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毛细管电泳用于组蛋白去乙酰化酶活性分析方法的研究

毛细管电泳用于组蛋白去乙酰化酶活性分析方法的研究

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作者：汪铃山东大学

学位级别：硕士

组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases,HDACs)负责催化组蛋白的水解,与多种细胞进程密切相关,是抗癌药物研究的重要靶点,建立准确高效的HDACs抑制剂筛选方法对于新药开发具有十分重要的现实意义。毛细管电泳(Capillary electrophoresi... 详细信息

组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases,HDACs)负责催化组蛋白的水解,与多种细胞进程密切相关,是抗癌药物研究的重要靶点,建立准确高效的HDACs抑制剂筛选方法对于新药开发具有十分重要的现实意义。毛细管电泳(Capillary electrophoresis,CE)作为高效、快速的微量分析技术,具有分离效率高、检测时间短、样品消耗量少、自动化程度高等突出优点。因此本论文建立了基于CE的研究方法,主要内容如下:(1)本文建立了用于HDACs动力学参数测定及抑制剂筛选的基于毛细管的固定化酶(CE-IMER)方法。利用聚多巴胺(Polydopamine,PDA)易沉积到毛细管内壁的特性,将毛细管内壁上涂覆上聚多巴胺涂层并对其进行表征,酶与聚多巴胺间通过弱作用力连接进而被固定在毛细管内壁上,证明了 IMER的成功构建,并进一步优化了多巴胺的浓度、酶固定化时间、底物与酶孵育时间以及多巴胺的修饰时间等条件,在建立好的方法上重复进样底物40次以上时,该固定化酶活性依然能保持初始活性的90%以上,表明了建立的CE-IMER具有良好的稳定性。用所建立的方法测定了固定化酶的动力学参数(Km和Vmax)及其抑制剂的IC50值,与荧光法测定的游离酶结果接近,证实了方法的可靠性,最后将CE-IMER应用到抑制剂筛选中,成功从十多种化合物中筛选出了几种有潜力的抑制剂。(2)为进一步从对HDACs靶点有活性的化合物中筛选出异构体选择性抑制剂,开发了用于HDAC8动力学参数测定及抑制剂筛选的电泳调控微分析(EMMA)方法学。我们考察了电泳分析的最佳条件,最终的实验条件为:贝克曼电泳仪配备二极管阵列检测器,检测波长为327 nm,柱温37℃,熔融石英毛细管(内径75 μm,有效长度为50 cm),Tris-HCl(100 mM,pH=8.0)为背景缓冲溶液,孵育缓冲溶液为Tris-HCl(25 mM,pH=8.0,137 mM NaCl,2.7 mM KCl,1 mM MgCl2,1 mg/mL BSA)溶液,分离电压为 15 kV,底物和酶在3 kV的混合电压下混合0.2 min,孵育时间为5 min。酶解反应后的产物和未反应的底物在毛细管电泳中得到分离检测,利用建立的方法测定了 HDAC8的动力学参数(Km和Vmax)及其两种代表性抑制剂伏立诺他(SAHA)与PCI-34051的IC50值,此方法与传统的荧光分析法相比具有自动化程度高、操作简便、不受假阳性结果干扰等突出优点。总而言之,基于毛细管电泳,本研究开发了两种不同方法用于HDACs的活性分析及抑制剂筛选。其中CE-IMER方法制备的固定化酶微反应器稳定性好,酶经多次重复运行依然保持良好活性,能大大节省酶的使用量,这对于尤其昂贵稀缺的酶样本来说具有十分重要的现实性意义;EMMA法的突出优点在于能够在线进行抑制剂筛选及酶活性检测,将酶促反应的发生场所及底物产物的分离检测场所都集中在了一根毛细管柱内,大大减少了人工误差,这种高度自动化的研究方法充分满足现代药物学高速发展的需求。

关键词：毛细管电泳基于毛细管的固定化酶法电泳调控微分析法 HDACs抑制剂酶动力学参数酶抑制剂筛选

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氨肽酶N抑制剂毛细管电泳在线筛选方法的研究

氨肽酶N抑制剂毛细管电泳在线筛选方法的研究

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作者：王海荣山东大学

学位级别：硕士

氨肽酶N(Aminopeptidase N, APN)是属于锌离子依赖性金属蛋白酶的一类膜结合型外肽酶,以同源二聚体结构存在于细胞膜。APN广泛存在于大脑、肾、肝脏、胎盘和子宫等。与正常细胞相比,APN在癌细胞表面高水平表达,对肿瘤细胞的侵袭、转移... 详细信息

氨肽酶N(Aminopeptidase N, APN)是属于锌离子依赖性金属蛋白酶的一类膜结合型外肽酶,以同源二聚体结构存在于细胞膜。APN广泛存在于大脑、肾、肝脏、胎盘和子宫等。与正常细胞相比,APN在癌细胞表面高水平表达,对肿瘤细胞的侵袭、转移和肿瘤新血管的形成起着重要的作用,被称为肿瘤细胞表面相关抗原CD13。近年来,以APN为靶点的肿瘤治疗策略迅速发展起来,APN抑制剂已经成为抗癌药物研究的热点课题。因此,发展和建立快速、可靠及高通量APN抑制剂筛选方法对于研发新药物具有十分重要的现实意义。毛细管电泳(Capillary Electrophoresis, CE)具有样品消耗量少、分离效率高、分析时间短及自动化程度高等优点,被广泛应用于酶反应的测定中,成为了酶活性及酶抑制剂筛选研究常使用的分析手段。电泳调控微分析法(Electrophoretically Mediated Microanalysis, EMMA)是以毛细管电泳柱进样端约1.5～2.0 cm部分作为反应的微室,将酶溶液和底物溶液依次进样到毛细管中,接着施加一段时间小电压让酶和底物溶液在毛细管中充分混合并反应,当酶促反应进行完毕后,加一高电压对酶促反应生成的产物和未反应的底物进行分离,随后进行检测。该法在同一根毛细管内集成了混合、反应、分离及检测的全过程。本课题建立了APN抑制剂的毛细管电泳在线筛选方法,为抗肿瘤药物的研究开发提供了新的筛选模型。主要研究工作和成果如下：1.本文建立了APN抑制剂EMMA筛选方法,并将该法应用于APN抑制剂的活性筛选研究中。电泳条件采用熔融石英毛细管(内径75μm,有效长度为50cm),柱温37℃,分离体系30 mM HEPES缓冲溶液含40 mM脱氧胆酸钠(pH7.7),分离电压25 kV,二极管阵列检测器(DAD)检测波长为380 nm。EMMA法中,孵育缓冲溶液(50 mM磷酸盐缓冲溶液,pH 7.7)、APN溶液、底物溶液(含内标)及孵育缓冲溶液液依次在0.5 psi压力下分别进样10 s,在±2.0 kV各加压6s使酶和底物混合,在+1.0 kV电压,孵育2 min后,在毛细管两端加25 kV电压,经酶解后生成的产物、内标与未完全反应剩余的底物,在电渗作用下进入毛细管分离区,依据各自迁移速率的不同而实现电泳分离。利用建立的方法测定了氨肽酶N的动力学参数(Km和Vmax)发现测得的动力学参数值与文献报道值一致,以此证明在该模型中酶的活性保持良好。以乌苯美司为阳性对照,用所建立的方法制作量-效曲线同时测定其IC50,与文献报道的酶标法测定值比较,验证了筛选方法的可行性。最后采用EMMA氨肽酶N抑制剂筛选方法从山东大学药学院药物化学研究所提供的以APN为靶点合成的29个合成新化合物(包括2个化合物粗合成物,含量约50%)进行APN抑制剂的筛选研究。2.通过细胞膜制备技术得到高表达APN的人卵巢透明细胞癌细胞(ES-2)的细胞膜,测定细胞膜蛋白质含量和膜APN活性对其进行表征后,将活性细胞膜填充至毛细管进样端形成酶促反应微室,毛细管剩余部分作为酶促反应产物和未反应完的底物的分离通道,建立了APN抑制剂的细胞膜毛细管电泳筛选方法。乌苯美司作为阳性抑制剂,用所建立的方法制作量-效曲线同时测得乌苯美司的半抑制剂浓度IC50值为19.3μM,与文献报道的乌苯美司的IC50值(20.5μM)结果一致。顺铂为阴性抑制剂并选择以低表达APN的人慢性髓系白血病细胞(K562)的细胞膜作阴性对照实验,验证了筛选方法的可行性。利用建立的细胞膜毛细管电泳法测定了细胞膜上APN的酶促动力学参数(Km)发现测得的细胞膜上APN的米氏常数(Km=0.82 mM)大于游离APN米氏常数(Km=0.34 mM),表明细胞膜上的APN与底物亲和力小于游离形式存在的APN与底物的亲和力。最后采用细胞膜毛细管电泳筛选方法对合成的新化合物进行APN抑制剂的筛选研究。

关键词：氨肽酶N 毛细管电泳电泳调控微分析法细胞膜 APN抑制剂动力学参数酶抑制剂筛选

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组蛋白去乙酰化酶抑制剂毛细管电泳在线活性筛选方法的研究

组蛋白去乙酰化酶抑制剂毛细管电泳在线活性筛选方法的研究

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作者：李悦山东大学

学位级别：硕士

组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase,HDACs)可催化水解底物ε-N-乙酰化赖氨酸残基脱除乙酰基,其底物包括组蛋白或非组蛋白的底物。该酶在表观遗传调控和多种细胞的调节过程中起关键作用,特别是该酶在许多肿瘤组织中高表达,HDACs成为... 详细信息

组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase,HDACs)可催化水解底物ε-N-乙酰化赖氨酸残基脱除乙酰基,其底物包括组蛋白或非组蛋白的底物。该酶在表观遗传调控和多种细胞的调节过程中起关键作用,特别是该酶在许多肿瘤组织中高表达,HDACs成为癌症治疗领域的热门靶标。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitors,HDACi)可引起肿瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞和DNA损伤等作用,目前已有多个药物上市。当前在HDAC抑制剂的研发中,急需发展新型的高通量HDACs抑制剂筛选方法,以加快药物发现的速度。随着近十几年的发展,毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)已成功应用于多种药物靶标的活性筛选。该方法的主要优点包括测试模式多且效率高、分析时间短、酶和底物消耗量低以及能够实现自动化运行。除了传统的离线分析手段,该领域还发展了毛细管在线分析技术,包括电泳调控微分析法和固定化酶微反应器法。这两种常见的毛细管在线分析手段已被广泛应用于酶学研究。电泳调控微分析法(Electrophoretical mediated microanalysis,EMMA)是在毛细管内,同时进行酶促反应以及其底物和产物分离测试的在线分析方法。该方法将酶和底物依次进样至毛细管前端,并以此作为酶促反应发生场所。通过施加电压,促使酶和底物在管内充分混合反应;反应结束后,施加分离电压使产物和未反应底物在毛细管内分离并进行测定。毛细管电泳固定化酶微反应器(Capillary electrophoresis immobilized enzyme microreactor,CE-IMERs)是将毛细管电泳与固定化酶技术相结合的新型在线酶学测定方法。该方法通过一定的固定化方式将靶酶固定在毛细管的进样端,于是制备得到CE-IMERs,用于酶促反应动力学和酶抑制剂动力学在线研究。该法的优点在于试剂消耗量小、操作简便、可实现靶酶的重复使用,是新型的酶抑制剂高通量筛选方法。我们应用电泳调控微分析法,实现了 HDACs抑制剂的毛细管电泳在线筛选,为该类抗肿瘤药物的研发提供了新的筛选模型。本文对分离条件、混合条件等方面进行了优化,并对初步建立的方法进行了方法学验证,证明该方法稳定、高效、可重复。我们应用所建方法测定了 HDACs的动力学参数和3种经典HDACs抑制剂的表观抑制常数。本文建立的EMMA方法测定结果与经典荧光法及文献报道结果基本一致,说明该法结果准确、可靠。本文使用海藻酸钙包埋法制作了 HDACs毛细管电泳固定化酶微反应器,通过将含有HDACs的海藻酸钠溶胶灌注于毛细管一端,施加电压驱动缓冲液中钙离子通过溶胶区域与钠离子置换,在毛细管端口形成海藻酸钙凝胶,从而将HDACs包埋并固定在毛细管端口。经条件优化,初步建立的毛细管电泳固定化酶微反应器稳定性和批间重复性良好,所测定的HDACs酶促反应动力学结果和HDACs抑制剂动力学结果与文献报道基本一致。以上结果说明,本法制得的CE-IMERs具有测试简单高效、节约反应物料以及自动化程度高等优点,未来可能成为组蛋白去乙酰化酶抑制剂研发的有力武器。

关键词：组蛋白去乙酰化酶组蛋白去乙酰化酶抑制剂毛细管电泳电泳调控微分析法固定化酶微反应器

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