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病原相关分子模式体外对表皮细胞和皮脂腺细胞分化影响的研究

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病原相关分子模式体外对表皮细胞和皮脂腺细胞分化影响的研究

作者：李昕上海交通大学

学位级别：硕士

第一部分病原相关分子模式对表皮细胞增殖与分化的影响背景:皮肤是保护人体的第一道屏障,皮肤微生物作为皮肤组成的一部分,对皮肤的结构和生理至关重要。微生物有促进皮肤自我调节的作用,但具体机制不清。本部分分别采用人角质形成细胞H... 详细信息

第一部分病原相关分子模式对表皮细胞增殖与分化的影响背景:皮肤是保护人体的第一道屏障,皮肤微生物作为皮肤组成的一部分,对皮肤的结构和生理至关重要。微生物有促进皮肤自我调节的作用,但具体机制不清。本部分分别采用人角质形成细胞Ha Ca T和离体3D皮肤皮脂腺模型,研究病原相关分子模式（Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs）体外对人表皮细胞增殖与分化的影响,探究皮肤微生物对皮肤生理病理功能的影响。方法:人永生化Ha Ca T角质形成细胞,采用免疫印迹法（Western-blot）检测脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）5 mg/ml,磷壁酸（Lipoteichoic acid,LTA）5 mg/ml和肽聚糖（Peptidoglycan,PGN）10 mg/ml刺激后,外膜蛋白（Involucrin,IVL）、兜甲蛋白（Loricrin,LOR）的表达水平;采用人皮肤和永生化SZ95皮脂腺细胞体外共培养的3D皮肤皮脂腺培养模型,分别加入2、20、200μg/ml的LPS,LTA,PGN。培养7天后,使用Photo Shop软件计算苏木素-伊红（Hematoxylin and Eosin,HE）染色切片中表皮面积;免疫组化观察细胞增殖核抗原Ki67,角蛋白10（Cytokeratin 10,CK10）的表达,使用Image J软件计算染色面积,Image-Pro Plus软件计算每张图片的每个蛋白的累积光密度（Integrated optical density,IOD）。结果:LPS,LTA,PGN能促进人角质形成细胞IVL和LOR的表达。在3D皮肤皮脂腺模型上,表皮增厚分别在200μg/ml浓度的LPS、LTA和20μg/ml浓度的PGN达到最大值。LPS和LTA在200μg/ml时表皮厚度高于其他两个实验浓度（P＜0.01）;PGN在20μg/ml浓度时表皮增厚高于2μg/ml（P＜0.001）,与200μg/ml浓度时表皮增厚比较无统计学差异;表皮基底层及角质层细胞Ki67及CK10的表达也呈现不同程度的增加。结论:PAMPs体外剂量依赖性促进表皮细胞的增殖与分化,这暗示皮肤微生物群可能参与了皮肤表皮与屏障的形成。第二部分病原相关分子模式对3D皮肤皮脂腺模型皮脂腺脂质分泌的影响背景:前面我们探究了皮肤微生物PAMPs对表皮细胞增殖和分化的作用,本部分我们进一步探讨PAMPs体外对人皮脂腺细胞分化和脂质合成的作用,评估微生物对皮脂腺细胞形态和功能的影响。方法:在体外3D皮肤皮脂腺模型上,分别加入不同浓度的PAMPs（2、20、200μg/ml的LPS,LTA和PGN）。培养7d后,使用HE染色观察毛囊皮脂腺结构形态的变化;使用冰冻切片油红染色观察在不同浓度的LPS,LTA和PGN刺激下,皮脂腺细胞脂质分泌情况;使用Image J软件计算每张切片中皮脂腺油红染色面积,以及Image-Pro Plus软件计算皮脂腺油红染色的IOD值。结果:在2μg/ml浓度LPS,LTA,PGN作用下,各实验组皮脂腺皮脂分泌增多（P＜0.05）;当刺激浓度加大为20μg/ml时,皮脂腺体积缩小,脂质分泌减少（P＜0.05）;当刺激浓度进一步加大为200μg/ml时,皮脂腺萎缩明显,且脂质分泌进一步减少（P＜0.01）,在HE染色切片中可观察到皮脂腺毛囊发生异常角化。结论:PAMPs可以调节皮脂腺分化与脂质合成。这可能是皮脂腺进行自我调节的机制之一。

关键词： HaCaT细胞 3D皮肤皮脂腺模型病原相关分子模式表皮增殖分化 PAMPs 皮脂腺细胞脂质合成

病原相关分子模式和损伤相关分子模式在免疫炎症反应中的作用

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国际口腔医学杂志 2016年第2期43卷 172-176页

作者：丁烨任静宜于洪强周延民于维先吉林大学口腔医院种植中心吉林省牙发育及颌骨重塑与再生省重点实验室长春130021

病原相关分子模式(PAMP)和损伤相关分子模式(DAMP)是与免疫学息息相关的两个分子。DAMP是组织或细胞受到损伤和低氧等因素刺激后释放到细胞间或血液循环中的一类物质;PAMP则是病原体上的分子结构。两者均被模式识别受体(PRR)识别引起免... 详细信息

病原相关分子模式(PAMP)和损伤相关分子模式(DAMP)是与免疫学息息相关的两个分子。DAMP是组织或细胞受到损伤和低氧等因素刺激后释放到细胞间或血液循环中的一类物质;PAMP则是病原体上的分子结构。两者均被模式识别受体(PRR)识别引起免疫应答。目前,已经有研究表明,DAMP和PAMP与慢性炎症疾病和自身免疫性疾病有关。本文就PAMP和DAMP分子在免疫炎症反应中的作用作一综述。

关键词：病原相关分子模式损伤相关分子模式模式识别受体免疫炎症反应

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寄生虫病原相关分子模式的研究进展

中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2013年第3期31卷 238-241页

作者：杨庆利申继清广西壮族自治区疾病预防控制中心寄生虫病防制所南宁530028 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室世界卫生组织疟疾、血吸虫病和丝虫病合作中心上海200025 广西医科大学寄生虫学教研室南宁530021

随着对传统病原微生物的病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)认识的深入,发现寄生虫PAMPs存在的线索。寄生虫PAMPs在分子结构、与受体的结合方式、胞内信号转导途径和诱导效应等方面与传统PAMPs均有所差异... 详细信息

随着对传统病原微生物的病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)认识的深入,发现寄生虫PAMPs存在的线索。寄生虫PAMPs在分子结构、与受体的结合方式、胞内信号转导途径和诱导效应等方面与传统PAMPs均有所差异。本文从上述方面综述了寄生虫PAMPs的研究进展。

关键词：寄生虫病原相关分子模式模式识别受体天然免疫

PCV2抑制病原相关分子模式诱导猪肺泡巨噬细胞表达IL-12p40的分子...

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作者：杨雪枫西北农林科技大学

学位级别：硕士

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)是猪圆环病毒相关疾病(porcine circovirus associated disease,PCVAD)的主要病原。临床发现PCV2感染的仔猪常伴随其他病原的共同感染,但PCV2感染动物对多种病原易感的免疫机制尚不清楚... 详细信息

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)是猪圆环病毒相关疾病(porcine circovirus associated disease,PCVAD)的主要病原。临床发现PCV2感染的仔猪常伴随其他病原的共同感染,但PCV2感染动物对多种病原易感的免疫机制尚不清楚。作为一种重要的促炎性细胞因子,白细胞介素-12(interleukin-12,IL-12)在机体抵抗病原微生物感染的过程中发挥着至关重要的作用。IL-12p40在PCV2感染仔猪脾脏和淋巴结等器官中的表达能力显著下调,接种PCV2的仔猪肺泡巨噬细胞IL-12p40的表达能力亦降低。但PCV2感染仔猪后通过何种机制导致免疫器官中IL-12p40表达受到抑制,目前并不清楚。本试验拟将PCV1、PCV2的Rep、Cap蛋白互换,构建PCV1-Rep2、PCV1-Cap2、PCV2-Rep1和PCV2-Cap1四种突变毒株,将其分别转染PK-15细胞后,连续传代5次,获得4株PCV突变毒株,为后续研究提供材料。之后检测Mock、PCV1和PCV2感染的猪肺泡巨噬细胞中LPS/IFN-γ或LPS/R848诱导IL-12p40表达的水平,再通过表达PCV2 Rep和Cap的重组腺病毒以及PCV突变毒株感染猪肺泡巨噬细胞,明确PCV2抑制IL-12p40表达的关键组分,确定参与PCV2感染抑制细胞中IL-12p40表达的关键信号通路和miRNAs,明确PCV2感染抑制病原相关分子模式诱导猪肺泡巨噬细胞IL-12p40表达的分子机制,为进一步阐明PCV2感染导致的免疫抑制机制提供理论依据。研究取得如下结果。1.通过嵌合载体构建方法,将PCV1的Rep1和Cap1分别替换为PCV2的Rep2和Cap2;将PCV2的Rep2和Cap2分别替换为PCV1的Rep1和Cap1,成功构建了PCV1-Rep2、PCV2-Cap1、PCV1-Cap2和PCV2-Rep1四种PCV的突变毒株。2.分别用Mock、PCV1、PCV2体内或体外感染猪肺泡巨噬细胞后,LPS/IFN-γ或LPS/R848刺激细胞,ELISA和Q-PCR检测IL-12p40表达水平,结果显示,与Mock或PCV1感染组相比,PCV2体内或体外感染猪肺泡巨噬细胞能显著抑制由LPS/IFN-γ或LPS/R848诱导的IL-12p40表达。3.分别用表达PCV2 Rep、Cap的重组腺病毒rAd-Rep、rAd-Cap感染猪肺泡巨噬细胞,再以LPS/IFN-γ或LPS/R848刺激猪肺泡巨噬细胞,结果显示,Rep和Cap在细胞水平均可显著抑制由LPS/IFN-γ或LPS/R848诱导的IL-12p40表达,但相对于Rep,Cap蛋白抑制作用更显著;同时,以PCV或PCV突变毒株感染猪肺泡巨噬细胞,结果显示突变体PCV1-Cap2和PCV2-Rep1感染后显著抑制了由LPS/IFN-γ和LPS/R848诱导的IL-12p40表达。此结果说明,相对于Rep蛋白,PCV2的Cap蛋白更强烈地抑制IL-12p40表达。4.PCV2分别感染野生型(gC1qR)和gC1qR基因敲除(gC1qR)猪肺泡巨噬细胞,Mock组显示gC1qR基因缺失未影响LPS/IFN-γ或LPS/R848诱导的IL-12p40的表达。PCV2感染gC1qR基因敲除(gC1qR)猪肺泡巨噬细胞,LPS/IFN-γ或LPS/R848诱导的IL-12p40的表达未被显著抑制,表明gC1qR参与PCV2抑制IL-12p40产生的过程。5.分别用Akt1、p38 MAPK和ERK1特异性siRNA转染细胞,感染PCV2后再以LPS/IFN-γ或LPS/R848刺激,结果显示,在转染Akt1和p38 MAPK特异性siRNA的细胞中,PCV2对IL-12p40的抑制作用被显著降低,而转染ERK1特异性siRNA的细胞中,IL-12p40的表达未见显著变化。6.PCV2感染的猪肺泡巨噬细胞,Q-PCR检测可能参与调控猪IL-12p40表达的mi RNA,结果显示在PCV2感染的PAMs中,miR-23a、miR-23b、miR-29a和miR-29b显著上调。重组腺病毒rAd-Cap可以上调这些miRNA表达,而rAd-Rep不能,同时gC1qR基因敲除(gC1qR)的猪肺泡巨噬细胞中这些miRNA的上调被抑制,抑制Akt1的细胞中PCV2诱导的miR-23a、mi R-23b和miR-29b的表达被抑制,抑制p38 MAPK的细胞中PCV2诱导的miR-29a和mi R-29b的表达被抑制,此外,抑制ERK1对PCV2诱导的mi R-23a、mi R-23b、miR-29a和miR-29b上调无显著影响。7.分别用mi R-23a、miR-23b、mi R-29a和miR-29b的mimics或特异性抑制剂处理细胞,PCV2感染后

关键词：猪圆环病毒2型猪肺泡巨噬细胞病原相关分子模式白细胞介素12p40 信号通路 miRNA

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病毒的病原相关分子模式研究进展

国际病毒学杂志 2009年第2期16卷 61-64页

作者：杨庆利(综述) 韦平(审校) 广西大学生命科学与技术学院南宁530004 广西壮族自治区疾病预防控制中心免疫预防管理科南宁500021

病毒的病原相关分子模式主要指能够刺激特定Toll样受体的病毒核酸以及蛋白产物，二者通过活化相应的信号转导途径，分别诱导产生Ⅰ型干扰素或前炎症反应细胞因子和趋化因子，可促进宿主抗病毒免疫应答或诱发致病性炎症反应。

关键词：病原相关分子模式 Toll样受体 Ⅰ型干扰素前炎症反应细胞因子

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Toll样受体与病原相关分子模式

上海免疫学杂志 2001年第4期21卷 195-198页

作者：富宁第一军医大学免疫学教研室广州510515

乳动物天然免疫分子Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)的发现是源于对果蝇Toll(dToll)蛋白的研究.不具备获得性免疫系统的果蝇正是依赖这种Toll蛋白抵御细菌与真菌的感染,而哺乳动物的TLRs则是dToll的同源蛋白.这两类蛋白均属于模... 详细信息

乳动物天然免疫分子Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)的发现是源于对果蝇Toll(dToll)蛋白的研究.不具备获得性免疫系统的果蝇正是依赖这种Toll蛋白抵御细菌与真菌的感染,而哺乳动物的TLRs则是dToll的同源蛋白.这两类蛋白均属于模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR),在识别和抵御各种病原微生物及其产物中发挥重要作用.

关键词： Toll样受体病原相关分子模式生物学活性细胞凋亡抗凋亡活性

不同病原性相关分子模式对大黄鱼头肾巨噬细胞免疫功能的影响

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热带生物学报 2020年第3期11卷 274-280页

作者：刘肖岑周永灿曹贞洁孙云海南大学海南省南海海洋资源利用国家重点实验室/海南省热带水生生物技术重点实验室海口570228 海南大学海洋学院水产养殖系海口570228

为研究不同病原性相关分子模式(PAMP)对大黄鱼头肾巨噬细胞免疫功能的影响,本研究分别将脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、肽聚糖(peptidoglycan,PGN)、脂磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA)、胞壁酰二肽(muramyl dipeptide,MDP)与提取的大黄鱼头肾巨噬细胞进行孵育,测定大黄鱼头肾巨噬细胞的呼吸爆发活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、溶菌酶(LZM)活性和免疫相关细胞炎症因子(TNFα,IL1β,IL8,IL10,CXCL9,MYD88,TLR3和TLR8)的表达情况。结果显示:(1)LPS,PGN,LTA,MDP均能显著提高大黄鱼头肾巨噬细胞的呼吸爆发活性和LZM活性,同时显著降低SOD和CAT两种抗氧化酶的活性;(2)在LPS和LTA刺激下,8种免疫相关细胞炎症因子TNFα,IL1β,IL8,IL10,CXCL9,MYD88,TLR3和TLR8均呈显著性上调趋势;在PGN和MDP刺激下,除IL8,CXCL9外,其余6种免疫相关细胞炎症因子均显著性上调。结果表明,4种病原相关分子模式LPS,PGN,LTA,MDP均能显著影响大黄鱼头肾巨噬细胞的非特异性免疫应答能力和免疫相关细胞炎症因子的表达。

关键词：大黄鱼巨噬细胞病原相关分子模式非特异性免疫细胞因子

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损伤相关分子模式与炎症反应

中国危重病急救医学 2009年第9期21卷 566-569页

作者：栾正刚(综述) 马晓春(审校) 中国医科大学附属第一医院重症医学科辽宁沈阳110001

为辨别自身细胞的存活或识别微生物的入侵，多细胞动物已经进化出免疫监视、防御、修复机制。然而，目前仍不完全清楚这些机制是如何启动和协调配合的。因此，我们对相关基础研究和医疗研究现状做一个综述。

关键词：损伤相关分子模式病原相关分子模式 Alarmins 炎症免疫

华支睾吸虫高迁移率族蛋白1同源蛋白的表达及其对小鼠巨噬细胞核转录因子-κB活化作用

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2022年第3期40卷 305-308页

作者：王婷杨庆利冷静李宝莹申继清戴悦广西中医药大学广西高发传染病中西医结合转化医学重点实验室南宁530200

根据华支睾吸虫死亡细胞释放的高迁移率族蛋白1(CsHMGB1)同源分子编码序列构建pET-28a(+)表达质粒并转化至Rosetta(DE3)感受态细胞,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导CsHMGB1-His融合蛋白表达;Ni-TED琼脂糖树脂纯化蛋白后,蛋白质免疫... 详细信息

根据华支睾吸虫死亡细胞释放的高迁移率族蛋白1(CsHMGB1)同源分子编码序列构建pET-28a(+)表达质粒并转化至Rosetta(DE3)感受态细胞,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导CsHMGB1-His融合蛋白表达;Ni-TED琼脂糖树脂纯化蛋白后,蛋白质免疫印迹(Westernblotting)分析鉴定His标签融合蛋白表达情况。用含不同浓度(1μg/ml和10μg/ml)CsHMGB1-159/127的培养液与小鼠巨噬细胞RAW264.7共培养,同时设立无刺激物的空白对照组,培养24h和48h。用pNiFty2-SEAP质粒和HEK-Blue^(TM)培养基检测SEAP活性代表核转录因子-κB(NF-κB)活化,用酶标仪检测培养上清吸光度(A_(620)值),并在显微镜下观察细胞内蓝色显色反应。结果显示,分别表达出编码159和127个氨基酸的CsHMGB1-159/127蛋白,相对分子质量(M_(r))约为23500和20000。1和10μg/mlCsHMGB1-159蛋白刺激小鼠巨噬细胞24h后的A_(620)值分别为0.66±0.08和0.65±0.03,均高于对照组(0.29±0.02)(t=11.1、28.5,P<0.01),且胞浆均出现明显蓝色;48h后的A_(620)值分别达1.02±0.08和1.07±0.08,均高于对照组(0.62±0.035)(t=11.2、12.9,P<0.01),且胞浆蓝色加深。用1和10μg/mlCsHMGB1-127蛋白刺激24h后的A_(620)值分别为0.52±0.08和0.56±0.08,均高于对照组(t=7.39、8.37,P<0.01),胞浆也出现明显蓝色;48h后的A_(620)值分别达到1.10±0.05和0.90±0.10,均高于对照组(t=20.30、6.26,P<0.01),胞浆蓝色也明显加深。1和10μg/mlCsHMGB1-159蛋白刺激24h后的A_(620)值高于相应浓度的CsHMGB1-127蛋白(t=2.98、2.75,P<0.05);48h后两种蛋白的A_(620)值的差异有统计学意义(t=-2.07,P<0.01;t=3.40,P<0.05)。CsHMGB1-159比CsHMGB1-127蛋白在体外均能够刺激小鼠巨噬细胞NF-κB活化,CsHMGB1-159比CsHMGB1-127蛋白的作用更强。

关键词：华支睾吸虫高迁移率族蛋白1 病原相关分子模式核转录因子-κB