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布鲁氏菌外膜蛋白免疫蛋白质组学的初步研究

布鲁氏菌外膜蛋白免疫蛋白质组学的初步研究

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作者：吴朔西北农林科技大学

学位级别：硕士

布鲁氏菌病(Brucellosis)(简称布病)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的人、畜共患传染病,在我国被列为二类传染病。世界上170多个国家和地区有人、畜布病的存在和流行。在我国布病波及28个省市区,并且近年来死灰复燃,给畜牧业和人类的健康... 详细信息

布鲁氏菌病(Brucellosis)(简称布病)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的人、畜共患传染病,在我国被列为二类传染病。世界上170多个国家和地区有人、畜布病的存在和流行。在我国布病波及28个省市区,并且近年来死灰复燃,给畜牧业和人类的健康带来严重危害。布鲁氏菌包括新发现的海洋哺乳动物种在内,有7种21个生物型,感染人的主要有牛、羊、猪、犬和新发现的海洋种。布鲁氏菌属革兰氏阴性菌,兼性寄生于巨噬细胞内,从而逃避宿主的免疫清除。它主要引起人的波状热和慢性感染,造成反刍动物不育和流产等,同时又是一种潜在的生物战剂和生物恐怖剂。因布病独特的致病机制和感染后难以根治的特点,疫苗一直在布病的综合防治措施中占有极为重要的地位。其中减毒活疫苗应用较早至今仍占主要地位,但在安全性和有效性方面仍存在很多问题。随着羊种、猪种和牛种布鲁氏菌基因组测序的完成和反向疫苗学理论和技术的发展,使布病疫苗研究进入“后基因组学”时代。“后基因组学”时代迫切需要解决现有疫苗的缺陷,即“安全性不足”和“保护效力有限”。目前研究表明布鲁氏菌重组亚单位疫苗能产生一定的免疫原性和免疫保护性,但是目前发现的分子保护效果不完全,提示还有新的保护性抗原没有被发现,因此找到布病疫苗新靶标是发展新一代疫苗的重大科学问题。基于以上思路,本研究对我国羊种布鲁氏菌五号菌种简称M5的外膜蛋白进行免疫蛋白质组学的初步研究,以期筛选布鲁氏菌保护性抗原分子,为安全、有效的布鲁氏菌重组亚单位疫苗研制提供保证。本研究的主要内容包括以下几方面: (1)制备布鲁氏菌免疫血清(兔血清),然后制备布鲁氏菌M5的外膜蛋白样品,通过双向电泳分离外膜蛋白质样品,将蛋白质转移到PVDF膜上,利用兔血清通过Western blot来探测免疫蛋白点。21个免疫蛋白点经胶内酶切、肽提取后用基质辅助激光解析/电子飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)进行鉴定。每个蛋白点的肽质量指纹图谱用Mascot进行检索后,代表了12个开放阅读框。这些蛋白不全是外膜蛋白,还存在胞浆蛋白,其功能涉及生物合成和物质代谢等领域,还有一个功能未知的蛋白。结果成功建立了布鲁氏菌外膜蛋白的免疫蛋白质组学研究方法,不仅验证了传统使用的抗原,同时也鉴定了新的免疫分子。为寻找保护性抗原分子及新型疫苗抗原候选提供新思路。 (2)通过文献调研和生物信息学的分析,本部分选取5个免疫蛋白基因,进行PCR扩增目的片段,分别构建在原核表达载体pET32a上,转化大肠埃希菌BL21,经诱导表达、纯化相应的蛋白,结果成功的诱导表达了4个免疫蛋白并进行了Western blot的鉴定具有反应原性。其中一个未诱导成功,条件正在摸索中。同时将5个蛋白基因构建到真核表达载体pVAX1上,转染COS-7细胞后验证有目的蛋白表达,大提质粒制备相应的候选DNA疫苗,构建基因工程疫苗。免疫Balb/c小鼠,共免疫3次,前2次用重组基因产物免疫,后1次用相应重组蛋白产物加强免疫。通过ELISA、ELISPOT、FCM及MTT来检测疫苗在免疫小鼠体内诱导产生的体液及细胞免疫指标。结果表明DNA候选疫苗可同时激发体液免疫和细胞免疫。以上研究为基于疫苗策略的有效预防布病的深入研究奠定了基础。

关键词：布鲁氏菌二维电泳免疫蛋白质组学反向疫苗学疫苗候选 DNA疫苗

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B型流感病毒抗体机制研究及抗原免疫性测定

B型流感病毒抗体机制研究及抗原免疫性测定

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作者：杨晨天津科技大学

学位级别：硕士

流感病毒长期与人类共存,其中A型流感病毒与B型流感病毒交替流行,形成全球性的传播。B型流感病毒(IBV)易感人群为青少年、儿童、孕妇、老人等,还包括有重大疾病及免疫力低的人群,在大流行的季节,能够造成巨大的危害及经济负担。IBV有两... 详细信息

流感病毒长期与人类共存,其中A型流感病毒与B型流感病毒交替流行,形成全球性的传播。B型流感病毒(IBV)易感人群为青少年、儿童、孕妇、老人等,还包括有重大疾病及免疫力低的人群,在大流行的季节,能够造成巨大的危害及经济负担。IBV有两个主要传播谱系,B/Victoria谱系和B/Yamagata谱系。病毒颗粒表面囊膜蛋白血凝素(HA)及神经氨酸酶(NA)是流感病毒的主要抗原。近几年,针对HA和NA的抗体也逐渐增多。本论文对实验室之前通过外周血淋巴细胞筛选出的B型流感病毒抗体0809进行了研究。首先,将不同IBV毒株的(野生型和突变体)HA胞外序列及NA的ORF构建到p CAGGS载体中,利用哺乳动物细胞表达系统293T细胞进行表达纯化,获得三聚体形式的HA-ecto蛋白。其次,利用SPR方法,测定了不同HA-ecto与0809 Fab的亲和力,结果发现,0809与不同IBV毒株的HA-ecto的亲和力最高可达到n M级别,亲和力范围在0.115μM～5.15 n M。同时利用SPR的方法,揭示出0809与流感病毒的唾液酸受体竞争性与HA-ecto结合。接着,将HA全长构建到p CAGGS载体中,与NA表达质粒共转染293T细胞,获得由HA和NA蛋白组成,无基因片段的病毒样颗粒(VLP),红细胞凝集实验测定VLP均有血凝活性。再有,更为重要的是论文测定了0809抗体体外的病毒中和效果、血凝抑制效果(HAI)。结果发现,0809能够中和2013～2019年的流行毒株或者疫苗候选毒株,IC范围在0.30～0.80μg/m L之间;并且,0809对于2008～2019年的流行毒株或者疫苗候选毒株具有一定的HAI作用,HAI滴度范围在0.24～3.65μg/m L之间。再者,通过构建HA-ecto突变体,以及相应的HA-ORF突变体,利用亲和力测定和HAI的方法,进一步确定了N197D、E141G、I198T等BHA上面关键氨基酸位点突变对抗体结合及其HAI活性的影响。另外,该论文通过结晶及X衍射的方法,解析了0809 Fab单个分子的晶体结构;并且通过冷冻电镜技术,解析了BVHA-NJ的三聚体结构,以及0809 Fab与BVHA-NJ的复合物结构,详细阐释了抗原与抗体相互作用的分子机制。最后,该论文探究了293T细胞表达纯化的疫苗候选毒株HA-ecto蛋白的在小鼠体内的免疫原性,结果发现,HA-ecto能诱导小鼠后产生较高水平的抗体,并且对异源毒株或HA-ecto具有交叉反应活性。综上,该论文详细阐释了0809抗体作用的分子机制,表明这种具有广谱中和作用的抗体,可作为B型流感病毒的预防及治疗药物的候选。同时,抗原和抗体的相互作用研究也充分揭示了近些年来IBV的抗原变异情况,为今后IBV的防控提供了参考;另外,该论文通过研究发现,通过哺乳动物细胞表达纯化的HA-ecto蛋白具有很好的免疫原性,结合佐剂的使用,可以作为一种B型流感亚单位疫苗的候选。

关键词： B型流感病毒血凝素蛋白中和抗体抗原变异免疫原性疫苗候选

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