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不可逆性电穿孔介导HPV16 E6 shRNA干扰质粒对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响

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吉林大学学报（医学版） 2015年第6期41卷 1107-1112,I0011页

作者：王智亮余腾骅秦琴吴雨桐张文倩华媛媛熊正爱周玮重庆医科大学附属第二医院妇产科重庆400010 重庆医科大学附属第一医院内分泌乳腺外科重庆400016 重庆市妇幼保健院产科重庆400013

目的:探讨利用治疗剂量脉冲电场产生不可逆电穿孔(IRE)介导HPV16E6shRNA干扰质粒进入细胞的可行性,阐明二者共同作用对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响及其作用机制。方法:将HPV16E6基因特异性干扰序列插入pGenesil-1质粒,构建HPV16E6shRNA真... 详细信息

目的:探讨利用治疗剂量脉冲电场产生不可逆电穿孔(IRE)介导HPV16E6shRNA干扰质粒进入细胞的可行性,阐明二者共同作用对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响及其作用机制。方法:将HPV16E6基因特异性干扰序列插入pGenesil-1质粒,构建HPV16E6shRNA真核表达载体,将10个电压为800V、脉宽100μs、频率1Hz的IRE作用于SiHa细胞与HPV 16E6shRNA干扰质粒的混悬液,根据处理因素组合,分为空白对照组、IRE处理组、pGenesil-N组、pGenesil-N+IRE组、pGenesil-E6组和pGenesil-E6+IRE组。在荧光显微镜下观察SiHa细胞绿色荧光蛋白(GFP)的表达,计算GFP表达效率;RT-PCR法检测HPV 16E6mRNA表达水平,Western blotting法检测HPV16E6蛋白、P53及PCNA蛋白表达水平,CCK-8法检测各组SiHa细胞增殖能力的变化。结果:成功构建HPV16E6shRNA真核表达载体,IRE处理后24h细胞即可见到绿色荧光;与IRE组比较,pGenesil-E6+IRE组E6 mRNA表达水平下降(P<0.05),E6蛋白表达水平降低(P<0.05),P53蛋白表达水平增高(P<0.05),PCNA表达水平下降(P<0.05);CCK-8法检测,与pGenesil-E6组比较,pGenesil-E6+IRE组细胞增殖活性下降更明显(P<0.05)。结论:治疗剂量的IRE可介导外源基因进入细胞,二者联合作用能明显抑制宫颈癌SiHa细胞增殖。

关键词：电穿孔干扰质粒宫颈肿瘤细胞增殖

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电穿孔载药技术在高分子囊泡中的应用

电穿孔载药技术在高分子囊泡中的应用

电穿孔介导的人对氧磷酶1基因在小鼠原代骨骼肌细胞中的转移与表达(英文)

中国化学会2017全国高分子学术论文报告会

作者：刘思琦王林格华南理工大学

高分子囊泡（Polymer vesicles或Polymersomes）是一类中空球体,类似球壳的分子膜是由两亲性嵌段共聚物有序组合而成的。与低分子脂质体相比,高分子囊泡外膜更加稳定和坚固,同时其中空内腔可用于包裹水溶性药物、抗体和基因片段等生物... 详细信息

高分子囊泡（Polymer vesicles或Polymersomes）是一类中空球体,类似球壳的分子膜是由两亲性嵌段共聚物有序组合而成的。与低分子脂质体相比,高分子囊泡外膜更加稳定和坚固,同时其中空内腔可用于包裹水溶性药物、抗体和基因片段等生物大分子,因此在许多领域有非常广泛的应用,特别是在生物医药领域。目前,将负载物载入高分子囊泡的方法是在高分子囊泡形成过程中加入负载物,这种载药高分子囊泡的制备路线存在高分子囊泡尺寸不均匀的问题,大尺寸高分子囊泡不能被细胞吞噬,小尺寸高分子囊泡载药效果不好。而电穿孔法（Electroporation）就是一种新颖的高分子囊泡负载药物方法,用于已成形高分子囊泡的载药。该法通过外加电场给高分子囊泡一个瞬时外加脉冲使囊泡的膜结构发生改变,产生一些小孔洞用于药物通过和负载。通过电穿孔法载药可以大大提高载药效率并解决了传统载药方法中高分子囊泡尺寸不均匀的问题。

关键词：高分子囊泡电穿孔载药荧光分子

来源： cnki会议评论

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cnki会议

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中国生物化学与分子生物学报 2010年第1期26卷 88-94页

作者：张驰朱洁臧宇辉张峻峰秦浚川南京市产品质量监督检验院南京210028 南京大学医药生物技术国家重点实验室南京210093

非病毒载体介导的外源基因在哺乳动物骨骼肌细胞中的表达往往受限于基因转移效率的低下.本文利用电穿孔为基因转移方法,研究了人对氧磷酶基因(PON1)在原代培养的小鼠骨骼肌成肌细胞和成熟肌管中的转移与表达.在上述细胞中加入PON1的真... 详细信息

非病毒载体介导的外源基因在哺乳动物骨骼肌细胞中的表达往往受限于基因转移效率的低下.本文利用电穿孔为基因转移方法,研究了人对氧磷酶基因(PON1)在原代培养的小鼠骨骼肌成肌细胞和成熟肌管中的转移与表达.在上述细胞中加入PON1的真核表达质粒后实施一定条件的电穿孔,通过测定不同时间点培养基与细胞裂解液中芳香酯酶活性的变化以衡量PON1的表达与分泌.结果显示,PON1在成肌细胞中表达的最佳电穿孔条件为800 V/cm,20 ms and 50μF;在肌管中为700 V/cm,20 ms and 50μF.在此条件下,细胞存活率均达75%以上,且表达的蛋白均可有效分泌.RT-PCR分析同样验证了PON1 mRNA在骨骼肌细胞中的高效表达.电穿孔介导的PON1基因表达效率显著高于传统的基因转移方法如磷酸钙法和阳离子脂质体法.因此,以不同分化阶段的骨骼肌细胞为靶细胞,通过电穿孔介导外源基因表达切实可行,并可能在细胞工程与基因治疗等领域均具有潜在的应用前景.

关键词：对氧磷酶1(PON1) 电穿孔成肌细胞肌管基因转移

银胶浓度对电穿孔获取细胞内表面增强拉曼光谱的影响

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生物化学与生物物理进展 2011年第10期38卷 961-966页

作者：俞允林居强黄浩陈燕坪冯尚源苏颖陈杰斯陈荣福建师范大学医学光电科学与技术教育部重点实验室福建省光子技术重点实验室福州350007 福建中医药大学中西医结合学院福州350108 福建省肿瘤医院福州350001

探究了银胶浓度对于电穿孔导入银纳米粒子获取细胞内表面增强拉曼光谱(SERS)的影响.对6组含有不同浓度银胶的鼻咽癌细胞C666进行电穿孔,测量电穿孔后活细胞内表面增强拉曼光谱.以测得的SERS信号、光谱强度积分值和谱线重复性为指标,研... 详细信息

探究了银胶浓度对于电穿孔导入银纳米粒子获取细胞内表面增强拉曼光谱(SERS)的影响.对6组含有不同浓度银胶的鼻咽癌细胞C666进行电穿孔,测量电穿孔后活细胞内表面增强拉曼光谱.以测得的SERS信号、光谱强度积分值和谱线重复性为指标,研究银胶浓度对电穿孔获取细胞内SERS的影响,对电穿孔后活性C666细胞内SERS平均光谱进行初步谱峰归属.在脉冲电场强度875 V/cm,脉冲持续时间1 ms,电脉冲2次的条件下,每500μl电击缓冲液中含有50μl银胶时测得的细胞内SERS光谱信噪比高,且光谱具有较好的重复性.结果说明,正确选择银胶浓度可以提高电穿孔-SERS效果,获取高质量的活细胞内SERS信号.此研究有助于扩展表面增强拉曼光谱的应用,包括实时检测分析活细胞内生化成分及分布,实时监测细胞生化变化过程等.

关键词：表面增强拉曼散射(SERS) 电穿孔 C666细胞银胶浓度

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用于流式细胞电穿孔的微流控芯片的研究

电子器件 2019年第3期42卷 545-550页

作者：耿杨烨潘任豪王颖瀛吴成均初慧杰朱真东南大学电子科学与工程学院

细胞转染在基因工程、细胞生物学、临床医疗等领域有着十分重要的应用。我们提出一种集成微电极的微流控电穿孔芯片,可实现有效的单细胞电转染。通过微纳制造工艺在玻璃衬底上加工三组叉指微电极和一组平行微电极,利用软光刻工艺制备PDM... 详细信息

细胞转染在基因工程、细胞生物学、临床医疗等领域有着十分重要的应用。我们提出一种集成微电极的微流控电穿孔芯片,可实现有效的单细胞电转染。通过微纳制造工艺在玻璃衬底上加工三组叉指微电极和一组平行微电极,利用软光刻工艺制备PDMS微流体通道层,经表面改性后,将两者键合,形成微流控电穿孔芯片。实验中采用HeLa细胞进行电穿孔操作,在15Vpp (电压峰峰值),300kHz交流电压下,有效导入荧光染料的活细胞占总数的48.72%,成功实现了单细胞电穿孔。

关键词：微流控细胞转染电穿孔转染效率

电穿孔介导外源性基因转染大鼠骨骼肌卫星细胞的可行性

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中国组织工程研究与临床康复 2008年第12期12卷 2206-2210页

作者：董少红李江华罗林杰高虹梁新剑庞新利张鹏暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院心内科广东省深圳市518020

目的：电穿孔的原理是应用短暂高压电脉冲使细胞膜形成纳米级的微孔,外源DNA通过这些微孔或者伴随微孔关闭时膜成分的再分布而直接进入细胞内。实验拟验证电穿孔法介导外源性基因转染大鼠骨骼肌卫星细胞的可行性和转染效率,以获得基因... 详细信息

目的：电穿孔的原理是应用短暂高压电脉冲使细胞膜形成纳米级的微孔,外源DNA通过这些微孔或者伴随微孔关闭时膜成分的再分布而直接进入细胞内。实验拟验证电穿孔法介导外源性基因转染大鼠骨骼肌卫星细胞的可行性和转染效率,以获得基因治疗自体移植的载体。方法：实验于2006-10/2007-09在暨南大学医学院中心实验室完成。①材料：清洁级1～3d龄SD大鼠3只,购于广东省医学实验动物中心,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。基因转染过程应用的pEGFP-N1质粒由本课题组保存。②实验方法：大鼠颈椎脱臼处死,在无菌条件下分离四肢肌组织,剪碎成1mm×1mm×1mm组织块,采用改良酶消化法分离骨骼肌卫星细胞,再以差速贴壁和非连续梯度离心法分两步进行纯化,细胞均匀增殖至培养面80%或局部增殖过度密集时胰酶消化传代。取第3代处于对数生长期的骨骼肌卫星细胞,消化离心后调整细胞数为2.0×10^7 L^-1,取400μL注入4mm电击杯中,再加入pEGFP-N1质粒15μg混匀,将电击杯放入电转槽静置5mim。电击条件为电容1050μF,电压180V,脉冲时间20ms,脉冲数2次,脉冲间隔时间1min,电击缓冲液为不含钙镁的磷酸盐缓冲液。放电后电击杯冰浴,并用不含血清的DMEM清洗,将清洗液转入培养瓶中,4h后换用体积分数为0.1胎牛血清的完全培养基,于37℃、体积分数为0.05的CO2无菌细胞培养箱中培养。同时设不加质粒的空白对照。③实验评估：倒置显微镜下观察细胞生长状况。免疫细胞化学检测肌动蛋白的表达。随机计数多个低倍视野,计算电穿孔pEGFP-N1质粒转染卫星细胞的效率。绘制细胞生长曲线,并用流式细胞仪测量细胞周期。结果：①骨骼肌卫星细胞的形态：原代培养48～72h细胞完全贴壁,呈梭形或纺垂形,长轴平行排列,胞核圆形,核仁明显。5d时细胞可伸出一个或数个突起。随培养时间的延长,卫星细胞连接成网状。当延迟分瓶或使用分化培养基,相邻的细胞会融合成肌管,继而形成串联,且能看见肌管的跳动。传代后细胞形态呈更加一致的梭形,6h即完全贴壁,细胞增殖速度明显加快,生长更为旺盛。传至8代卫星细胞出现老化现象。②免疫细胞化学检测：骨骼肌肌动蛋白呈阳性表达。③转染效率：pEGFP-N1质粒电转染8h后即可看见散在发绿色荧光的卫星细胞,48～72h达高峰,阳性表达率约35%。④细胞生长曲线及细胞周期检测：电转染细胞接种后第3天进入对数生长期,第7天由于接触抑制导致增殖速度减慢,81.5%处于G0/G1期,19.3%处于S＋G2＋M期。未转染细胞生长曲线、细胞周期均与其相似。结论：电穿孔法介导外源性基因表达于大鼠骨骼肌卫星细胞具有较高的转染效率,操作简便,重复性好,且对卫星细胞生物学行为无明显影响。

关键词：骨骼肌卫星细胞基因转染绿色荧光蛋白电穿孔原代培养

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电穿孔作用将外源基因导入中华蜜蜂卵的研究

安徽农业大学学报 2009年第2期36卷 222-225页

作者：郭冬生曾志将孙亮先宜春学院江西省高校应用化学与化学生物学重点实验室宜春336000 江西农业大学动物科技学院南昌330045 泉州师范学院模式生物研究中心泉州362000

将中华蜜蜂卵与带有绿色荧光蛋白基因的质粒DNA混合,经电穿孔作用后,人工孵化蜜蜂卵,并对孵化的幼虫进行检测。结果筛选出一组较理想的中华蜜蜂卵电穿孔参数(750V.cm-1,100μs,1);通过荧光检测,电击卵孵化的幼虫体内可以表达EGFP基因,... 详细信息

将中华蜜蜂卵与带有绿色荧光蛋白基因的质粒DNA混合,经电穿孔作用后,人工孵化蜜蜂卵,并对孵化的幼虫进行检测。结果筛选出一组较理想的中华蜜蜂卵电穿孔参数(750V.cm-1,100μs,1);通过荧光检测,电击卵孵化的幼虫体内可以表达EGFP基因,阳性表达率最高可达1.05%,且外源DNA转染早期卵的效率显著高于晚期卵。结果表明电穿孔作用成功地将外源基因引入中华蜜蜂卵内,质粒DNA转染中华蜜蜂卵的效率与卵的生长时期有关。

关键词：电穿孔绿色荧光蛋白基因基因转移中华蜜蜂卵

电穿孔介导质粒基因在皮肤和线性伤口中的表达

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中华整形外科杂志 2008年第5期24卷 390-393页

作者：高振宋楠武晓莉曹谊林刘伟上海交通大学医学院附属第九人民医院整形外科上海市组织工程研究中心上海200011

目的研究在线性伤口中进行电穿孔基因转染的可行性。方法于12只Sprague—Dawley大鼠背部皮肤内注射增强型绿色荧光蛋白（EGFP）质粒（1μg／μl）后，在注射局部进行电穿孔（800V／cm，6个方波，每个持续20ms，间隔为200ms），电穿孔后... 详细信息

目的研究在线性伤口中进行电穿孔基因转染的可行性。方法于12只Sprague—Dawley大鼠背部皮肤内注射增强型绿色荧光蛋白（EGFP）质粒（1μg／μl）后，在注射局部进行电穿孔（800V／cm，6个方波，每个持续20ms，间隔为200ms），电穿孔后24h在电穿孔部位做线性切口，于第2、4、6、14天收集标本，观察EGFP表达并计算其真皮内积分光密度（IOD），然后进行HE染色。结果电穿孔使EGFP在表皮、真皮以及肉膜内表达，真皮内表达量在第2天最高（IOD=3．50±1．45），至第14天消失，而单纯质粒注射真皮内无表达（IOD=0）。结论电穿孔能够介导质粒在线性伤口中高效而广泛地表达。

关键词：电穿孔线性伤口基因转染

研发一种基于电穿孔和纳米颗粒的骨转移治疗平台

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国际医学放射学杂志 2018年第2期 216-217页

作者： M.P.Melancon T.A.Figueira D.T.Fuentes L.Tian Y.Qiao J.H.Gu 刘春明 Department of Interventional Radiology the University of Texas M.D.Anderson Cancer Center

摘要目的在兔VX2胫骨肿瘤模型中单独应用不可逆电穿孔(IRE)或联合应用阿霉素-超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIO-DOX),评估IRE后骨髓细胞中纳米孔的形成和IRE

关键词： DOX 电穿孔