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桔小实蝇肽聚糖识别蛋白基因鉴定与功能分析

桔小实蝇肽聚糖识别蛋白基因鉴定与功能分析

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作者：王哲西南大学

学位级别：硕士

先天免疫系统是昆虫抵御病原物入侵的主要防御系统,昆虫先天免疫包括体液免疫和细胞免疫。体液免疫主要以产生抗菌肽、凝集素、溶菌酶和蛋白酶抑制剂等方式发挥作用,而细胞免疫则是通过细胞吞噬和包被发挥作用。昆虫先天免疫系统主要依... 详细信息

先天免疫系统是昆虫抵御病原物入侵的主要防御系统,昆虫先天免疫包括体液免疫和细胞免疫。体液免疫主要以产生抗菌肽、凝集素、溶菌酶和蛋白酶抑制剂等方式发挥作用,而细胞免疫则是通过细胞吞噬和包被发挥作用。昆虫先天免疫系统主要依赖Toll和Imd两个信号通路行使功能。Toll信号通路主要参与对革兰氏阳性细菌的免疫过程,而Imd则主要参与对革兰氏阴性细菌的免疫过程。肽聚糖识别蛋白(Peptidoglycan Recognition Proteins,PGRPs)在这两个免疫通路中有着至关重要的作用,是昆虫免疫系统中的第一道防线。对PGRPs的研究有助于进一步了解昆虫的免疫反应过程,能够为基于免疫信号通路的害虫防控技术的研究提供基础数据。本学位论文以果蔬重要害虫桔小实蝇(Bactrocera dorsalis)为研究对象,利用基因组和转录组数据库对桔小实蝇PGRPs进行全面挖掘和鉴定;利用荧光定量PCR技术,分析PGRPs在桔小实蝇不同发育阶段的表达模式;采用显微注射和RT-qPCR技术,检测病原物诱导后PGRPs的表达变化;最后利用RNAi技术,干扰PGRP-LC并测定桔小实蝇对细菌敏感性的变化,初步发现了PGRP-LC在桔小实蝇免疫中的功能。本研究旨在为深入开展桔小实蝇PGRPs研究奠定基础。主要研究结果如下:1.桔小实蝇PGRPs的鉴定与序列分析基于桔小实蝇基因数据库和转录组数据,鉴定了12个桔小实蝇PGRPs。其中,有5条PGRPs基因存在可变剪切现象,PGRP-LA、PGRP-LB、PGRP-LC、PGRP-LD、PGRP-SC分别有2个、2个、4个、3个和2个剪切子。尤以PGRP-LC的剪切方式最为复杂。系统发育分析结果发现,桔小实蝇PGRPs与橄榄实蝇和地中海实蝇PGRPs亲缘关系最近。对桔小实蝇PGRPs功能域C端氨基酸比对,发现多个保守的氨基酸残基,推测PGRP-LB、-SB1/2、-SC2、-SC2b、-NSB1和-SC等都具有酰胺酶活性;除PGRP-SA、PGRP-SCb和PGRP-NSC2外,其它PGRPs均含有Arg位点,可能参与对二氨基庚二酸型肽聚糖(Pepridoglycan from Gram-negative bacteria,DAP-PGN)的识别。2.桔小实蝇PGRPs不同发育阶段的表达模式桔小实蝇PGRPs在不同发育阶段的mRNA表达水平存在差异,表明在桔小实蝇生长过程中发挥的功能不同。其中,PGRP-LA、PGRP-LB和PGRP-LC在桔小实蝇整个变态过程中均高量表达,而PGRP-LE、PGRP-SB1/2和PGRP-SC2/2b均在幼虫期和成虫期高表达。结合对果蝇PGRP-SC2的研究结果,推测桔小实蝇PGRP-SC2和PGRP-SC2b可能对肠道微生物具有调控作用。PGRP-SA在桔小实蝇各个发育阶段均有表达,PGRP-SD主要在成虫期高表达,而PGRP-SCa的表达无明显规律。3.桔小实蝇PGRPs在病原因子诱导后的表达变化利用显微注射和荧光定量PCR技术,分析桔小实蝇PGRPs在***、PGN-EB(Pepridoglycan from *** O111:B4)和PGN-SA(Pepridoglycan from Staphylococcus aureus)诱导后表达变化。结果显示,在注射***和PGN-EB后,PGRP-LAa、PGRP-LB、PGRP-SC2和PGRP-SC2b表达受到抑制,推测这些基因在桔小实蝇体内可能是Imd信号通路的负调控因子;而PGRP-LE表达上调,推测PGRP-LE可能参与对革兰氏阴性细菌的识别。在注射PGN-SA后,PGRP-LE的表达受到抑制,推测PGRP-LE可能不参与对PGN-SA的识别。PGRP-SA、PGRP-SD、PGRP-SB1和PGRP-SB2的表达在注射病原物诱导后均上调,说明它们可能参与到对两类细菌的识别过程。4.桔小实蝇PGRP-LC的功能分析采用荧光定量PCR技术分析桔小实蝇PGRP-LC的4个剪切子在不同组织中表达模式,结果发现这4个剪切子主要在成虫中肠和脂肪体高水平表达。饲喂抗生素后,桔小实蝇PGRP-LCa、PGRP-LCb和PGRP-LCc的表达量发生显著变化,其中PGRP-LCa表达显著下调,PGRP-LCb和PGRP-LCc的表达则显著上调,PGRP-LCd的表达没发生显著变化。4个剪切子均在***和PGN-EB诱导后显著上调,尤其以PGRP-LCd上调的倍数最高。在白僵菌诱导后,PGRP-LCc和PGRP-LCd显著下调;在PGN-SA诱导后,PGRP-LCb和PGRP-LCd显著下调。不同的剪切子表达量的变化说明各自参与的免疫过程存在差异,其中PGRP-LCa参与的免疫过程更广泛,PGRP-L

关键词：桔小实蝇肽聚糖识别蛋白发育阶段病原物诱导免疫 Imd信号通路

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橘小实蝇中肽聚糖识别蛋白PGRP-LC基因结构及其功能分析

橘小实蝇中肽聚糖识别蛋白PGRP-LC基因结构及其功能分析

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中国植物保护学会2016年学术年会

作者：王哲魏冬牛金志王进军西南大学植物保护学院昆虫学及害虫控制工程重点实验室

橘小实蝇(Bactrocera dorsalis)是一种重要的世界性果蔬害虫,也是一种重要柑橘害虫。肽聚糖识别蛋白(PGRP)在昆虫的先天免疫过程中发挥着对病原物识别的作用。本研究克隆到橘小实蝇PGRP-LC基因的4条可变剪切子,分别命名为BdPGRPLCa、BdP... 详细信息

橘小实蝇(Bactrocera dorsalis)是一种重要的世界性果蔬害虫,也是一种重要柑橘害虫。肽聚糖识别蛋白(PGRP)在昆虫的先天免疫过程中发挥着对病原物识别的作用。本研究克隆到橘小实蝇PGRP-LC基因的4条可变剪切子,分别命名为BdPGRPLCa、BdPGRPP-LCb、BdPGRP-LCc和BdPGRPP-LCd。通过实时荧光定量PCR仪对不同发育阶段和不同组织的时空表达模式分析,4条剪切子的表达量在变态过程中出现升高,尤其是BdPGRP-LCa和BdPGRP-LCc表达量有显著性的升高,另外结果显示中肠和脂肪体是其主要表达的组织。在***、Beauveria bassiana、PGN-EB和PGN-SA的诱导试验中,检测4条剪切子对病原物的识别存在差异,4条剪切子都可以识别***和PGN-EB;另外BdPGRP-LCa也可以识别Beauveria bassiana和PGN-SA;BdPGRP-LCb还可以识别Beauveria bassiana;BdPGRP-LCc可以识别PGN-SA。随后利用RNAi技术有效沉默BdPGRP-LCa、BdPGRP-LCc和BdPGRPP-LCd的表达量,在注射dsRNA 60h后注射***,结果显示在前3天死亡率出现明显下降为35%0%,对照组死亡率是18%,尤其是注射dsBdPGRPP-LCd处理组的死亡率接近50%。本研究的结果为今后从免疫方面防治橘小实蝇提供一定的分子基础。

关键词：橘小实蝇肽聚糖识别蛋白病原物诱导定量表达 RNAi 死亡率

来源： cnki会议评论

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