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烷基侧链对Sol-gel固定化脂肪酶酯化活性的影响机理

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现代化工 2009年第11期29卷 56-58,60页

作者：杨江科曹雄文程占冰刘利营华中科技大学生命科学与技术学院分子生物物理教育部重点实验室湖北武汉430074

以甲基三甲氧基硅烷(MTMS)、乙烯基三甲氧基硅烷(VTMOS)、乙烯基三乙氧基(VTEOS)、辛基三甲氧基硅烷(OTMOS)和四甲氧基硅烷(TMOS)为前趋体制备4种不同的固定化脂肪酶,并系统考察了烷基侧链对sol-gel固定化酶胶体结构和酶活性的影响。结... 详细信息

以甲基三甲氧基硅烷(MTMS)、乙烯基三甲氧基硅烷(VTMOS)、乙烯基三乙氧基(VTEOS)、辛基三甲氧基硅烷(OTMOS)和四甲氧基硅烷(TMOS)为前趋体制备4种不同的固定化脂肪酶,并系统考察了烷基侧链对sol-gel固定化酶胶体结构和酶活性的影响。结果表明,随着烷基侧链的增长和数目的增加,固定化酶活力均逐渐增加,固定化脂肪酶颗粒平均孔径逐渐增大,孔体积逐渐增加,对底物的传质阻力逐渐降低;同时颗粒逐渐由球形变成不定形或团块状结构。脂肪酶活性的增加不仅来源于疏水性烷基侧链引起的脂肪酶的界面激活效应,同时固定化颗粒结构的改变了增加了底物和酶分子的结合,提高了固定化酶的表观活性。

关键词：脂肪酶有机硅烷界面激活表面积孔径

脂肪酸分子印迹对sol-gel固定化脂肪酶酯化活性和胶体结构的影响

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分子催化 2010年第1期24卷 77-81页

作者：杨江科曹雄文舒钟瑶分子生物物理教育部重点实验室、华中科技大学生命科学与技术学院武汉430074

基于sol-gel工艺的生物印迹对提高脂肪酶在非水相体系中的活性,扩大其应用范围具有重要作用.本研究以乙烯基三甲氧基硅烷(VTMOS)和四甲氧基硅烷(TMOS)为前趋体,系统考察了脂肪酸印迹分子对sol-gel脂肪酶固定化率和活性的影响,获得了最... 详细信息

基于sol-gel工艺的生物印迹对提高脂肪酶在非水相体系中的活性,扩大其应用范围具有重要作用.本研究以乙烯基三甲氧基硅烷(VTMOS)和四甲氧基硅烷(TMOS)为前趋体,系统考察了脂肪酸印迹分子对sol-gel脂肪酶固定化率和活性的影响,获得了最优的工艺条件.当VTMOS/TMOS为7∶1时,印迹后脂肪酶的比酶活和总酶活分别达到3311.0μmol/h/mg和2506.9μmol/h/gGel,比未印迹同摩尔比的固定化脂肪酶分别提高了2.06和1.79倍.系统考察了脂肪酸生物印迹效应和胶体结构对固定化酶表观活性的影响.氮气吸附—解吸附分析和扫描电镜观察表明,随着脂肪酸分子的参入,固定化脂肪酶颗粒平均孔径增大,对底物的传质阻力逐渐降低,但比表面积和孔体积的变化并不显著;印迹酶平均颗粒直径明显减小,各有机硅烷单体之间的成键能力减弱.表明脂肪酶活性的增加主要来源于疏水性脂肪酸侧链引起的脂肪酶的界面激活效应(生物印迹效应),同时固定化颗粒孔径的改变增加了底物和酶分子的结合,提高了固定化酶的表观活性.

关键词：脂肪酶脂肪酸分子印迹界面激活孔径

核壳纳米微球的可控合成及其脂肪酶固定化研究

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核壳纳米微球的可控合成及其脂肪酶固定化研究

作者：孙雪飞浙江大学

学位级别：硕士

酶固定化技术克服了游离酶稳定性差,无法重复使用等缺陷,使得高催化效率的生物酶在化学工业领域的大规模应用成为可能。然而,由于引入的载体结构、固定化方式以及酶分子自身结构性征等的影响,使得酶在固定化后活性远低于游离酶。近年来... 详细信息

酶固定化技术克服了游离酶稳定性差,无法重复使用等缺陷,使得高催化效率的生物酶在化学工业领域的大规模应用成为可能。然而,由于引入的载体结构、固定化方式以及酶分子自身结构性征等的影响,使得酶在固定化后活性远低于游离酶。近年来,如何有效提高固定化酶活性成为该领域的主要诉求之一。以脂肪酶为例,基于其“界面激活”的催化特征,许多研究致力于设计疏水载体用于其活性构象的诱导,从而实现固定化酶的高催化活性。然而,由于脂肪酶构象转变处于动态可逆的平衡,简单的构象激活无法实现酶活力的长效保持,其工业化应用仍受到很大限制。本课题基于以上研究现状,通过“激活-保护”两步策略实现了脂肪酶在两亲性核壳结构的聚丙烯酸正丁酯-氧化葡聚糖纳米微球(PBA-PAD NSs)上固定化后的高效酶活表达。利用氧化葡聚糖(PAD)作为大分子引发剂和乳化剂,参与丙烯酸正丁酯(n-BA)的乳液聚合,设计合成了一系列含有不同醛基密度的具有核壳结构的PBA-PAD NSs。粒径可控,形貌均一稳定,单体和乳化剂完全转化,无需复杂的后处理即可直接使用。利用PBA-PAD NSs壳层的醛基位点进行脂肪酶(PPL)的固定化,通过疏水的PBA内核的诱导作用和亲水PAD壳层的保护作用,实现了脂肪酶活性构象的转变以及长效保持。相较于游离酶,固定化酶的最适催化条件向高温和碱性方向移动,其适宜催化区间得到扩展;在最适催化条件下,酶活力提高了 40倍;固定化酶表现出很好的重复使用性能,循环使用十个周期后,酶活力和蛋白质负载率仍保持近80%。该纳米微球制备高效简便,生物相容性良好,将脂肪酶固定在纳米微球的壳层,能够极大提高酶活及稳定性,为脂肪酶的固定化及其活性的高效表达提供了一种新思路,具有大规模工业化应用的潜力。

关键词：酶固定化界面激活氧化葡聚糖纳米微球乳液聚合

脂肪酶-无机杂化纳米花的制备及其催化性能的研究

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脂肪酶-无机杂化纳米花的制备及其催化性能的研究

作者：李从海天津科技大学

学位级别：硕士

酶-无机杂化纳米花是近年来发展起来的一种新型固定化酶方法,它具有合成步骤简单、条件温和的特点。而且,与游离酶相比,所制备的杂化纳米花固定化酶表现出更好的催化性能。因此,酶-无机杂化纳米花是一种具有极大潜力的固定化酶方法。本... 详细信息

酶-无机杂化纳米花是近年来发展起来的一种新型固定化酶方法,它具有合成步骤简单、条件温和的特点。而且,与游离酶相比,所制备的杂化纳米花固定化酶表现出更好的催化性能。因此,酶-无机杂化纳米花是一种具有极大潜力的固定化酶方法。本研究以米曲霉脂肪酶为研究对象,成功制备出高活力的脂肪酶-无机杂化纳米花（hNF-lipase）、激活的脂肪酶-无机杂化纳米花（Activated hNF-lipase）和激活的磁性脂肪酶-无机杂化纳米花（Magnetic activated hNF-lipase）固定化酶,并考察了这三种固定化酶的催化性能。主要研究内容如下:1.金属离子价态对hNF-lipase的形态和活性有显著影响。相比于一价和三价金属离子（Ag+、A13+、Fe3+）,二价金属离子（Mn2+、Zn2+和Ca2+）与脂肪酶更容易形成规则形状的杂化纳米花。使用一价和三价金属离子（Ag+、A13+、Fe3+）合成的hNF-lipase的酶活回收率分别只有4.87%、3.48%和0.71%。但是,使用二价金属离子（Mn2+、Zn2+和Ca2+）合成的hNF-lipase的酶活回收率分别为24.11%、30.20%和43.05%。在优化的制备条件下（PBS中磷酸根的浓度为4mM、脂肪酶浓度为0.02mg/mL、氯化钙浓度为12.5 mM和PBS的pH为8）,hNF-lipase的最大酶活回收率是77.4%,比优化前提高了 34%。此外,表面活性剂吐温-80能显著激活hNF-lipase的酶活。当吐温-80的浓度是0.15 mM时,activated hNF-lipase酶活回收率最高,达到172.08%,是hNF-lipase酶活回收率的2.2倍。全反射傅里叶红外光谱分析表明,与hNF-lipase相比,activated hNF-lipase的α-螺旋含量降低,β-折叠增加。这个结果表明,在吐温-80的界面激活作用下,脂肪酶活性中心的“α螺旋盖子”被打开,脂肪酶呈现活性构象。因而 activated hNF-lipase 的酶活增加。此外,hNF-lipase 和 activated hNF-lipase 的最适催化温度和pH与游离脂肪酶相同,分别都是40℃和4。与hNF-lipase和activated hNF-lipase相比,游离脂肪酶的米氏常数（Km）最低,表明固定化导致底物和酶的亲和力减弱,但是,activated hNF-lipase表现出最大的Vmax/Km值,说明activated hNF-lipase的催化效率较高。另外,与游离脂肪酶相比,hNF-lipase和activated hNF-lipase表现出更好的温度耐受性、变性剂耐受性和储存稳定性。而且,在重复使用了六次后,hNF-lipase和activated hNF-lipase酶活残留率分别为60.7%和67.6%。2.利用直接包埋和共价交联两种方法将Fe3O4磁性纳米颗粒整合到activated hNF-lipase中,成功制备出magnetic activated hNF-lipase。当Fe3O4磁性纳米颗粒的浓度为0.02 mg/mL时,直接包埋法制备的magnetic activated hNF-lipase的酶活回收率达到189.64%。当Fe3O4磁性纳米颗粒浓度为0.02 mg/mL、戊二醛浓度为0.1%、戊二醛对磁性纳米颗粒的处理时间为30 min、交联时间为1.5 h时,共价结合法制备的magnetic activated hNF-lipase的酶活回收率为174%。此外,游离脂肪酶和magnetic activated hNF-lipase 的最适温度和 pH 相同,分别都为 40℃和 4。magnetic activated hNF-lipase的Km值小于游离脂肪酶,表明magnetic activated hNF-lipase与底物的亲和力高于游离脂肪酶,但是,magnetic activated hNF-lipase的Vmax/Km值小于游离脂肪酶,表明magnetic activated hNF-lipase的催化效率低于游离脂肪酶。另外,与游离脂肪酶相比,magnetic activated hNF-lipase表现出更好的温度耐受性、甲醇耐受性和储存稳定性。而且,在重复使用了十次后,magnetic activated hNF-lipase 和 activated hNF-lipase的酶活残留率分别为83.7%和26%。

关键词：脂肪酶不同金属离子酶-无机杂化纳米花磁性纳米颗粒界面激活

脂肪酶SMG1的底物识别和热稳定性机制研究

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脂肪酶SMG1的底物识别和热稳定性机制研究

作者：王倩华南理工大学

学位级别：硕士

脂肪酶(甘油三酯水解酶)是能够在油水界面催化脂类物质水解的一类水解酶。脂肪酶是一种重要的生物催化剂,在油脂工业和化工领域应用广泛。偏甘油酯脂肪酶是只能水解甘油二酯或甘油单酯的脂肪酶,在油脂改性上极具应用潜力。但是在脂肪酶... 详细信息

脂肪酶(甘油三酯水解酶)是能够在油水界面催化脂类物质水解的一类水解酶。脂肪酶是一种重要的生物催化剂,在油脂工业和化工领域应用广泛。偏甘油酯脂肪酶是只能水解甘油二酯或甘油单酯的脂肪酶,在油脂改性上极具应用潜力。但是在脂肪酶的研究领域,关于偏甘油脂肪酶的研究相对较少。脂肪酶SMG1是近期从球形马拉色菌中分离的一种偏甘油酯脂肪酶,能作用于甘油二酯和甘油单酯。SMG1晶体结构已经被解析出来(PDB ID:3UUE and 3UUF),为SMG1结构和功能关系的研究提供了基础。研究表明脂肪酶独有的界面激活特性与脂肪酶催化反应时构象的变化(特别是盖子结构的构象变化)密切相关,而脂肪酶的盖子结构对脂肪酶的底物选择性有重要影响。脂肪酶SMG1的盖子结构呈loop构象,而大多数脂肪酶的盖子结构采取helix构象。本文以脂肪酶SMG1为研究对象,从晶体结构出发结合已有的研究成果,通过定点突变技术、毕赤酵母重组表达、蛋白纯化、酶学性质分析以及蛋白结构分析等手段对SMG1的底物识别机制进行了研究,希望能对酶分子的理性设计提供一定的参考。另外,脂肪酶的热稳定性对其应用有重要影响,我们对脂肪酶SMG1的 Asn277位点对其热稳定性的影响进行了研究。本研究主要包括以下方面的内容:1.突变体设计。通过分析SMG1的晶体结构并结合已有的研究成果,我们认为位于催化口袋边缘的Phe278,和盖子结构上的Leu103和Phe104对底物识别有重要影响,因此我们以这几个位点为目标设计了L103G、F104G、F278A、L103G-F278A、F104G-F278A以及Delete(103-104)突变体。2.野生型和突变体SMG1的制备。利用定点突变技术从实验室构建的野生型表达载体出发构建突变体表达载体,并成功在毕赤酵母X-33中重组表达。对野生型和突变体的X-33表达菌株进行发酵,利用亲和层析技术对目的蛋白进行纯化,成功获得高纯度突变体重组酶蛋白。3.对野生型和突变体的酶学性质的分析和比较:1)SMG1界面催化特性的研究。以对硝基苯酚丁酸酯(PNPB)为底物研究了SMG1的界面催化特性,结果表明SMG1对PNPB的水解动力学曲线不符合典型脂肪酶界面激活的趋势。我们分析这可能与SMG1特殊的盖子结构有关。2)对野生型和突变体的最适温度、p H、最适底物、酶活、催化动力学参数、以及对天然底物TAG、DAG、MAG的选择性进行了分析,结果表明所有的突变体仍然不能水解甘油三酯,但是一些突变体的底物选择性发生了明显变化。L103G-F278A、F104G-F278A以及Delete(103-104)提高了对1,3-DAG的偏好性,水解1,3-DAG的平均速率分别是水解1,2-DAG的平均速率的7.21、10.17、6.42倍,而野生型仅为1.38倍。3)突变体L103G对人工底物对硝基苯酚辛酸酯(PNPO)的水解活力提高为原来的2倍,但是对DAG的水解活力降低为53%,突变体F278A对PNPO的水解活力降低为11%,而对DAG的水解活力保持在78%。而突变体Delete(103-104)对PNPO的水解活力仅为野生型的0.9%,对DAG的水解活力为野生型33%。4)结合SMG1的结构对这些性质变化进行了分析,对底物识别机制进行了讨论。***277与SMG1热稳定性关系的研究。在实验室构建的N277F、N277L、N277D这几个突变体的基础上,用圆二色谱对野生型及N277突变体的热稳定性进行了分析,结果与以前实验室实验测定的结果一致。我们从分子建模的角度分析了N277对脂肪酶SMG1热稳定性影响的机制。

关键词：脂肪酶SMG1 盖子结构界面激活定点突变底物选择性热稳定性

低共熔溶剂/水双相体系中固定化脂肪酶的构建及其在生物柴油中的应用

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低共熔溶剂/水双相体系中固定化脂肪酶的构建及其在生物柴油中的...

作者：张智金天津科技大学

学位级别：硕士

作为一种能在油水界面上催化酯水解和酯合成的界面酶,脂肪酶在均一水相中催化通常表现酶活力较低以及稳定性差的缺点。因此非纯水相体系中脂肪酶的催化及其固定化的研究具有重要意义。低共熔溶剂(Deep eutectic solvent,DES)是近年来发... 详细信息

作为一种能在油水界面上催化酯水解和酯合成的界面酶,脂肪酶在均一水相中催化通常表现酶活力较低以及稳定性差的缺点。因此非纯水相体系中脂肪酶的催化及其固定化的研究具有重要意义。低共熔溶剂(Deep eutectic solvent,DES)是近年来发现的一种新型的富含氢键的离子液体,具有热稳定性与化学稳定性良好,生物亲和性高和使用成本低等特点,可以用于脂肪酶的非水相合成与催化。本论文以米曲霉CJLU-31脂肪酶(AOCL)为模型酶,研究了DES/水双相体系在脂肪酶催化与固定化过程中的作用,并分别考察了游离脂肪酶在DES/水双相体系中的酶学性能,DES/水双相体系中制备脂肪酶杂化磷酸钙复合物(AOCL@Ca P in DES)及其催化性能和在生物柴油中的应用。主要研究内容如下:1.将DES/水的双相体系用于在脂肪酶催化反应过程,考察了水相体系和DES/水双相体系中脂肪酶的催化性能。相比其他低共熔溶剂,脂肪酶在氯化胆碱:甘油(ChCl:Gly,简写C-Gly)与水的双相体系中酶活力表现最好,并且当体系中水的比例为20%时脂肪酶酶活力可达280%。双相体系中脂肪酶的催化性能研究表明,在70 C热处理30 min后,在20%的C-Gly/水双相体系中AOCL可保持91%的酶活残留率,但水相中的脂肪酶仅剩27%的酶活残留率,表明脂肪酶在双相体系中具有更高的热稳定性;而且,相比于水相,在双相体系中的脂肪酶也表现出更好的变性剂耐受性和储存稳定性。脂肪酶在两种体系中的动力学参数表明,在C-Gly/水双相体系中脂肪酶具有对长链酯更好的亲和性。2.基于酶-无机杂化纳米技术在低共熔溶剂/水的双相体系中脂肪酶杂化磷酸钙复合物(AOCL@Ca P in DES)的制备及其催化性能的考察。优化了制备条件:在含水量10%的ChCl:Gly/水双相体系中,Ca终浓度为40 m M、PO终浓度为15 m M和脂肪酶浓度0.01 mg/m L的条件下,所制备的AOCL@Ca P in DES酶活回收率为145%,但是在相同条件下水相体系中制备的AOCL@Ca P酶活回收率仅为78%。经过测定催化性能发现,双相体系中制备的AOCL@Ca P in DES的温度稳定性、变性剂耐受性、酶的底物选择性以及重复使用性能均优于水相中制备的AOCL@Ca P。双相体系中AOCL@Ca P in DES组装过程研究表明,水是以液滴的形式悬浮在Ch Cl:Gly/水双相体系中,脂肪酶的自组装过程发生在液滴的表面,对脂肪酶产生了界面激活的作用。圆二色谱检测表明在Ca和DES的协同作用下脂肪酶二级结构发生了变化,α-helix减少,β-sheet增多。分子模拟结果进一步表明,β-sheet含量的增多可以使脂肪酶分子内部的氢键数增多,进而提高酶的刚性和稳定性,同时氢键的增多也可拉近活性区域残基间距,增大了底物进入酶分子内部与活性中心接触的机会。3.双相体系中制备的AOCL@CaP in DES在低共熔溶剂/水双相催化体系转化生物柴油。优化了AOCL@CaP in DES在DES/水双相体系转化生物柴油的条件,在氯化胆碱:山梨醇(C-DS)溶剂:水:油(v/v)=5:1:1的双相体系中,AOCL@Ca P in DES添加量为10%,醇油比为20:1,搅拌转速为300 rpm、反应温度为45 C,反应时间为19 h的条件下,AOCL@Ca P in DES催化大豆油转酯化得到生物柴油的产率可达87%,在重复使用10次后产率保持在50%,这一应用性能优于水相中制备的AOCL@CaP(40%)和Novozyme 435(1%)。

关键词：低共熔溶剂固定化脂肪酶界面激活磷酸钙生物柴油