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番木瓜CpWRI3参与调控果实成熟过程中脂肪酸合成

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园艺学报 2023年第8期50卷 1637-1648页

作者：莫雨杏周艳林润婷多泳星张涛刘锴栋岭南师范学院生命科学与技术学院广东湛江524048

以番木瓜(Carica papaya L.)果实为研究材料,通过前期构建的果实成熟数字基因表达谱,克隆得到1个编码WRI家族调控因子的基因,命名为CpWRI3。氨基酸序列比对和进化分析发现CpWRI3与拟南芥AtWRI3/4同源性较高。转录因子活性分析表明,CpWRI... 详细信息

以番木瓜(Carica papaya L.)果实为研究材料,通过前期构建的果实成熟数字基因表达谱,克隆得到1个编码WRI家族调控因子的基因,命名为CpWRI3。氨基酸序列比对和进化分析发现CpWRI3与拟南芥AtWRI3/4同源性较高。转录因子活性分析表明,CpWRI3具有一定的转录激活活性。实时荧光定量PCR分析表明,CpWRI3的表达水平随着果实成熟不断升高,采后8 d达到峰值,表明其在果实成熟的后期发挥重要作用。在果实中瞬时过量表达CpWRI3促进了月桂酸、棕榈油酸和亚油酸含量的提升。体外凝胶阻滞试验(EMSA)证实CpWRI3能与下游靶基因Cp KAS1和Cp ACC1启动子上AW-box元件的序列特异结合。利用荧光素酶系统进一步证明CpWRI3可以在植物体内诱导CpKAS1和CpACC1启动子的表达。上述结果表明CpWRI3能参与调控月桂酸、棕榈油酸和亚油酸等脂肪酸合成。

关键词：番木瓜果实成熟脂肪酸转录调控 WRI家族

番木瓜两性株高温条件下花性转变的转录组分析

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果树学报 2023年第3期40卷 457-470页

作者：周陈平杨敏郭金菊邝瑞彬李庆萌杨护黄炳雄魏岳荣广东省农业科学院果树研究所·农业农村部南亚热带果树生物学与遗传资源利用重点实验室·广东省热带亚热带果树研究重点实验室广州510640 广东省农业科学院设施农业研究所广州510640

【目的】探索番木瓜两性株高温条件下花性转变的分子机制,筛选花性调控相关基因,为培育耐高温番木瓜新品种提供理论依据。【方法】以在高温环境(39~40℃)下采集的番木瓜两性株的雄花(雌蕊退化)和两性花(完全花)为试验材料,利用高效液相... 详细信息

【目的】探索番木瓜两性株高温条件下花性转变的分子机制,筛选花性调控相关基因,为培育耐高温番木瓜新品种提供理论依据。【方法】以在高温环境(39~40℃)下采集的番木瓜两性株的雄花(雌蕊退化)和两性花(完全花)为试验材料,利用高效液相色谱法测定两者内源激素含量,利用RNA-seq技术分析两者间的差异表达基因,并通过qRTPCR进行验证,用Plant CARE在线软件分析花发育相关基因启动子顺式元件。【结果】两性花乙烯合成前体1-氨基环丙烷羧酸(ACC)、吲哚-3-乙酸(IAA)、反式玉米素(tZ)、水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)含量显著高于雄花,两者脱落酸(ABA)和赤霉素A3(GA3)含量无显著差异。从转录组数据中共获得27793个表达基因,筛选到517个差异表达基因(DEG),其中214个基因在雄花中上调表达,303个基因下调表达。这些差异表达基因主要富集到转录与调控、植物激素响应与信号转导、细胞分化与器官生长调控、质膜组分、氧化应激等GO条目和植物激素信号转导、植物-病原体相互作用、促丝裂原活化蛋白激酶信号通路等KEGG通路上。通过基因功能注释,筛选到70个植物激素信号转导、响应、生物合成及代谢相关差异表达基因,其中52个基因在雄花中下调表达,18个基因上调表达。鉴定到ANT、ANT2、CIB1、HHO5、ZIP21、SAP等6个花发育相关差异表达基因,均在雄花中下调表达,其中SAP基因在两性花中特异表达。除ANT2未查找到相应启动子序列外,ANT、CIB1、HHO5、SAP、ZIP21启动子含植物激素和逆境相关顺式作用元件。选取17个花发育和植物激素相关差异表达基因进行qRT-PCR分析,结果与转录组数据一致。【结论】番木瓜两性株在高温条件下花性转变可能与花芽ACC、IAA、tZ、SA、JA含量下降及ANT、ANT2、CIB1、HHO5、SAP基因下调表达有关。

关键词：番木瓜两性株高温性别转变基因差异表达植物激素

番木瓜胚性细胞悬浮系高效遗传转化体系的建立

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果树学报 2023年第10期40卷 2089-2097页

作者：杨敏周陈平李庆萌邝瑞彬吴夏明魏岳荣广东省农业科学院果树研究所·农业农村部南亚热带果树生物学与遗传资源利用重点实验室·广东省热带亚热带果树研究重点实验室广州510640

【目的】建立番木瓜高效遗传转化体系,为番木瓜基因功能研究和重要农艺性状改良提供新的技术支撑。【方法】以紫晖番木瓜胚性细胞悬浮系(embryogenic cell suspensions,ECS)为遗传转化受体,利用植物表达载体pCAMBIA1301和农杆菌介导法... 详细信息

【目的】建立番木瓜高效遗传转化体系,为番木瓜基因功能研究和重要农艺性状改良提供新的技术支撑。【方法】以紫晖番木瓜胚性细胞悬浮系(embryogenic cell suspensions,ECS)为遗传转化受体,利用植物表达载体pCAMBIA1301和农杆菌介导法进行遗传转化,对抗生素浓度筛选、侵染时间、继代培养、抗性胚的诱导与萌发以及植株再生整个过程进行探索,最后获得抗性再生植株。【结果】通过设置不同浓度的头孢霉素和潮霉素处理,观察ECS细胞状态,筛选、确定头孢霉素和潮霉素最适处理质量浓度分别为200 mg·L^(-1)和5 mg·L^(-1)。工程菌和ECS共培养侵染2 d后转到含有头孢霉素和潮霉素的液体筛选培养基上进行继代培养,继代周期为14 d。经GUS染色验证,表明继代3次后的ECS几乎全部为转化细胞。将以上ECS转移到液体胚诱导培养基中进行培养,2个月后可获得大量球形体细胞胚,且GUS组织染色为蓝色。将球形体细胞胚转到半固体成熟培养基上培养,2个月后可获得成熟子叶期体细胞胚。子叶期体细胞胚在萌发培养基上光培养30 d后,可获得再生芽。任意选取再生芽进行GUS染色,均可染成蓝色。抗性再生芽经促根培养可成功获得再生植株。利用PCR检测抗性再生植株,可以确定GUS基因已经整合到番木瓜基因组中。【结论】成功建立了一种以番木瓜ECS为转化受体的农杆菌介导的高效遗传转化体系。在该技术体系中,经农杆菌侵染后的ECS继代筛选3次后,几乎全部为转化细胞,这些转化细胞经体胚诱导、成熟、萌发和生根过程可成功获得再生植株,抗性体胚得胚率为43.65%,抗性体胚萌发率为73.26%,植株再生率为80.55%,大大提高了番木瓜遗传转化效率。该体系为番木瓜基因功能研究和分子育种提供了新的途径。

关键词：番木瓜胚性悬浮系根癌农杆菌遗传转化共培养

番木瓜成熟过程中全基因组DNA甲基化和转录组变化分析

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园艺学报 2022年第3期49卷 519-532页

作者：周陈平杨敏郭金菊邝瑞彬杨护黄炳雄魏岳荣广东省农业科学院果树研究所农业农村部南亚热带果树生物学与遗传资源利用重点实验室广东省热带亚热带果树研究重点实验室广州510640 广东省农业科学院设施农业研究所广州510640

采用全基因组DNA甲基化(WGBS)和转录组测序(RNA-seq)技术对番木瓜4个成熟时期(绿熟期、破色期、熟化期、腐熟期)的果实样品进行高通量测序。C位点、CG、CHG和CHH序列平均甲基化水平分别为17.15%、49.33%、34.30%和8.28%。全基因组DNA甲... 详细信息

采用全基因组DNA甲基化(WGBS)和转录组测序(RNA-seq)技术对番木瓜4个成熟时期(绿熟期、破色期、熟化期、腐熟期)的果实样品进行高通量测序。C位点、CG、CHG和CHH序列平均甲基化水平分别为17.15%、49.33%、34.30%和8.28%。全基因组DNA甲基化水平在果实成熟过程中持续下降,同时差异表达基因(DEG)数量逐渐上升。全基因组DNA甲基化和转录组数据联合分析表明,基因表达水平与启动子及基因体甲基化水平呈显著正相关。筛选出CpACO4、CpPDS、CpXTH30和CpXTH31等4个番木瓜果实成熟差异表达候选基因,利用荧光定量PCR和McrBC-PCR分别检测其表达水平和相应DMR序列甲基化水平,结果分别同转录组和全基因组DNA甲基化一致,推测这些基因在番木瓜果实成熟过程中起重要作用。

关键词：番木瓜果实成熟全基因组 DNA甲基化基因差异表达

番木瓜果糖-2,6-二磷酸酶CpF2KP基因克隆和蛋白表达纯化

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生物工程学报 2023年第2期39卷 614-624页

作者：左丽萍曾秋霞赵晓兵杨丽媛徐良伟赖娟岳晶晶福建农林大学基因组与生物技术研究中心、福建省海峡植物应用系统生物学重点实验室福建福州350002 福建农林大学园艺学院福建福州350002

番木瓜是岭南四大名果之一,在我国东南部地区广泛种植,因其具有食用和药用双重价值,因此深受人们的青睐。果糖-6-磷酸,2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酯酶(fructose-6-phosphate,2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase,F2KP)是一个独特的双功能... 详细信息

番木瓜是岭南四大名果之一,在我国东南部地区广泛种植,因其具有食用和药用双重价值,因此深受人们的青睐。果糖-6-磷酸,2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酯酶(fructose-6-phosphate,2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase,F2KP)是一个独特的双功能酶,具有激酶功能域和酯酶功能域,能催化生物体内糖代谢的重要调节物果糖-2,6-二磷酸(Fru-2,6-P_(2))的合成和降解。为了研究番木瓜中编码该酶的基因CpF2KP的功能,得到目的蛋白尤为重要。本研究从番木瓜基因组中提取到CpF2KP基因的编码序列(coding sequence,CDS)序列,该基因CDS全长2274 bp。将该基因CDS全长扩增之后选用pGEX-4T-1载体进行原核表达。对载体pGEX-4T-1用EcoRⅠ和BamHⅠ进行双酶切,利用基因重组的方式将扩增序列构建到原核表达载体上。经过诱导条件探索,SDS-PAGE结果显示GST-CpF2KP重组蛋白的大小约为110 kDa,诱导CpF2KP蛋白表达的最适条件为:异丙基β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)浓度为0.5 mmol/L,温度28℃。对诱导后的CpF2KP蛋白进行纯化,得到了纯化的单一目的蛋白。此外,检测了该基因的组织表达特性发现该基因在种子中表达量最高,在果肉中表达量最低。该研究为进一步深入揭示番木瓜CpF2KP蛋白的功能及研究该基因参与的生物学过程提供了重要基础。

关键词：番木瓜 CpF2KP 原核表达蛋白纯化

番木瓜PRSV和PLDMV复合侵染中呈中性互作

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园艺学报 2022年第11期49卷 2336-2346页

作者：莫翠萍吴自林郭泳仪张曙光李鹏飞李华平华南农业大学植物病毒研究室广东省微生物信号与作物病害重点实验室广州510642 广东省科学院南繁种业研究所广东省甘蔗遗传改良工程中心广州510316

商业化的抗番木瓜环斑病毒(papayaringspotvirus,PRSV)的转基因番木瓜品种‘华农1号’的应用成功控制了华南地区该毁灭性病毒。然而近年来在广东和海南的一些转基因或非转基因植株上发现了另一种具有严重危害的病毒——番木瓜畸形花叶病... 详细信息

商业化的抗番木瓜环斑病毒(papayaringspotvirus,PRSV)的转基因番木瓜品种‘华农1号’的应用成功控制了华南地区该毁灭性病毒。然而近年来在广东和海南的一些转基因或非转基因植株上发现了另一种具有严重危害的病毒——番木瓜畸形花叶病毒(papayaleafdistortionmosaicvirus,PLDMV)。为了明确这两种病毒在番木瓜上的相互关系,通过人工接种分析二者在转基因和非转基因番木瓜上的侵染率、症状、细胞病理变化以及病毒积累量等特征。结果表明,‘华农1号’对PRSV有很强的抗性,但对PLDMV却高度感病,且PLDMV并不能协助PRSV克服转基因番木瓜对其的抗性;两种病毒单独侵染和复合侵染非转基因番木瓜均能引致严重的症状,二者症状无明显差异。细胞病理学分析表明,病毒侵染后叶片叶绿体萎缩且排列不紧凑,复合侵染并未对叶肉细胞造成更为严重的损害。接种PRSV的转基因番木瓜15d后PRSV积累量逐渐减少,直至检测不到;而接种PLDMV后其积累量逐渐升高并保持在一个较高的水平。在转基因和非转基因番木瓜上,PRSV的积累量始终低于PLDMV,在非转基因番木瓜上,两种病毒长期共存,并各自维持相应的病毒含量。这些结果表明,抗PRSV的转基因番木瓜‘华农1号’不抗PLDMV;PRSV和PLDMV复合侵染没有在番木瓜植株中发生协生关系,表现为中性互作。

关键词：番木瓜番木瓜环斑病毒番木瓜畸形花叶病毒复合侵染互作分析

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番木瓜抗倒伏优势微生物及候选基因筛选

南方农业学报 2023年第2期54卷 336-346页

作者：陈仕淼郑剑陆覃昱张继石兰蓉马松琼范兢升甘卫堂广西亚热带作物研究所广西南宁530001

【目的】筛选抗倒伏性强的番木瓜根际优势微生物,挖掘番木瓜抗倒伏差异表达的关键基因,为揭示番木瓜抗倒伏机制及相关品种选育提供参考。【方法】试验设常规施肥量处理(每株施用2.5 kg有机肥,CK)、缺肥处理(不施有机肥,WLR)和高有机肥处... 详细信息

【目的】筛选抗倒伏性强的番木瓜根际优势微生物,挖掘番木瓜抗倒伏差异表达的关键基因,为揭示番木瓜抗倒伏机制及相关品种选育提供参考。【方法】试验设常规施肥量处理(每株施用2.5 kg有机肥,CK)、缺肥处理(不施有机肥,WLR)和高有机肥处理(每株施用10 kg有机肥,SLR)3个处理,根据其转录组数据和根际微生物数据,利用加权基因共表达网络(WGCNA)关联分析番木瓜抗倒伏相关的关键基因,并分析根际微生物变化情况。【结果】SLR处理的植株抗倒伏性最强,其次是CK,WLR处理植株的抗倒伏性最差。WLR处理植株的株高、节间长度和茎粗均显著低于CK和SLR处理的植株(P番木瓜抗倒伏性能相关的品蓝模块和淡黄模块,进而对这2个模块构建基因共表达网络,筛选出可能与番木瓜抗倒伏性能密切相关的乙酰辅酶A乙酰转移酶基因(AACT)、聚腺苷酸结合蛋白基因(RBP47)、线粒体输入内膜转位酶亚基基因(TIM9)、钙依赖通道7TM区域基因(HYP1)、韧皮部蛋白质丝网络蛋白基因(SEO)和半胱氨酸蛋白酶抑制剂a基因(CPI)等6个核心基因。核心基因功能分析结果显示,品蓝模块涉及番木瓜萜类代谢调控,而淡黄色模块涉及番木瓜韧皮部生长代谢调控。【结论】根际优势微生物与番木瓜抗倒伏性密切相关,其可通过调控番木瓜茎的生长从而提高抗倒伏性,可作为抗倒伏性强番木瓜品种选育的微生物筛选标记之一。

关键词：番木瓜加权基因共表达网络(WGCNA) 优势微生物抗倒伏基因挖掘

番木瓜赖氨酸基序类受体激酶LysM-RLK基因家族鉴定及生物信息学分析

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热带作物学报 2023年第5期44卷 867-879页

作者：郭盼孔华王雨戴云素贾瑞宗周瑶郭安平纪长绵马春花云南农业大学园林园艺学院云南昆明650201 中国热带农业科学院三亚研究院海南三亚572025 中国热带农业科学院热带生物技术研究所/海南省南繁生物安全与分子育种重点实验室海南海口571101 海南大学热带作物学院海南海口570228

本研究采用生物信息学方法在番木瓜全基因组范围系统鉴定了7个LysM-RLK家族基因,并解析了其染色体分布特征、基因结构特征、蛋白理化性质和亚细胞定位信息。基因家族进化分析表明番木瓜的7个LysM-RLK基因可划分为3个亚组(Lym-II,Lym-III... 详细信息

本研究采用生物信息学方法在番木瓜全基因组范围系统鉴定了7个LysM-RLK家族基因,并解析了其染色体分布特征、基因结构特征、蛋白理化性质和亚细胞定位信息。基因家族进化分析表明番木瓜的7个LysM-RLK基因可划分为3个亚组(Lym-II,Lym-III,Lym-IV),并分布于4条染色体上。基因复制是番木瓜LysM-RLK家族进化的主要驱动力,基因复制分析鉴定得到7对复制基因。启动子序列调控元件分析发现其包含多个光响应元件及参与低温应答和逆境相关激素信号应答的元件。大规模比较转录组分析系统地解析了LysM-RLK在番木瓜生物胁迫、非生物胁迫条件下及不同组织中的基因表达模式,揭示其特异性的表达模式及潜在的生物学功能。复制基因对的表达分化、结构域组成差异和蛋白质三级结构的变化,暗示其在进化过程中的亚功能化现象。生物和非生物胁迫条件下的核心共表达网络分析鉴定了27个与LysM-RLK3强关联的核心基因,揭示了LysM-RLK3潜在的转录调控模式。相关结果为番木瓜LysM-RLK家族起源演化、功能分化及其在逆境响应和生长发育过程中的角色提供重要依据。

关键词：番木瓜 LysM-RLK家族生物信息分析基因表达蛋白三维结构

番木瓜WRKY转录因子CpWRKY11的克隆和表达

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2023年第5期51卷 119-130,138页

作者：杨敏李庆萌周陈平邝瑞彬杨护黄炳雄魏岳荣广东省农业科学院果树研究所农业农村部南亚热带果树生物学与遗传资源利用重点实验室/广东省热带亚热带果树研究重点实验室广东广州510640

【目的】克隆番木瓜炭疽菌诱导的WRKY转录因子CpWRKY11,研究其在生物胁迫、外源激素处理及非生物胁迫条件下的表达特征,为CpWRKY11基因在后续番木瓜分子育种中的应用提供理论支持。【方法】从自主选育的炭疽病抗性品种中克隆WRKY转录因... 详细信息

【目的】克隆番木瓜炭疽菌诱导的WRKY转录因子CpWRKY11,研究其在生物胁迫、外源激素处理及非生物胁迫条件下的表达特征,为CpWRKY11基因在后续番木瓜分子育种中的应用提供理论支持。【方法】从自主选育的炭疽病抗性品种中克隆WRKY转录因子CpWRKY11,采用SMART、ExPaSy、NetPhos和DNAMAN软件对该基因及其编码的蛋白序列进行生物信息学分析,利用MEGA-X软件进行系统进化树构建和分析;构建亚细胞定位载体CpWRKY11-GFP,通过转化水稻原生质体,确定CpWRKY11的亚细胞定位情况;利用酵母单杂交试验验证CpWRKY11是否具有转录激活活性;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析CpWRKY11在番木瓜不同组织(根、茎、叶、花和果实)及生物胁迫(短孢炭疽菌和番木瓜畸形花叶病毒侵染)、外源激素(水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、乙烯利(ETH))和非生物胁迫(高盐、干旱和机械损伤)处理下的表达情况。【结果】CpWRKY11基因编码序列全长1719 bp,编码572个氨基酸;CpWRKY11含有60个磷酸化位点,理论分子量为62.31 ku,理论等电点为6.75,不稳定指数为51.17,亲水性为-0.792,是一个亲水不稳定蛋白。CpWRKY11有2个典型的WRKY结构域,同源氨基酸比对及进化树分析结果显示,CpWRKY11与拟南芥AtWRKY20的同源性最高,属于WRKY家族Ⅰ类。亚细胞定位结果显示,CpWRKY11只定位在细胞核上。酵母转录激活验证试验结果显示,CpWRKY11蛋白不具有转录激活活性。CpWRKY11在番木瓜中为组成型表达,在茎中表达量最高,其次为根、果实和花,在叶中的表达量最低。CpWRKY11受短孢炭疽菌和PLDMV的诱导上调表达,在短孢炭疽菌诱导48 h内持续上调,与0 h对照相比其表达量均显著上调,且在反应后期(24和48 h)表达量更高。在PLDMV处理条件下,除接种第3天外,CpWRKY11也均呈现出明显的上调趋势。外源激素处理结果显示,CpWRKY11受SA、ETH和MeJA的诱导上调表达,尤其是在MeJA处理下,CpWRKY11被强烈诱导而显著上调表达,处理48 h内的表达量较对照上调1.9倍以上。CpWRKY11受机械损伤的强烈诱导,表达量显著上调。【结论】CpWRKY11是调控番木瓜逆境胁迫响应,尤其是病原菌侵染及机械损伤响应的重要因子。CpWRKY11可能主要通过JA信号途径参与病原菌应答反应,是具有潜在利用价值的重要候选基因。

关键词：番木瓜炭疽病 CpWRKY11 生物胁迫