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VK2依赖的GGCX/MGP维持附睾管腔钙稳态的机制和对男性生育的影响

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VK2依赖的GGCX/MGP维持附睾管腔钙稳态的机制和对男性生育的影响

作者：马赫中国人民解放军空军军医大学

学位级别：硕士

【研究背景】附睾是哺乳动物精子成熟、获得受精能力、储存和保护的重要器官。附睾管腔的低钙环境可以维持精子静息状态,防止精子提前激活。附睾管腔钙离子浓度异常升高将导致精子过早活化,精子运动功能降低,甚至雄性生育缺陷或不育,然... 详细信息

【研究背景】附睾是哺乳动物精子成熟、获得受精能力、储存和保护的重要器官。附睾管腔的低钙环境可以维持精子静息状态,防止精子提前激活。附睾管腔钙离子浓度异常升高将导致精子过早活化,精子运动功能降低,甚至雄性生育缺陷或不育,然而附睾管腔钙稳态的调节机制尚未被充分阐明。维生素K2(vitamin K2,VK2)循环依赖的γ-谷氨酰基羧化酶(γ–glutamyl carboxylase,GGCX)与其底物基质Gla蛋白(matrix Gla protein,MGP)在血管、肾脏等组织局部的钙稳态调节中发挥重要作用。MGP在VK2充足的条件下被GGCX羧化激活后可与钙离子或钙晶体结合,防止组织局部游离钙浓度过高和钙盐沉积。为探究这种重要的钙稳态调节是否在附睾低钙环境的维持中发挥作用,本实验首先检测了VK循环相关分子在WT大鼠附睾中的表达和定位,然后通过构建华法林诱导的VK2缺乏大鼠模型,观察在VK2循环被抑制后大鼠生育相关表型的改变及附睾组织和附睾液钙含量的变化,最后在不育的弱精症患者中检测GGCX和MGP外显子的SNP位点,进一步探究GGCX和MGP对男性生育功能维持的临床意义。【研究方法】1.采用实时定量PCR检测VK循环相关分子VKORC1,GGCX,MGP在大鼠附睾,睾丸和肾脏等器官的表达。通过Western blot和免疫荧光(immunofluorescence,IF)技术,观察GGCX和MGP在大鼠附睾组织中的表达定位情况。2.通过Western blot检测MGP与其潜在结合蛋白在不同钙离子浓度的附睾和肾脏组织匀浆中的结合能力,并利用蛋白胶内酶切与LC-MS/MS检测和生物信息学分析,筛选出MGP的潜在结合蛋白可能参与的信号通路。3.通过皮下注射华法林和VK1来构建VK2缺乏大鼠模型,观察大鼠体重和肝肾等重要脏器重量的变化。采用交配实验和计算机辅助精子分析(computer assisted semen analysis system,CASA)检测大鼠生育力和精子运动能力的改变,并收集精子进行涂片,通过IF技术在共聚焦显微镜下观察统计大鼠精子形态变化。4.采用苏木精伊红染色(hematoxylin and eosin staining,H&E)观察VK2缺乏大鼠附睾上皮形态变化,并利用IF技术分别标记附睾上皮主细胞和亮细胞的特异性标志物E-caherin和B1-V-ATPase及细胞骨架蛋白Phalloidin;同时观察GGCX和MGP的定位情况。此外,还利用TUNEL染色检测大鼠附睾上皮及管腔内凋亡信号,综合分析大鼠附睾上皮形态和功能的改变。5.通过X射线荧光光谱分析(X-ray fluorescence imaging,XRF)技术检测附睾组织冰冻切片钙离子分布情况,并利用电感耦合等离子质谱(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)分析各组大鼠附睾液中钙离子相对浓度的改变。此外,利用IF检测大鼠附睾MGP羧化水平的变化。6.对199例不育的特发性弱精症患者和110例生育能力正常的对照组的血液样本进行高通量测序检测GGCX和MGP全外显子的SNP位点。基于R语言对检测出的SNP位点进行关联分析,筛选出具有统计学意义的突变。【研究结果】1.VK循环相关分子GGCX,MGP,VKORC1均在大鼠附睾中有表达,其中MGP在附睾中的表达显著高于睾丸、肾脏等器官。GGCX和MGP均在附睾头部开始有表达,在附睾体部和尾部表达量较高。二者的共定位主要集中在附睾体部和尾部的上皮细胞及管腔中的囊泡状结构,而在起始部和头部的共定位不明显。2.在WT大鼠肾脏和附睾组织中,MGP均在低钙离子浓度环境形成2 k Da大小的蛋白复合体,随着钙离子浓度升高,蛋白复合体形成受阻。LC-MS/MS结果显示,该蛋白复合体中除MGP外,还含有ESCRT和Rab蛋白家族的分子。3.VK2缺乏大鼠的体重和重要脏器的重量/体重比与对照组相比无明显差异,但生育力和精子运动能力明显降低,降低程度与华法林给药剂量相关。此外,VK2缺乏大鼠精子颈部弯折、头部离断等异常形态比例显著增高,但其睾丸的生精功能未受明显影响。4.VK2缺乏大鼠附睾管腔中可见脱落的上皮细胞,附睾基底部的平滑肌细胞骨架受损,主细胞和亮细胞标志物表达减弱,管腔脱落的细胞及细胞碎片内可见亮细胞标志物信号,且管腔内可见凋亡信号。5.VK2缺乏大鼠附睾上皮钙含量明显升高,附睾液中钙浓度升高,附睾MGP羧化水平降低。6.测序结果显示,特发性弱精症患者GGCX第8个外显子中rs699664位点的突变在隐性模型下分析具有统计学差异。MGP未发现有统计学差异的突变位点。【研究结论】1.VK循环相关分子在大鼠附睾的高表达提示VK在大鼠附睾的微环境调节中扮演重要角色。GGCX和MGP的共定位结果表明,二者协同在大鼠附睾的体部和尾部发挥重要作用。2.M

关键词：维生素K循环钙稳态细胞间通讯附睾微环境精子成熟男性生育

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男性生育控制的化学方法

国际生殖健康/计划生育杂志 1982年第4期 157-160页

作者： Nieschlag E ,姜麟忠

欧洲医学研究委员会(EMRC)建于七十年代初,其人类生育咨询小组是1978年建立的专业机构。该小组认为:在人类生育研究方面,应把男性生育控制放在优先地位,并建立相应的专业研究机构。在1980年10月13～14日在波恩召开了“男性生育控制的化... 详细信息

欧洲医学研究委员会(EMRC)建于七十年代初,其人类生育咨询小组是1978年建立的专业机构。该小组认为:在人类生育研究方面,应把男性生育控制放在优先地位,并建立相应的专业研究机构。在1980年10月13～14日在波恩召开了“男性生育控制的化学方法”专家会议。现将内容概括如下。一、世界卫生组织(WHO)有关人类生殖研究、发展和人员培训的专门计划WHO通过“男性生育调节方法特别工作组”8年来进行了有关抑素(Inhibin)

关键词：男性生育抗生育剂精子发生精子数棉酚环丙氯地孕酮类似物同型物化学方法雄性大鼠

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透明带与男性生育

中华男科学杂志 2005年第7期11卷 536-538页

作者：刘佳刘睿智吉林大学基础医学院细胞生物学教研室吉林长春130021

卵透明带(ZP)在精卵识别、结合、穿透以及阻止多精受精和保护着床前胚胎等方面起关键作用,与男性生育关系密切。本文就透明带的组成、分子结构、生物学功能及其在男性生育领域的应用进行综述。

关键词：透明带男性生育顶体反应

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男性生育调节学术讨论会概况

医学研究杂志 1985年第3期 81-82页

作者：许侠

男性生育调节学术讨论会于1984年12月14～16日,由中华人民共和国卫生部和世界卫生组织在南京联合召开,与会代表约160人,其中包括10个国家和地区的19位外宾。会议交流论文37篇,另有45篇论文摘要进行了书面交流。会议内容涉及6个专题:世... 详细信息

男性生育调节学术讨论会于1984年12月14～16日,由中华人民共和国卫生部和世界卫生组织在南京联合召开,与会代表约160人,其中包括10个国家和地区的19位外宾。会议交流论文37篇,另有45篇论文摘要进行了书面交流。会议内容涉及6个专题:世界卫生组织男性生育调节方法,棉酚的研究(包括生物医学和化学),激素抗生育药,输精管结扎,精液评价与新抗生育药前瞻。

关键词：男性生育生物医学学术讨论会棉酚

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男性生育调节研究的进展与趋势

中国临床医生杂志 1986年第3期 48-49页

作者：傅惠祥广东省从化县卫生局

近年来,男性生育调节研究有较大的进展,主要表现如下:1.男性学的建立:近十年来,已认识到男性生育调节对控制人类生殖有着重要的意义。因为:①成年男子每时每刻都在产生生殖细胞(精子),其数量每月可高达几十亿,而成年女子一般每月只能排... 详细信息

近年来,男性生育调节研究有较大的进展,主要表现如下:1.男性学的建立:近十年来,已认识到男性生育调节对控制人类生殖有着重要的意义。因为:①成年男子每时每刻都在产生生殖细胞(精子),其数量每月可高达几十亿,而成年女子一般每月只能排出一个生殖细胞(卵子);②女子排卵有周期性,而男子排精却无周期性,有生殖活力的精子不受时间限制;③

关键词：男性生育男性学抗生育人类性医学精子发生棉酚输精管结扎术

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男性生育关键因子及其调节机制研究

医学研究杂志 2007年第6期36卷 86-87页

作者：石其贤陈文颖倪崖浙江省医学科学院杭州310013

我国是一个人口大国,本世纪将面临三大挑战.①人口基数大,每年新生儿达2000多万,控制人口过快增长乃是当前不可忽视的重大社会问题;②出生缺陷居高不下,每年有30多万出生缺陷婴儿降生;③1200多万对不孕不育夫妇求助医疗服务.受精不仅关... 详细信息

我国是一个人口大国,本世纪将面临三大挑战.①人口基数大,每年新生儿达2000多万,控制人口过快增长乃是当前不可忽视的重大社会问题;②出生缺陷居高不下,每年有30多万出生缺陷婴儿降生;③1200多万对不孕不育夫妇求助医疗服务.受精不仅关系到生殖生物学诸多重大问题,而且与当今人类生育控制,不孕不育症的诊断和治疗密切相关.

关键词：男性生育调节因子不孕不育夫妇出生缺陷生殖生物学不孕不育症社会问题

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