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现代生物医学进展 2012年第36期12卷 7196-7200页

作者：付忠琳马世良袁媛纪颖霍春月沈阳农业大学生物科学技术学院辽宁沈阳110866 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071 首都医科大学燕京医学院北京101300

猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype2,SS2)是一种世界范围内的引起猪链球菌病的重要的人兽共患病原菌,人感染SS2后多呈现败血症型和脑膜炎型。2005年猪链球菌在我国四川省的感染暴发和近年来不断出现的零散病例给我国的公共卫生... 详细信息

猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype2,SS2)是一种世界范围内的引起猪链球菌病的重要的人兽共患病原菌,人感染SS2后多呈现败血症型和脑膜炎型。2005年猪链球菌在我国四川省的感染暴发和近年来不断出现的零散病例给我国的公共卫生和食品安全带来了威胁,但迄今为止,对SS2致病机制研究尚不够深入。SS2的致病过程和宿主细胞相互作用密切相关,SS2-体外宿主细胞相互作用模型的建立对于揭示SS2致病分子机理具有重要的意义。目前的研究报道主要是从猪链球菌黏附与侵袭上皮细胞或内皮细胞、猪链球菌抗吞噬细胞的吞噬和猪链球菌激活免疫细胞炎症反应方面研究猪链球菌与宿主细胞的相互作用,但与其他常致病性链球菌如化脓性链球菌和肺炎链球菌相比,有些SS2-体外宿主细胞相互作用模型还缺乏统一的标准,由于感染模型的实验参数不尽相同得到结果也有所不同。本文对近年来猪链球菌2型与宿主细胞体外相互作用及其致病机理研究进展作一综述。

关键词：猪链球菌2型(SS2) 病原菌-宿主相互作用黏附与侵袭炎症

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胞内劳森菌鞭毛素蛋白FliC与猪肠上皮细胞互作蛋白的研究

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中国预防兽医学报 2021年第12期43卷 1324-1329页

作者：于振兴张兰桥杨莹莹张锦华何后军戴益民江西农业大学动物科学技术学院江西南昌330045 江西农业大学生物科学与工程学院江西南昌330045

为鉴定胞内劳森菌鞭毛蛋白FliC与猪肠上皮细胞中的互作蛋白,本研究利用PCR方法从回肠炎疫苗提取的DNA中扩增胞内劳森菌鞭毛素基因LI0710,并将其克隆至原核表达载体pET32a(+)中构建重组质粒pET32aLI0710,经双酶切及测序鉴定正确后转化大... 详细信息

为鉴定胞内劳森菌鞭毛蛋白FliC与猪肠上皮细胞中的互作蛋白,本研究利用PCR方法从回肠炎疫苗提取的DNA中扩增胞内劳森菌鞭毛素基因LI0710,并将其克隆至原核表达载体pET32a(+)中构建重组质粒pET32aLI0710,经双酶切及测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导并经SDS-PAGE检测。结果显示,获得可溶且与硫氧还蛋白-6×His-S标签(Trx-His-S)融合表达的重组FliC蛋白(Trx-His-S-FliC)。采用镍柱亲和层析法纯化Trx-His-S和Trx-His-S-FliC,并分别与猪肠上皮细胞(IPEC-J2)裂解液孵育后,利用anti-His抗体进行免疫共沉淀试验(Co-IP),并对沉淀物利用液质联用串联质谱(LC/MS/MS)技术分析与FliC互作的宿主蛋白,利用Proteome Discoverer 1.4软件在UniProtKB/Swiss-Prot数据库中对互作的宿主蛋白进行肽指纹图谱分析。Co-IP结果显示,检测到了多个与Trx-His-S-FliC互作的宿主蛋白,且通过LC/MS/MS技术共鉴定到50个与FliC互作的蛋白。这些互作蛋白包括蛋白酶、多个核糖体蛋白和线粒体蛋白,广泛参与了细胞质糖酵解、氨基酸代谢、ATP跨膜转运等功能。为了证明质谱数据的可靠性,选择与FliC互作最强的胰蛋白酶经western blot验证,结果显示,胰蛋白酶与FliC蛋白确实存在互作,表明质谱数据可靠。本研究首次鉴定到多个与胞内劳森菌鞭毛蛋白FliC互作的宿主蛋白,为研究FliC蛋白的功能奠定了基础。

关键词：增生性肠炎胞内劳森菌鞭毛素蛋白FliC 免疫共沉淀病原菌-宿主相互作用

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调控宿主自噬过程的结核分枝杆菌效应蛋白的筛选与验证

调控宿主自噬过程的结核分枝杆菌效应蛋白的筛选与验证

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作者：赵听听吉林大学

学位级别：硕士

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)是一种典型的兼性胞内菌,具有很强的致病性和感染性。在长期与宿主的免疫系统对抗和斗争的过程中,Mtb进化出一系列策略得以逃逸宿主的免疫防御功能,进而长期潜伏在被感染的宿主细胞内。据2... 详细信息

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)是一种典型的兼性胞内菌,具有很强的致病性和感染性。在长期与宿主的免疫系统对抗和斗争的过程中,Mtb进化出一系列策略得以逃逸宿主的免疫防御功能,进而长期潜伏在被感染的宿主细胞内。据2020年WHO(World Health Organization)发布的《全球结核病报告》显示,2019年全球约有1000万新发结核病患者,超过140万患者死于结核病。因此,结核病至今仍是全球危害性极大、致死率很高的传染病杀手。异源自噬(Xenophagy)是真核生物中可以靶向清除宿主感染的病原微生物的一种选择性自噬(selective autophagy)过程。当Mtb感染宿主后,宿主巨噬细胞率先发挥其吞噬功能将Mtb包裹吞噬形成吞噬体。吞噬体内的Mtb可以破坏吞噬体细胞膜进而逃逸进入细胞质,继而通过激活多种信号通路而诱发宿主自噬的发生,此时巨噬细胞胞质中快速形成双层膜结构的自噬前体(phagophore)再次包裹Mtb病原菌形成异源自噬体,其进一步与溶酶体(lysosome)发生融合后将Mtb降解清除。然而Mtb已经进化出一系列策略干扰宿主自噬流从而实现自身在宿主中的潜伏存活。因此,Mtb与宿主免疫系统间的相互作用决定结核病的发生、发展和转归。宿主异源自噬的触发以及通畅的自噬流是宿主清除胞内Mtb的关键,也是研究宿主抗Mtb感染分子机制的重要切入点。相反,从Mtb致病性角度考量,在感染过程中调控宿主异源自噬实现免疫逃逸的Mtb关键效应蛋白则是结核病药物开发的潜在靶点。综上,我们拟以宿主自噬流作为评估标准,筛选在Mtb感染宿主过程中调控宿主细胞自噬通路的关键效应蛋白。LC3是经典的自噬流标志蛋白,我们可以通过高通量筛选的方法检测LC3斑点的颜色(红、绿、黄)及比例来分析宿主自噬流水平。我们首先构建了用于指示细胞自噬水平的巨噬细胞模型,即包装带有RFP-GFP-LC3基因片段的pll3.7慢病毒去侵染Raw264.7小鼠巨噬细胞株,进一步筛选得到稳定表达RFP-GFP-LC3的Raw264.7细胞。接下来通过EBSS饥饿诱导和rapamycin刺激自噬的方式进行预实验,结果显示,稳定表达双荧光标签的RFP-GFP-LC3巨噬细胞模型能够很好指示自噬发生的情况。其次我们构建了BCG基因随机突变文库,用于感染上述巨噬细胞自噬流检测模型。最后通过流式细胞术筛选出一系列参与宿主自噬流调控的候选Mtb候选效应蛋白。通过细胞水平的验证实验,我们筛选到一株BCG突变菌(其中的Rv1375蛋白编码基因失活)感染后的巨噬细胞自噬发生水平低于野生BCG感染细胞。进一步通过验证证实Rv1375效应蛋白在Mtb感染宿主过程中可以促进自噬的发生。

关键词：结核分枝杆菌分枝杆菌突变文库病原菌-宿主相互作用异源自噬效应蛋白

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斜带石斑鱼感染变形假单胞菌的脂质组学研究

斜带石斑鱼感染变形假单胞菌的脂质组学研究

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作者：钟月集美大学

学位级别：硕士

变形假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida,***）分布广泛,可引起大黄鱼、斜带石斑鱼等海洋经济鱼类的内脏白点病,导致养殖鱼类在短期内大量死亡,造成严重经济损失。已有研究表明clp V基因是该菌感染过程中的关键毒力基因。然而,病原... 详细信息

变形假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida,***）分布广泛,可引起大黄鱼、斜带石斑鱼等海洋经济鱼类的内脏白点病,导致养殖鱼类在短期内大量死亡,造成严重经济损失。已有研究表明clp V基因是该菌感染过程中的关键毒力基因。然而,病原菌和宿主之间的复杂相互作用涉及大量生理动态变化,其机制目前尚不明确。二者互作的解析对于理解宿主的抗感染能力以及病原菌的致病机理至关重要。针对上述问题,本论文构建斜带石斑鱼感染变形假单胞菌模型,基于超高效液相色谱-质谱（UPLC-MS）联用开展非靶向脂质组学研究。研究中采用与宿主表型密切相关的脂质代谢谱,表征不同类型病菌（野生型与clp V毒力基因沉默型）感染后宿主的脂代谢变化,探讨潜在的病原菌-宿主相互作用机制,并寻找潜在标志物,为养殖鱼类内脏白点病的防治应用提供理论依据。本论文主要工作如下:一、斜带石斑鱼脾脏组织的脂质结构鉴定。基于UPLC-MS的脂质组学分析,结合色谱保留行为和脂质图谱数据库,对斜带石斑鱼感染变形假单胞菌后的脾脏组织进行结构鉴定。共准确鉴定568个脂质代谢物,涉及51种鞘磷脂（12 Cer,9 Cer G1,30 SM）,245种甘油磷脂（23 LPC,6 LPC O/P-,68 PC,45 PC O/P-,9 LPE,29 PE,15 PE e/p-,11 PG,24 PI,14 PS,1 PA）,204种甘油脂（1 MG,33 DG,167 TG,3 TG O/P-）,41种FA和13种OAHFA,14种CL。本章对石斑鱼靶器官中脂质组结构的全面解析为后续互作机制的研究奠定了基础。二、变形假单胞菌与斜带石斑鱼互作过程的脂质组学研究及标志物筛选。构建分别感染野生型（WT）、clp V毒力基因沉默型（clp V-RNAi）菌株,以及空白对照（PBS）的斜带石斑鱼模型,采集感染后不同时间点的靶器官脾脏样本。综合表型症状观测、组织病理学结果及脂质组学分析考察病原菌与宿主的相互作用及毒力基因沉默的影响。结果表明:1.脂质代谢谱多变量分析揭示,野生菌株感染可引起显著的脂代谢扰动,clp V基因沉默对菌株感染产生的代谢扰动具有回调作用。与PBS组及clp V-RNAi组相比,WT组的脂质谱显示出更为明显的随感染进程而扰动增大的趋势。脂质代谢谱分析结果与石斑鱼表型及组织病理学检测结果相符合,均表明与WT组相比,注射clp V-RNAi菌株的斜带石斑鱼在死亡率和脾脏白点症状方面具有显著改善。***组分别与PBS及clp V-RNAi组的比较中,分别筛选获取187和262种典型差异脂质。大部分差异脂质在WT中呈现明显上调趋势,其中鞘脂类（SM＆Cers＆Cer Gs）及磷脂类几乎均呈现上调趋势,但大部分的PIs和PSs呈明显下调趋势。富集分析表明所揭示的脂质代谢扰动主要体现于膜组件及内质网。clp V-RNAi组体现了与PBS组较为相似的脂质变化模式。宿主石斑鱼与病原菌相互作用过程中,以磷脂酰肌醇、神经酰胺以及脂肪酸代谢途径为代表的显著紊乱,与病原菌对宿主细胞免疫系统的干扰密切关联。3.研究筛选了表征宿主感染效应的潜在脂质标志物Cer G1（32:1;2）及LPE（16:1）。两者联合使用用于野生型菌株感染判别,所得判别曲线下面积（AUC）值为0.89,敏感性和特异性均大于80%。同时,筛选了表征clp V毒力基因沉默效应的宿主脂质标志物LPE（18:2）、OAHFA（38:3）和PI（39:4）,联合使用所得AUC值为0.996,灵敏度与特异性均大于95%。进一步构建用于判别的二元逻辑回归方程模型,并计算“判别可能性”P值（Probability）,用于指导实践中判别标志物应用。本论文从脂质组学研究角度,有助于阐明变形假单胞菌与宿主互作的复杂机制,并为毒力基因clp V研究提供了新视角,同时构建判别模型应用于实践中斜带石斑鱼内脏白点病相关诊断,提供了脂类代谢物的联合应用的新途径。

关键词：脂质组学变形假单胞菌斜带石斑鱼鱼类内脏白点病病原菌-宿主相互作用

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