复制相关蛋白（Rep）序列构建的系统发育树显示,本研究中的Rep序列均归类为未分类的CRESS-DNA病毒序列,并且其中有六条序列与已知的病毒序列亲缘关系较远,形成了若干新的未分类病毒群。相反,微小噬菌体科（Microviridae）、细小病毒科（Parvoviridae）和核糖病毒域（Riboviria）的病毒遗传多样性相对较低。基于15条RNA病毒的Rd Rp蛋白构建的系统发育分析结果显示,其中3条序列属于植物病毒科（Virgaviridae）,一条病毒与蝙蝠星状病毒聚类,其余的Rd Rp序列都与未分类的核糖病毒域（Riboviria）中的已知物种聚类。同样,基于微小噬菌体科的主要衣

关键词：淡水病毒组长江病毒宏基因组学病毒多样性

海南鼠类携带病毒的系统进化分析及多样性研究

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海南鼠类携带病毒的系统进化分析及多样性研究

作者：黎优优海南医学院

学位级别：硕士

目的:啮齿类是100多种病毒的天然宿主,生活区域与人类活动范围有广泛的重叠,直接或者间接接触鼠类病毒可感染人类而引起传染性疾病爆发。海南自由贸易试验区地处热带地区,湿热的地理环境和频繁的贸易往来,使各种热带病毒性传染病的传播... 详细信息

目的:啮齿类是100多种病毒的天然宿主,生活区域与人类活动范围有广泛的重叠,直接或者间接接触鼠类病毒可感染人类而引起传染性疾病爆发。海南自由贸易试验区地处热带地区,湿热的地理环境和频繁的贸易往来,使各种热带病毒性传染病的传播风险增加。海南的黄猄角岭、鹦哥岭和邦溪和自然保护区等地人迹罕至且啮齿动物种类丰富。本课题基于新一代测序技术(Next generation sequencing,NGS)的病毒组学研究方法,对海南城市周边区域及自然保护区中的代表性啮齿动物所携带的沙粒病毒科、冠状病毒科、黄病毒科、星状病毒科、细小病毒科和乳头瘤病毒科开展病毒组学研究,描绘海南啮齿动物携带病毒的病毒谱、遗传多样性、以及系统进化和宿主地理分布特征,鉴定病毒新属或种,并分析是否存在跨种传播给人类或者饲养动物的潜在病原体。方法:本课题采样地域覆盖海南岛的山地、平原和丘陵,采样季节覆盖鼠类活动频繁的春季和秋季,采集地区包括东南西北中代表城市周边和自然保护区。从海南9个地区采集的682份鼠类咽和肛拭子样本,按照鼠种、拭子类型和采集地区分组后(15～20个样本为一组)混合成28个混合样本。混合样本通过过滤和超离去除细菌、真菌等非病毒成分,消化去除游离的无包膜核酸,然后提取病毒核酸并反转后经锚定引物扩增,磁珠分选获得纯化片段,使用Illumina的Hi Seq2500测序仪(Illumina,USA)分析扩增的病毒核酸文库。Trinity对每个样本中质量控制后的有效读长(Reads)组装成重叠群(Contigs),并使用Diamond将每条contigs与美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)的非冗余蛋白质数据库(Non-redundant protein database,NR)比对以评估病毒的分类。提取相应病毒科,根据病毒reads的分子提示,设计特异性引物进行Nest-PCR扩增病毒全基因组或保守区域后Sanger测序,并检测该宿主携带病毒的阳性率和分析系统进化特征。结果:基于新一代测序技术对682份源自海南不同地区的鼠类拭子进行病毒组学研究。6个病毒科进行基因组验证、系统进化分析及与宿主的协同进化分析。“过滤-富集-核酸酶消化-病毒核酸提取-锚定引物扩增”构成严格的核酸文库构建流程,结合稳定的新一代测序技术和生物信息学质控。从28个核酸文库中共获得了136 GB数据,近86,114,574条有效reads信息。排除鼠类宿主、细菌、真菌等病毒无关序列,共得到7,553,938条病毒的reads,并拼接成33,062条contigs后比对NR库,结果显示与67个病毒科相关,进一步排除非哺乳动物病毒后,总共有28,999条contigs与22个哺乳病毒科相关(占全部病毒contigs的87.72%),其中冠状病毒、细小病毒、黄病毒、星状病毒、乳头瘤病毒6个与人类和饲养动物病毒相关的哺乳动物病毒科呈现高数据量,有3,353条contigs提示(占全部病毒contigs的10.14%)。根据contigs提示设计巢式引物,对上述的6个病毒科的病毒进行验证,并对需要扩增病毒全基因组但无poly A尾的RNA病毒加A尾,应用5′RACE方法扩增病毒5′末端,3′RACE方法扩增病毒3′末端。目前已完成6个病毒科6个病毒属8株病毒全基因组、11株病毒基因组序列,其中7株建议为新的病毒种。病毒reads的热度图显示,沙粒病毒分布在三亚的黄胸鼠中,冠状病毒分布在海口和临高的黄胸鼠、白沙的小泡巨鼠中,黄病毒分布在白沙的小泡巨鼠和澄迈的黄胸鼠中,星状病毒分布在澄迈和临高的黄胸鼠中,乳头瘤病毒分布在海口的黄胸鼠、屯昌的褐家鼠和白沙的针毛鼠中,细小病毒分布在海口和澄迈的黄胸鼠、白沙的黑缘齿鼠和小泡巨鼠中。本研究在陵水的黄胸鼠中发现新的沙粒病毒和东南亚引起人不明原因发热病例的温州病毒(Wenzhou virus,WENV)亚型具有92.38%以上的同源性,具有潜在传播给人的可能性。新发现的冠状病毒与从肺炎病人中分离到的Human coronavirus HKU1(HCo V-HKU1)和HCo V-OC43显示出90.14%～93.91%的同源性。农村和城区周边来源的鼠类病毒与国内外已知鼠类病毒显示出较高的同源性,并在系统进化上一致,但是来源于黄猄角岭、邦溪和国家级自然保护区鹦哥岭的新型瘟病毒、博卡病毒和乳头瘤病毒等,与已知病毒的同源性较低,小泡巨鼠、黑缘齿鼠也从未被报道过是这些病毒的宿主。结论:(1)海南不同地域及生态环境的16个采样点采集的鼠类拭子样本具有高丰度的病毒,海口、三亚、东方、澄迈和陵水等城市周边地区的黄胸鼠和褐家鼠携带高丰度的冠状病毒、小核糖核酸病毒、疱疹病毒、星状病毒和乳头瘤病毒等哺乳动物病毒科。东方、海口和三亚等多个采样点存在许多未分类的RNA病毒。黄猄角岭、邦溪和

关键词：鼠类病毒组系统进化分析病毒多样性