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猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3蛋白中和抗体的制备

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猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3蛋白中和抗体的制备

作者：李秋稷山东农业大学

学位级别：硕士

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是目前危害全球猪养殖业的疾病之一,由PRRS病毒(PRRSV)感染引起。其症状为母猪厌食发热、呼吸系统障碍、妊娠后期发生流产、产死胎和木乃伊胎,仔猪发生呼吸系... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是目前危害全球猪养殖业的疾病之一,由PRRS病毒(PRRSV)感染引起。其症状为母猪厌食发热、呼吸系统障碍、妊娠后期发生流产、产死胎和木乃伊胎,仔猪发生呼吸系统疾病和大量死亡。该病对我国养猪行业造成巨大损失。由于目前没有有效药物,且现有的疫苗免疫效果不理想,特别是疫苗毒株和野毒重组形成新的变异毒株,使得该病的防控异常艰巨。中和抗体作为一种精确高效的杀伤病毒的抗体,在兽医临床中具有重要的诊疗作用。PRRSV中有许多病毒蛋白可诱导机体产生中和抗体,其中结构蛋白GP3含有中和抗体表位,GP3被认为与机体保护性免疫有关。本研究通过制备GP3单克隆抗体,研究其病毒中和活性,表达具有中和活性的单链抗体,对PRRSV进一步的研究提供有利的工具,为PRRS的防控奠定基础。本研究共分为三个内容:(1)PRRSV GP3蛋白的原核表达与蛋白纯化和复性首先将PRRSV TA-12株的GP3基因使用双酶切连接的方法克隆到pET-32a空载体上,经转化DH5α感受态细胞,提取菌液PCR阳性的质粒和双酶切验证,构建好pET-32a-GP3重组质粒。测序鉴定后转化到BL21感受态细胞中并进行诱导表达,经SDS-PAGE凝胶电泳和蛋白凝胶考马斯亮蓝染色验证分析,PRRSV GP3重组蛋白呈不溶性表达,大小约为35 kDa,再通过Ni-NTA亲和层析柱方法纯化GP3重组蛋白,运用尿素梯度透析法复性纯化的PRRSV GP3重组蛋白,检测蛋白浓度。由此获得用于免疫小鼠的免疫原。(2)PRRSV GP3蛋白单克隆抗体的制备与抗体病毒中和作用复性的GP3蛋白SDS-PAGE凝胶电泳和蛋白凝胶考马斯亮蓝染色验证,BCA法检测蛋白浓度,达到免疫浓度后对3只7周龄雌性Balb/C小鼠进行免疫,三次免疫后在小鼠尾静脉采血,取血清通过间接ELISA试验检测小鼠血清抗体水平,小鼠血清达到细胞融合条件后对小鼠进行加强免疫,三天后取小鼠脾细胞与培养的SP2/0小鼠骨髓瘤细胞,通过化学法加入融合剂聚乙二醇(PEG)对两种细胞进行融合。细胞融合14 d之后以表达的GP3蛋白作为抗原,包被ELISA酶标孔,通过间接ELISA试验对融合细胞上清进行抗体检测,筛选能够分泌抗体的阳性杂交瘤细胞,在经过三次亚克隆获得既能够分泌抗体又能够无限传代的两株杂交瘤细胞,命名为GP3-8B7和GP3-7B3。经间接免疫荧光试验(IFA)和Western Blot试验验证了这两株GP3单克隆抗体的特异性。GP3抗体的两株杂交瘤细胞按相应的细胞数量注射到经产Balb/C小鼠体内,制备了GP3单克隆抗体。获取的两株GP3单克隆抗体保存在-80℃超低温环境中。固定每细胞孔中病毒量为0.1个MOI。2倍稀释GP3单克隆抗体,病毒与不同稀释度的抗体按照1:1比例混合,在37℃的条件下作用1 h,将混合液接种到长满单层的Marc-145细胞上,于37℃的条件下作用2 h,同时设置对照(小鼠免疫前保存的阴性血清按照2倍稀释,与病毒混合后感染细胞)和(小鼠融合前保存的阳性血清按照2倍稀释,与病毒混合后感染细胞)。2 h后更换维持液,逐天观察细胞病变,待3 d左右细胞状态稳定,通过IFA试验观察荧光情况来检测GP3单克隆抗体对PRRS病毒中和的效果结果显示阴性血清无中和病毒的作用,GP3小鼠阳性血清具有中和病毒的作用,效价为2,GP3-8B7和GP3-7B3两株单克隆抗体的病毒中和效价均为2。(3)GP3单链抗体的制备与抗体病毒中和作用为了使得抗体更易大量获取,使抗体最小化。通过扩增GP3单克隆抗体中可变区轻链与重链,人为加入连接肽(Linker)将GP3单克隆抗体的轻链可变区(L)和重链可变区(H)与pET-28a-sumo空载体构建成重组基因。经双酶切验证和测序结果比对,最终成功构建GP3-8B7与GP3-7B3单链抗体基因。通过原核表达的方法获得蛋白,GP3单链抗体蛋白分子量为54 kDa。SDS-PAGE凝胶电泳验证其为不可溶性表达,获得的两株GP3单链抗体蛋白经过纯化和复性,通过SDS-PAGE凝胶电泳验证复性效果,BCA法检测其蛋白浓度。使用带有GFP标签的PRRSV毒株,固定每细胞孔病毒的量。蛋白按照2倍稀释后等比例与PRRS病毒混合,进行与检测单克隆抗体病毒中和试验相同的操作。3 d左右细胞逐渐状态稳定,直接在倒置荧光显微镜下观察。结果发现GP3-8B7单链抗体病毒中和效价为2,GP3-7B3单链抗体病毒中和效价为2。综上所述,本研究通过获得针对PRRSV GP3蛋白的两株中和抗体,原核表达了这两株单克隆抗体的单链抗体,制备的单链抗体具有较好的中和活性,研究结果可为PRRS的防控奠定基础。

关键词： PRRSV GP3单克隆抗体单链抗体病毒中和

温箱和水浴加热法中和新城疫病毒、传染性支气管炎病毒的效果比较

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中国畜禽种业 2022年第8期18卷 70-72页

作者：胡江锋张小娟胡春艳白剑英杨凌绿方生物工程有限公司陕西西安712100 陕西省兽用生物制品工程技术研究中心陕西西安712100 陕西诺威利华生物科技有限公司陕西西安712100

为明确“鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗”效力检验项病毒中和的条件参数,使检验数据能真实反映疫苗效价的目的。该研究对“鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗”的两种类型LaSota株+H120株和LaSota株+H52株进行效力检验,采用温... 详细信息

为明确“鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗”效力检验项病毒中和的条件参数,使检验数据能真实反映疫苗效价的目的。该研究对“鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗”的两种类型LaSota株+H120株和LaSota株+H52株进行效力检验,采用温箱、水浴两种方法在不同温度下进行病毒与对应阳性血清中和。结果显示,阳性血清在25℃以上水浴法及30℃以上温箱法均可完全中和病毒,但30℃的水浴法及温箱法中和会对另一种不予中和的待测病毒带来损伤,导致检验数据不可靠。可见,“鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗”效力检验时,病毒与阳性血清的中和宜采用25℃水浴法1h。

关键词：二联活疫苗效力检验病毒中和水浴温箱

多功能抗蛋白吸附聚合物纳米药物载体的设计研究

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多功能抗蛋白吸附聚合物纳米药物载体的设计研究

作者：陈豪湖北大学

学位级别：硕士

随着科学与技术的持续创新,多功能抗蛋白吸附聚合物纳米药物载体现在已经取得了蓬勃的发展,尤其是在主动靶向递送抗癌药物、增强肿瘤治疗和病毒中和治疗等领域已取得显著的进展,为纳米药物载体体内治疗开创了可能。纳米药物载体能够与... 详细信息

随着科学与技术的持续创新,多功能抗蛋白吸附聚合物纳米药物载体现在已经取得了蓬勃的发展,尤其是在主动靶向递送抗癌药物、增强肿瘤治疗和病毒中和治疗等领域已取得显著的进展,为纳米药物载体体内治疗开创了可能。纳米药物载体能够与血清中的生物大分子相互作用,在其表面形成一层“蛋白质冠”,不仅会屏蔽纳米粒子的靶向能力,也使其容易被吞噬细胞识别和清除。尽管现在已研究出越来越多的防污材料,但它们作为抗蛋白吸附纳米药物载体在实现完全无“蛋白质冠”和靶向运输方面仍面临巨大挑战。另一方面,2019年12月,由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型(SARS-Co V-2)引起的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)在全球范围内爆发。尽管新型冠状病毒疫苗和特效药都已取得初步成效,但其生产成本高,价格昂贵并且毒副作用大,导致在新型冠状病毒治疗领域仍存在诸多不足。本文针对以上这些问题,设计了两种不同功能的抗蛋白吸附纳米药物载体,用于癌症靶向治疗及新型冠状病毒中和治疗。具体工作如下:(1)具有防污性能和靶向基团保护能力的自抛光聚合物纳米粒子设计本章设计了一种新型的体温敏感自抛光防污α-淀粉酶-淀粉双层包被聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸的纳米粒子,并在其中掺杂靶向基团核酸适配体和光动力治疗药物,制备了自抛光纳米粒子α-ams-SCMMA-TPPOH-Apt NPs。这一类纳米粒子可以在20℃或更低温保存时将靶向基团保护在核内,温度升高至体温(37℃)时,触发外壳水解酶对多糖内壳层的水解,利用自抛光概念实现表面吸附“蛋白质冠”的完全消除,暴露靶向基团,将药物送达至靶向对接部位。自抛光纳米粒子拥有优异的抗蛋白吸附能力和完全无蛋白质冠性能,与此同时,当负载光动力药物和偶联核酸适配体后,在具有高效靶向效率的同时,还能释放单线态氧,达到治疗肿瘤癌症的效果,具有理想的应用前景。(2)具有类新型冠状病毒中和能力的细胞膜包裹聚合物纳米粒子设计本章设计了一种具有类新型冠状病毒中和竞争能力的肺泡上皮细胞膜包裹的聚合物纳米粒子。首先通过高速差速离心提取纯化人II型肺泡上皮细胞膜,随后使用Avanti小型挤出机将细胞膜囊泡与PLGA纳米粒子混合连续挤出制得PLGA NPs@ATII-M,再通过乳液聚合过程制备SCMMA NPs,并偶联S1蛋白模拟新冠病毒SCMMA NPs-S1。PLGA NPs@ATII-M具有良好的抗蛋白吸附能力,与S1蛋白也有非常强的结合能力,能起到很好的病毒中和竞争效果。与传统的疫苗预防或药物治疗相比,本课题设计的病毒中和纳米粒子生产周期短,成本较低并且容易稳定保存,中和竞争能力强,在病毒中和治疗领域具有良好的应用前景。

关键词：纳米药物载体抗蛋白吸附自抛光细胞膜病毒中和

大口黑鲈弹状病毒的分离培养及其卵黄抗体的制备

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渔业科学进展 2020年第3期41卷 151-157页

作者：袁雪梅吕孙建施伟达杭小英刘莉吴颖蕾农业农村部淡水渔业健康养殖重点实验室浙江省鱼类健康与营养重点实验室浙江省淡水水产研究所湖州313001

本研究从爆发性死亡的大口黑鲈(Micropterus salmoides)鱼苗病样中分离培养1株大口黑鲈弹状病毒(M.salmoides rhabdovirus,MSRV)毒株,采用甲醛灭活大口黑鲈弹状病毒,制备佐剂灭活疫苗,免疫产蛋鸡,收集高免蛋,制备MSRV卵黄抗体,测定其效... 详细信息

本研究从爆发性死亡的大口黑鲈(Micropterus salmoides)鱼苗病样中分离培养1株大口黑鲈弹状病毒(M.salmoides rhabdovirus,MSRV)毒株,采用甲醛灭活大口黑鲈弹状病毒,制备佐剂灭活疫苗,免疫产蛋鸡,收集高免蛋,制备MSRV卵黄抗体,测定其效价、中和效果及对病毒复制和宿主细胞内凝集素基因(intelectin)表达的影响。结果显示,成功利用草鱼(Ctenopharyngodon idellus)卵巢细胞株CO细胞分离培养大口黑鲈鱼弹状病毒,并用于佐剂灭活疫苗的制备;MSRV佐剂灭活疫苗免疫蛋鸡,成功获得MRSV的卵黄抗体,效价为1∶256,稀释度为1∶64时的中和病毒的作用最为明显,中和作用率达38.29%以上,病毒核酸拷贝数明显降低。同时,还可上调细胞内凝集素的表达。研究表明,特异性卵黄抗体对大口黑鲈弹状病毒具有明显的中和效果,为后续卵黄抗体作为免疫制剂的应用奠定了基础。

关键词：大口黑鲈弹状病毒卵黄抗体病毒中和

猪圆环病毒2d型Cap蛋白单克隆抗体的研制和表位鉴定

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猪圆环病毒2d型Cap蛋白单克隆抗体的研制和表位鉴定

作者：杨梦师扬州大学

学位级别：硕士

猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）是近年来引起猪圆环病毒病（porcine circovirus associated diseases,PCVAD）的病原,导致猪群免疫抑制,世界各地均有PCV2的暴发与流行。目前猪群中以PCV2b、PCV2d为主要流行基因亚型,... 详细信息

猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）是近年来引起猪圆环病毒病（porcine circovirus associated diseases,PCVAD）的病原,导致猪群免疫抑制,世界各地均有PCV2的暴发与流行。目前猪群中以PCV2b、PCV2d为主要流行基因亚型,尤其是PCV2d呈上升趋势,给养猪业造成了较大经济损失。现有检测抗体主要基于PCV2b和PCV2a两个基因亚型,需要研制PCV2d特异性检测、诊断试剂。研制并获得PCV2d单克隆抗体（monoclonal antibody,MAb）,对PCVAD的诊断和防治具有重要意义。本研究根据实验室保存的猪圆环病毒2d型（PCV2d/Changzhou/JS/20150728 CZ）的衣壳蛋白基因设计一对引物,利用PCR技术扩增出去核定位信号的or.f2基因,并插入原核表达载体质粒pET28a中,构建重组表达载体pET28a-orf2。将重组表达载体导入宿主菌BL21（DE3）中进行诱导表达,经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western-blot检测,初步证明His-rCap蛋白获得了表达,且具有良好的抗原性,通过对His-rCap蛋白表达条件的优化,增加可溶性蛋白的表达量。优化表达的His-rCap重组蛋白,通过Ni-NTA亲和层析介质纯化后免疫6周龄的雌性Balb/c小鼠,三次免疫后,取免疫小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,采用间接ELISA及IFA两种方法同时检测,经过3次亚克隆获得4株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1D9、2C3、3F9、4D11。通过Western-blot对4株单抗特异性进行鉴定,结果显示4株单抗均具有良好的特异性;间接免疫荧光试验（indirect immunofluorescence assay,IFA）检测结果表明,1D9、3F9、4D11 3 株单抗与PCV2d、PCV2b毒株均有反应,1D9、3F9与PCV2d反应性更强,而4D11与PCV2b反应性更强,但2C3无荧光反应性。本研究制备的MAb为抗原表位的鉴定提供了工具,并可用于PCV2d、PCV2b基因亚型病毒的鉴定,为当前PCV2流行病学调查、研究提供可靠制剂。通过逐步截短去除核定位信号肽PCV2d orf2的基因,设计13对特异性引物,成功构建系列截短orf2基因的重组表达质粒。将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,在37℃、IPTG诱导下进行表达。通过对重组大肠杆菌的菌体超声裂解产物进行SDS-PAGE电泳及Western-blot鉴定,表明重组大肠杆菌均能正确表达截短的融合Cap蛋白。将4株单抗与重组的截短Cap蛋白进行Western-blot鉴定,确定单抗1D9、3F9识别Cap蛋白的75NIND78表位,2C3识别900TVPFEY95,4D11识别225NLKDPPLNP233。中和试验结果表明,4株单抗均无中和活性。4株单抗的获得为目前流行的PCV2d、PCV2b的鉴定,以及基于单抗的血清流行病学调查方法的建立提供了可靠、易于标准化的高质量制剂。

关键词：猪圆环病毒2d型单克隆抗体核定位信号肽抗原表位病毒中和

甲型和乙型流感病毒M2离子通道作为抗病毒靶点的研究

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甲型和乙型流感病毒M2离子通道作为抗病毒靶点的研究

作者：徐红卫华东师范大学

学位级别：硕士

为了制备和筛选针对甲型和乙型流感病毒具有广谱和强抗病毒活力的抗体和多肽,我们应用杂交瘤技术分别制备了针对甲型流感病毒M2和乙型流感病毒BM2离子通道的单克隆抗体,同时应用噬菌体展示技术筛选出与乙型流感病毒M2离子通道膜外区高... 详细信息

为了制备和筛选针对甲型和乙型流感病毒具有广谱和强抗病毒活力的抗体和多肽,我们应用杂交瘤技术分别制备了针对甲型流感病毒M2和乙型流感病毒BM2离子通道的单克隆抗体,同时应用噬菌体展示技术筛选出与乙型流感病毒M2离子通道膜外区高特异结合的噬菌体多肽,并分别从细胞水平上研究了它们的抗病毒活性。结果分别筛选到针对甲型和乙型流感病毒M2膜外区N末端8个保守氨基酸序列的单克隆抗体M2e8-7和BM2e-2,其中M2e8-7抗体高特异性结合已知21种甲型流感病毒M2突变型中的19种,是已报道的M2单克隆抗体中识别病毒种类最多的一株抗体。病毒中和实验显示M2e8-7能有效抑制所识别的不同甲型流感病毒突变型在MDCK细胞里的复制。与此类似,BM2e-2抗体有效抑制了不同乙型流感病毒株在MDCK细胞里的复制。此外,还筛选到了能与乙型流感病毒M2膜外区8个保守氨基酸序列高度特异结合的短肽VSFTPSF,其抗病毒活性还有待进一步研究。因此,M2离子通道的独特结构对于抗病毒感染具有重要的作用,本研究所筛选到的针对甲型和乙型流感病毒特异的单克隆抗体和短肽为临床检测和抗病毒药物的开发提供了重要的理论依据。

关键词：流感病毒 M2 单克隆抗体噬菌体展示病毒中和

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修改HIV-1包膜蛋白使病毒更易被中和

传染病网络动态 2001年第8期 9-9页

自然与试验感染的山羊疱疹病毒Ⅰ型特异性IgG的亚类

维普期刊数据库评论

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中国畜牧兽医 2009年第11期36卷 148-148页

作者： Mariarosaria Marinaro 王广秀

本试验利用酶联免疫吸附试验（ELISAs）检测了43只自然感染山羊血清中山羊疱疹病毒Ⅰ型（CpHV-1）特异性免疫球蛋白1（IgG1）与免疫球蛋白2（IgG2）。IgG亚类分析结果表明,山羊阳性血清的二重分布模式,大部分（其中36只）感染山羊阳性... 详细信息

本试验利用酶联免疫吸附试验（ELISAs）检测了43只自然感染山羊血清中山羊疱疹病毒Ⅰ型（CpHV-1）特异性免疫球蛋白1（IgG1）与免疫球蛋白2（IgG2）。IgG亚类分析结果表明,山羊阳性血清的二重分布模式,大部分（其中36只）感染山羊阳性血清中IgG2的水平显著高于IgG1,少部分（其中7只）感染山羊IgG1与IgG2水平相当。

关键词：山羊疱疹病毒Ⅰ型 IgG亚类病毒中和 IgG 山羊免疫

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用ELISA检测鸡IBDV抗原亚型抗体

畜牧兽医科技信息 1998年第5期 5-6页

作者：李凯年

美国D.J.Jackwood等人研制了一种使用在杆状病毒中表达的传染性囊病病毒(IBDV)VP2基因片段的ELISA。将IBDV Del-A株中VP2基因的944bp部分与pAc360转移载体连接并转移入杆状病毒。用斑点印迹杂交鉴定重组的杆状病毒。将表达57-KDa VP2融... 详细信息

美国D.J.Jackwood等人研制了一种使用在杆状病毒中表达的传染性囊病病毒(IBDV)VP2基因片段的ELISA。将IBDV Del-A株中VP2基因的944bp部分与pAc360转移载体连接并转移入杆状病毒。用斑点印迹杂交鉴定重组的杆状病毒。将表达57-KDa VP2融合蛋白的重组杆状病毒9A5免疫沉淀。用这种表达VP2的杆状病毒作为一种ELISA(Osu-ELISA)的抗原。用Osu-

关键词：重组杆状病毒 ELISA检测鸡IBD V抗原传染性囊病病毒斑点印迹杂交抗原性 VP2基因抗体滴度病毒中和